本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種基于時間分辨微球的肌紅蛋白檢測用試劑體系及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：時間分辨熒光生化分析技術(shù)是基于稀土熒光配合物特殊的熒光性質(zhì)而建立起來的，時間分辨熒光測定技術(shù)是利用稀土配合物具有長壽命熒光這一特點(diǎn)，在樣品被脈沖光激發(fā)后、熒光信號采集前，根據(jù)樣品中所包含的熒光物質(zhì)熒光壽命的不同引入一定的延遲時間(delaytime)，待短壽命的背景熒光完全淬滅后，再對長壽命的特異性熒光信號進(jìn)行測定，采用時間分辨熒光測定技術(shù)可以有效消除來自樣品、試劑、儀器等的短壽命非特異性熒光的干擾，從而極大地提高熒光檢測的靈敏度。肌紅蛋白(myo)是存在于肌肉組織中的一種亞鐵血紅素蛋白，當(dāng)肌肉細(xì)胞損傷后，由于分子量小，肌紅蛋白迅速釋放到血液中。在急性心肌損傷時，肌紅蛋白最先被釋放到血液中，在癥狀出現(xiàn)2-3小時后，血中myo可超出正常上限，9-12小時達(dá)到峰值，24-36小時后恢復(fù)。myo是目前心肌受損后最早發(fā)生異常的心血管標(biāo)志物，myo陽性雖不能確診急性心肌梗死(ami)，但可用于早期排除ami診斷的重要指標(biāo)，如myo陰性，則基本排除心肌梗死。多種肌病，例如急性肌損傷、肌營養(yǎng)不良、肌萎縮和多發(fā)性肌炎等疾病會導(dǎo)致血液中的肌紅蛋白含量升高。急慢性腎功能極度衰竭、嚴(yán)重充血性心力衰竭及長期休克也會導(dǎo)致肌紅蛋白升高。監(jiān)測肌紅蛋白含量對于多種疾病的診斷具有重要意義。通常使用化學(xué)發(fā)光法、乳膠比濁法、膠體金免疫層析法或者熒光免疫層析法測定肌紅蛋白，但是這些方法的操作復(fù)雜、穩(wěn)定性低、靈敏度低、容易出現(xiàn)假陰性和假陽性?？乖贵w的結(jié)合特異性不強(qiáng)，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性不高、精密度低，檢測范圍小。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，有必要針對肌紅蛋白檢測中存在的靈敏度低、精密度低、穩(wěn)定性低、操作復(fù)雜及檢測限過高等問題，提供一種基于時間分辨微球的肌紅蛋白檢測用試劑體系，以促進(jìn)抗原抗體結(jié)合的特異性，實(shí)現(xiàn)簡單快速檢測肌紅蛋白含量，同時具有高靈敏性、高穩(wěn)定性、精密度好，并且檢測限小，檢測范圍大，能夠檢測不同濃度的樣品。具體的技術(shù)方案如下：一種基于時間分辨微球的肌紅蛋白檢測用試劑體系，包括以下組分：于緩沖溶液中加入0.05-0.5wt％的標(biāo)記有肌紅蛋白抗體的時間分辨微球、0.1-0.5wt％的牛血清白蛋白、0.1-5wt％的聚乙烯吡咯烷酮、0.1-1wt％核糖體蛋白s7、0.01-0.5wt％吐溫-20。在其中一些實(shí)施例中，基于時間分辨微球的肌紅蛋白檢測用試劑體系包括以下組分：于緩沖溶液中加入0.15-0.25wt％的標(biāo)記有肌紅蛋白抗體的時間分辨微球、0.2-0.3wt％的牛血清白蛋白、0.5-1.5wt％的聚乙烯吡咯烷酮、0.4-0.6wt％核糖體蛋白s7、0.05-0.15wt％吐溫-20。在其中一些實(shí)施例中，基于時間分辨微球的肌紅蛋白檢測用試劑體系包括以下組分：于緩沖溶液中加入0.2wt％標(biāo)記有肌紅蛋白單克隆抗體的時間分辨微球、0.25wt％牛血清白蛋白、1wt％聚乙烯吡咯烷酮、0.5wt％核糖體蛋白s7、0.1wt％吐溫-20。在其中一些實(shí)施例中，牛血清白蛋白與核糖體蛋白s7的質(zhì)量比為1:2。在其中一些實(shí)施例中，所述肌紅蛋白抗體選自肌紅蛋白單克隆抗體、肌紅蛋白多克隆抗體中的一種或幾種。在其中一些實(shí)施例中，試劑體系ph值為7-8(優(yōu)選為7.4)。在其中一些實(shí)施例中，所述緩沖溶液為磷酸緩沖液或tris緩沖液。上述肌紅蛋白檢測用試劑體系具有以下有益效果：試劑體系與樣品混合即能反應(yīng)，操作簡單；在試劑體系的作用下，標(biāo)記抗體的時間分辨微球不會殘留在樣品墊上，也不會殘留在樣品墊和硝酸纖維素(nc)膜的結(jié)合處。試劑體系中的抗體與肌紅蛋白反應(yīng)的特異性高，靈敏度強(qiáng)，該檢測體系的穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高、精密度好，檢測范圍大。附圖說明圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。其中，橫坐標(biāo)為肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度(ng/ml)，縱坐標(biāo)為檢測到的熒光信號(t/c值)。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明所述基于時間分辨微球的肌紅蛋白檢測用試劑體系作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。本發(fā)明用到的試劑規(guī)格、儀器型號及廠家如下：磷酸緩沖液(pbs)，具體組成：nacl8.5g，nahpo42.2g，nah2po40.2g，h2o1000ml；牛血清白蛋白(bsa)，購自西寶生物科技股份有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，購自阿拉丁；核糖體蛋白s7，購自上海杰一生物技術(shù)有限公司；標(biāo)記有肌紅蛋白抗體的時間分辨微球，購自bangslab；肌紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海古朵生物科技有限公司；樣品來源廣東省順德區(qū)北滘醫(yī)院；熒光檢測儀microdetection南京微測生物科技有限公司。實(shí)施例1本實(shí)施例考察了三組含有標(biāo)記有肌紅蛋白單克隆抗體的時間分辨微球的溶液的穩(wěn)定性，具體而言，是通過檢測放置不同時間后的溶液熒光信號變化，確定溶液的穩(wěn)定性。各組溶液的組成如表1所示：表1按照表1中的組成配制好三組溶液，在溶液配制結(jié)束、放置1天、3天、5天及7天后檢測熒光信號，檢測結(jié)果如表2所示：表2由表2的檢測結(jié)果可以看到，溶液①在放置7天內(nèi)的t/c值變化率均超過10％；溶液②在放置3天和5天后的t/c值變化率小，放置5天后的變化率低至0.52％；溶液③放置3天后的t/c值變化率最小為1.52％，繼續(xù)放置后的t/c值變化率將超過22％，表明聚乙烯吡咯烷酮pvp有助于溶液的穩(wěn)定性。實(shí)施例2通過上述試驗(yàn)進(jìn)行，可知條件：bsa：0.25％、pvp：1％、s7：0.5％的結(jié)果穩(wěn)定性較好，下降幅度較小，后續(xù)經(jīng)過多次測試，能夠進(jìn)行重復(fù)。確定了肌紅蛋白檢測用試劑體系的組成為：10mmpbs中含有0.25wt％bsa、1wt％pvp、0.5wt％s7、0.1wt％tween-20及0.2wt％標(biāo)有肌紅蛋白的時間分辨微球。實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品測試將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為以下濃度，2000ng/ml，1000ng/ml，750ng/ml，500ng/ml，250ng/ml，100ng/ml，75ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml分別進(jìn)行熒光的檢測，得到對應(yīng)的熒光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)品濃度測試t/c值20003.5075610002.917027502.787455002.550582502.050471001.399803751.31654501.06481250.6325912.50.3394086.250.216751實(shí)施例4檢測限實(shí)驗(yàn)取樣標(biāo)本最低檢測值為21，本方法可以檢測更低的值。實(shí)施例5回收率實(shí)驗(yàn)(準(zhǔn)確度)選取多個值的不同樣本重復(fù)測試，結(jié)果如下：實(shí)施例6精密度實(shí)驗(yàn)取任意取三個不同濃度的樣本，同一樣本測試五次，觀察五次變化對比例1肌紅蛋白檢測用試劑體系的組成為：10mmpbs中含有1％pvp、0.5％s7、0.1％tween-20及0.2％標(biāo)有肌紅蛋白的時間分辨微球。對比例2肌紅蛋白檢測用試劑體系的組成為：10mmpbs中含有0.25％bsa、1％pvp、0.1％tween-20及0.2％標(biāo)有肌紅蛋白的時間分辨微球。每個平均值均為三次測量的平均值。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實(shí)施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁12