本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種細菌或真菌的活性快速檢測方法。

背景技術：

細菌和真菌廣泛存在于自然界和人體內，致病性細菌和真菌可嚴重危害生命體健康。據(jù)統(tǒng)計，全球約有三分之一的死亡與細菌感染性疾病相關。病原菌侵染機體引起病變，通常需要：①侵入并定植于機體；②在宿主體內增殖并向其它部位擴散；③逃避機體防御機制；④釋放毒素或引發(fā)超敏反應。其中有活性的病原菌侵入機體是細菌感染的第一步，是致病菌引起機體病變的首要條件，因此快速、準確、靈敏的細菌活性檢測方法對減少相關疾病發(fā)生，維護人類的健康至關重要。

細菌或真菌的活性檢測的傳統(tǒng)方法是分離和選擇性培養(yǎng)，有平板計數(shù)法、濾膜法、多管發(fā)酵法等，這些方法不需要大型儀器，可以檢測活細菌或真菌，其缺點是耗時長、效率低，不能滿足水質監(jiān)測、食品衛(wèi)生、臨床診斷所需的快速檢測的要求。常見細菌或真菌的活性快速檢測方法是基于pcr技術的研究。普通pcr難以區(qū)分活菌與死菌，但可通過核酸交聯(lián)劑透過細胞膜與死菌dna結合，抑制死菌dna擴增；或擴增僅存在于活菌中的mrna，達到檢測活菌的目的。但是由于pcr對很少的dna即可有很好的擴增效果，這種方法難以將死菌的dna或mrna完全去除，導致假陽性很高，無法滿足實際需要。因此，開發(fā)更快速且更準確的細菌活性檢測方法，在環(huán)境、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、食品等多個領域具有重要的用途。

為了開發(fā)快速準確的細菌或真菌的活性檢測方法，本發(fā)明利用分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers，mips)，目前，已有不少研究者對細菌或真菌的mips進行研究，在細菌mips中，部分研究者以細菌表面蛋白為模板制備mips，例如khan等人在單壁碳納米管上，以金黃色葡萄球菌外層有代表性的蛋白a為模板，通過循環(huán)伏安法使3-氨基酚發(fā)生電聚合制備mips，在有牛血清白蛋白干擾的情況下，mips對模板仍有良好的選擇性(khanmsr,moreiraftc,riujetal.plasticantibodyfortheelectrochemicaldetectionofbacterialsurfaceproteins.sensoractuatb-chem,2016,233:697-704.)。jiang等人在磁性納米顆粒表面，以革蘭陰性菌的信號分子ahls為模板，通過表面印跡制備了mips，可對細菌進行間接檢測(jiangh,jiangd,shaojetal.magneticmolecularlyimprintedpolymernanoparticlesbasedelectrochemicalsensorforthemeasurementofgram-negativebacterialquorumsignalingmolecules(n-acyl-homoserine-lactones).biosensbioelectron,2016,75:411-419.)。idil等人以整個大腸桿菌為模板，以n-甲基丙烯酰-l-組氨酸、2-甲基丙烯酸羥乙酯為功能單體，以乙二醇二甲基丙烯酸為交聯(lián)劑，用紫外光進行引發(fā)，制備大腸桿菌mips，可特異性吸附模板大腸桿菌。對大腸桿菌的檢出限為70cfu/ml，檢測范圍為1.0×10²-1.0×10⁷cfu/ml。該方法用于果汁和河水中加標大腸桿菌的檢測，回收率為81-97％(idiln,hedstromm,denizliaetal.wholecellbasedmicrocontactimprintedcapacitivebiosensorforthedetectionofescherichiacoli.biosensbioelectron,2017,87:807-815.)。roy等人以整個大腸桿菌為模板，以n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺為功能單體制備大腸桿菌mips。與亞鐵/鐵氰化物氧化還原探針連用，可實現(xiàn)對大腸桿菌的檢測，且與大腸桿菌在10-109cfu/ml范圍線性相關，檢出限為10cfu/ml。除了能檢測外，該材料還可從水樣中捕獲超過98％的大腸桿菌。最后該材料還可以通過光熱在5分鐘內殺死10⁵cfu/ml大腸桿菌(roye,patras,tiwariaetal.singlecellimprintingonthesurfaceofag-znobimetallicnanoparticlemodifiedgrapheneoxidesheetsfortargeteddetection,removalandphotothermalkillingofe.coli.biosensbioelectron,2017,89(pt1):620-626.)。以上研究均表明細菌mips可特異性結合并檢測靶細菌，但以上工作均未研究mips是否可以測定細菌或真菌活性，而且上述檢測細菌或真菌的mips的操作較為復雜。

技術實現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本發(fā)明的目的是提供一種細菌或真菌的活性快速檢測方法，能快速準確地檢測出細菌或真菌樣品中細菌或真菌的活性。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：

細菌或真菌的活性快速檢測方法，包括以下步驟：

1)制備靶細胞的熒光分子印跡聚合物：

首先稱取多巴胺和丹磺酰多巴胺，配制多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液；然后將多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液、靶細胞和載體混合均勻，以靶細胞為模板、丹磺酰多巴胺為熒光功能單體、多巴胺為功能單體，在載體表面進行聚合反應得到靶細胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體；最后利用洗脫劑將靶細胞從靶細胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體上洗脫下來，得到靶細胞的熒光分子印跡聚合物；

2)檢測細菌活性：

向熒光分子印跡聚合物中加入細菌或真菌樣品后即刻測定熒光值為i0，待細菌或真菌樣品中的細菌或真菌與熒光分子印跡聚合物結合完全后，測定熒光值為i，i0/i-1表示熒光變化水平，通過熒光變化水平確定樣品中是否含有靶細菌或靶真菌以及該靶細菌或靶真菌的含量。

作為優(yōu)選方案，所述步驟1)中載體為經(jīng)聚多巴胺修飾后得到的多巴胺-載體復合體，所述多巴胺-載體復合體是通過將多巴胺和載體材料混合，并在過硫酸銨催化作用下，多巴胺在載體材料表面發(fā)生自聚合反應而制得。

作為優(yōu)選方案，所述載體材料為納米微球、微米微球或多孔板。

作為優(yōu)選方案，所述靶細胞為靶細菌或靶真菌，所述靶細菌為革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌，所述靶細菌的濃度為10⁴～10⁶cfu/ml。

作為優(yōu)選方案，所述革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌，所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌或蠟樣芽孢桿菌；所述靶真菌為酵母菌。

作為優(yōu)選方案，所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中包括多巴胺、丹磺酰多巴胺和催化劑。

作為優(yōu)選方案，所述催化劑為過硫酸銨。

作為優(yōu)選方案，所述多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液中多巴胺、丹磺酰多巴胺、過硫酸銨的摩爾比為4:1:1。

作為優(yōu)選方案，所述洗脫劑為去離子水。

本發(fā)明制得的熒光分子印跡聚合物在檢測水樣中細菌活性及其含量的應用。具體方法為，將以熒光分子印跡聚合物為敏感膜制成熒光分子印跡聚合物傳感器(fmips傳感器)，將fmips傳感器投置于待檢測的水樣中，通過fmips傳感器的熒光值變化得出水樣中的靶細菌和靶真菌的含量。

本發(fā)明的細菌或真菌的活性快速檢測方法的原理是：

分子印跡聚合物(molecularlyimprintedpolymers，mips)是化學合成的高分子聚合物，通過特定的空間結構和化學鍵(包括共價鍵、離子鍵、氫鍵等)特異性識別和結合靶分子，其吸附特異性與天然抗體類似，但耐受有機溶劑、離子、酸堿、高溫和高壓。其中含熒光的mips，又稱熒光分子印跡聚合物(fluorescentmolecularlyimprintedpolymers,fmips)，不僅可以特異性結合模板分子，同時模板分子的結合還可以導致熒光mip發(fā)生熒光信號的改變(如熒光波長改變，或者熒光強度改變)，根據(jù)熒光信號的改變，即可測定與fmips特異性結合的模板分子的含量。

結合圖1所示，本發(fā)明以靶細胞為模板、丹磺酰多巴胺作為熒光功能單體，多巴胺作為功能單體，在載體表面制備靶細胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體，然后再從復合體上將靶細胞洗脫，即得到可特異性吸附靶細胞的熒光分子印跡聚合物(fmips)。

當細菌樣品中活靶細胞與fmips結合時，可導致fmips的熒光減弱，通過比較加樣前后的熒光改變，即可快速測定樣品中是否存在活細菌，并初步確定活細菌的含量。

本發(fā)明中采用的丹磺酰多巴胺的制備方法參閱中國發(fā)明專利(授權公告號cn103992252b授權公告日2016.06.22)公開的一種多巴胺衍生物及分子印跡聚合物制備方法和應用。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1，本發(fā)明通過使用丹磺酰多巴胺和多巴胺在載體表面進行聚合反應制備得到靶細胞的fmips，由于丹磺酰多巴胺和多巴胺在水相條件下即可進行聚合反應，在水相條件下保證了靶細胞的結構穩(wěn)定性，而且聚多巴胺可為細菌印跡提供豐富的羥基，提高了fmips的印跡效果。

2，靶細胞的fmips對靶細胞具有特異性識別能力。fmips集特異性吸附和熒光檢測于一體，不僅可以特異性吸附靶細胞，還可以根據(jù)熒光的改變，直接快速測定其結合的靶細胞含量。

3，利用靶細胞的fmips還可有效地區(qū)分活細菌和死細菌，可直接測定水中的靶細胞，并且耐受水中其他細菌、死的同類細菌、離子、有機物的干擾，適用于多種環(huán)境條件。

附圖說明

圖1為本發(fā)明細菌或真菌的活性快速檢測方法的流程圖；

圖2a為使用經(jīng)聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復合體和不使用聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復合體，所制備的fmips吸附靶細菌前后的熒光變化水平圖；

圖2b為多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液的過硫酸銨、多巴胺和丹磺酰多巴胺配比優(yōu)化圖；

圖2c為使用不同洗脫劑所制備的fmips吸附靶細菌后的熒光變化水平圖；

圖2d為使用不同的靶細菌濃度制備的fmips吸附靶細菌后的熒光變化水平圖；

圖3a為實施例1制得的e.coli-fmips-ⅰ的電鏡掃描圖；

圖3b為對比例1制得的fnip的電鏡掃描圖；

圖3c為fmips膜的厚度的測量；

圖3d為聚多巴胺修飾多孔板得到的多巴胺-載體復合體上的單層多巴胺膜(pda)厚度的測量；

圖3e為單層多巴胺膜(pda)、e.coli-fmips-ⅰ和fnip膜的熱重曲線；

圖4a為e.coli-fmips-ⅰ對e.coli285的吸附等溫曲線圖；

圖4b為e.coli-fmips-ⅰ吸附動力學曲線；

圖4c為e.coli-fmips-ⅰ吸附e.coli285時熒光隨時間變化趨勢線圖；

圖5a為e.coli285-fmip吸附不同大腸桿菌后的熒光變化水平；

圖5b為e.coli285-fmips吸附不同的細菌和真菌后的熒光變化水平；

圖5c為以不同種的大腸桿菌為模板制備的各種fmips，結合不同大腸桿菌后的熒光變化值；

圖5d為分別以不同的細菌和真菌為模板所制備的fmips，吸附不同靶細菌和靶真菌后的熒光變化水平；

圖6a為e.coli285-fmip對活菌、高壓滅活菌、酒精滅活菌的熒光響應；

圖6b為e.coli285-fmips分別吸附不同起始滴度(約50～3000cfu/ml)的e.coli285菌液的熒光變化標準曲線；

圖6c為e.coli285-fmips分別吸附不同起始滴度(約50～3000cfu/ml)的滅活e.coli285菌液的熒光變化標準曲線；

圖中各部件標號如下：靶細胞(大腸桿菌)1、多巴胺2、丹磺酰多巴胺3、96孔酶標板4、靶細胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體5、大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物6、加入大腸桿菌后的熒光分子印跡聚合物7；其中，熒光值的大小為6>7。

具體實施方式

為解決現(xiàn)有技術中存在耗時長、效率低，無法準確地檢測細菌活性的問題，本發(fā)明提供一種細菌或真菌的活性快速檢測方法，本方法從制備靶細胞的熒光分子印跡聚合物為設計思路的出發(fā)，通過以靶細胞為模板、丹磺酰多巴胺作為熒光功能單體，多巴胺作為功能單體，在載體表面發(fā)生聚合反應，制備靶細胞-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體材料復合體，再從復合體上將靶細胞洗脫，得到可特異性吸附靶細胞的熒光分子印跡聚合物(fmips)來達到上述設計目的。以下通過具體的實施例來對本發(fā)明的病毒活性快速檢測方法進行詳細地說明。

實施例1制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ

制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ的方法，包括步驟：

1)試劑的配制：

多巴胺溶液?。哼^硫酸銨與多巴胺以2:1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

多巴胺溶液ⅱ：多巴胺溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液：多巴胺：丹磺酰多巴胺：過硫酸銨摩爾比＝4：1：1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

載體材料：以96孔酶標板作為載體材料；

靶細胞：10⁴～10⁶cfu/ml的大腸桿菌菌液，大腸桿菌采用e.coli285；

洗脫液：去離子水；

2)多巴胺-載體復合體的制備(聚多巴胺修飾載體材料)：

向在96孔酶標板中的每孔加300μl多巴胺溶液ⅰ，置于37℃的空氣中96孔酶標板與多巴胺發(fā)生自聚合反應，反應24h后將孔中多巴胺溶液倒去，得到多巴胺-載體復合體；

3)大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體的制備：

向多巴胺-載體復合體中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和靶細胞(大腸桿菌)，置于搖床中(溫度為37℃，轉速為150rpm)緩慢振搖72h后倒去孔中的液體，即得大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體；

4)洗脫靶細胞：

用去離子水反復洗滌大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體，將大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體中的大腸桿菌洗脫下來，每次洗滌30min，共洗滌6次，得到大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ，大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅰ以下均采用簡稱e.coli-fmips-ⅰ。

實施例2制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅱ

實施例2的制備方法與是實施例相比，區(qū)別在于：實施例2不進行實施例1中的步驟2)，即實施例2不采用經(jīng)聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復合體作為載體，而是直接將多巴胺，丹磺酰多巴胺，大腸桿菌在載體材料上聚合。具體過程如下：

1)大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體的制備：向96孔酶標板中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和靶細胞(大腸桿菌)，置于搖床中(溫度為37℃，轉速為150rpm)緩慢振搖72h后倒去孔中的液體，即得大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體；；

2)洗脫靶細胞：用洗脫劑反復洗滌大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體，將大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體中的大腸桿菌洗脫下來，每次洗滌30min，共洗滌6次，得到大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅱ。

實施例3制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅲ

大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅲ的制備方法與實施例1相同，不同之處在于：本實施例將實施例1步驟2)中的多巴胺溶液ⅰ改為多巴胺溶液ⅱ，多巴胺溶液ⅰ與多巴胺溶液ⅱ的區(qū)別在于過硫酸銨的是否添加。本實施例制備的大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅲ的方法在此不再贅述。

實施例4制備蠟樣芽孢桿菌的熒光分子印跡聚合物

蠟樣芽孢桿菌的熒光分子印跡聚合物的制備方法與實施例1相同，不同之處在于：本實施例將實施例1步驟3)中的靶細胞改為蠟樣芽孢桿菌，本實施例制得的蠟樣芽孢桿菌的熒光分子印跡聚合物以下均采用簡稱蠟樣芽孢桿菌-fmips。

實施例5制備金黃色葡萄球菌的熒光分子印跡聚合物

金黃色葡萄球菌的熒光分子印跡聚合物的制備方法與實施例1相同，不同之處在于：本實施例將實施例1步驟3)中的靶細胞改為金黃色葡萄球菌，本實施例制得的金黃色葡萄球菌的熒光分子印跡聚合物以下均采用簡稱金黃色葡萄球菌-fmips。

實施例6制備酵母菌的熒光分子印跡聚合物

酵母菌的熒光分子印跡聚合物的制備方法與實施例1相同，不同之處在于：本實施例將實施例1步驟3)中的靶細胞改為酵母菌，本實施例制得的酵母菌的熒光分子印跡聚合物以下均采用簡稱酵母菌-fmips。

實施例7制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅳ

1)試劑的配制：

多巴胺溶液ⅰ：過硫酸銨與多巴胺以2:1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液：多巴胺：丹磺酰多巴胺：過硫酸銨摩爾比＝4：1：1的摩爾比溶于10mmol/ltris-hcl緩沖溶液(tris-hcl緩沖溶液ph＝8)；

載體材料：以150mg/ml硅膠微球為載體材料；

靶細胞：10⁴～10⁶cfu/ml的大腸桿菌菌液，大腸桿菌采用e.coli285；

洗脫液：去離子水

2)多巴胺-載體復合體的制備：

將150mg/ml硅膠微球與多巴胺溶液ⅰ在37℃攪拌混合10小時，硅膠微球與多巴胺發(fā)生自聚合反應，10小時后取出硅膠微球，得到多巴胺-載體復合體；

3)大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體的制備：

向多巴胺-載體復合體中加入多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液和靶細胞(大腸桿菌e.coli285)，置于搖床中(溫度為37℃，轉速為150rpm)緩慢攪拌10小時后取出硅膠微球，即得大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體；

4)洗脫靶細胞：

用洗脫劑反復洗滌大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體，將大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體中的大腸桿菌洗脫下來，每次洗滌30min，共洗滌6次，得到大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅳ。

實施例8制備大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅴ

大腸桿菌的熒光分子印跡聚合物ⅴ制備方法與實施例7相同，不同之處在于：本實施例將實施例5中的硅膠微球載體改為1mg/ml四氧化三鐵納米微球。

實施例9空白印跡聚合物(nip)的制備

分別制備實施例1～8的對比例，分別為對比例1、對比例2、對比例3、對比例4、對比例5、對比例6、對比例7和對比例8。對比例1、對比例2、對比例3、對比例4、對比例5和對比例6、對比例7和對比例8與對應的實施例的制備方法相同，區(qū)別在于：不添加靶細胞。以對比例1為例，其他在此不在贅述。

對比例1的制備方法與實施例1的制備方法相同，區(qū)別在于：步驟3)中不添加靶細胞(大腸桿菌)。對比例1～8制得的空白印跡聚合物以下以及說明說附圖中均使用簡稱fnip。

實施例10反應參數(shù)的優(yōu)化試驗

向實施例1～8中制備的細菌或真菌的熒光分子印跡聚合物(fmips)以及各實施例對應的空白印跡聚合物(fnips)中，分別加入300μlpbs緩沖溶液，測其熒光值作為i0，倒掉pbs緩沖溶液后，加入模板菌液或細胞液300μl后測其熒光值，作為i，用i0/i-1表示熒光變化程度。每個濃度平行測定3次取平均值，結果分別見圖2a、圖2b、圖2c、圖2d。以下分別對圖2a、圖2b、圖2c和圖2d作詳細的說明。

圖2a為實施例1和實施例2的熒光變化水平對比圖，即使用聚多巴胺修飾的載體材料和不使用聚多巴胺的載體材料所制備的fmips吸附靶細胞前后的熒光變化水平圖；實施例1中使用載體為聚多巴胺修飾的多巴胺-載體復合體，實施例2未對載體進行修飾；分別測定fmips吸附靶細胞前后的熒光變化水平。由圖2a可見，修飾在載體上的聚多巴胺膜(pda)的孔上再合成mips，熒光變化效果優(yōu)于未修飾聚多巴胺膜的。其原理是：聚多巴胺膜能提供大量的氨基和兒茶酚基，可與細菌壁外層的功能基團發(fā)生作用，增加了與細菌的結合能力，從而使熒光變化明顯。

圖2b為多巴胺/丹磺酰多巴胺混合溶液的過硫酸銨、多巴胺和丹磺酰多巴胺配比優(yōu)化圖；通過測定過硫酸銨、多巴胺和丹磺酰多巴胺，在不同的摩爾比之下制備的fmip和fnip吸附靶細菌前后的熒光變化水平，選擇最佳的配比。圖2b可以看出，使用了過硫酸銨的mip熒光變化量提高了兩倍以上，可知催化劑過硫酸銨的使用是成功制備抗病毒mip的前提。多巴胺：丹磺酰多巴胺與過硫酸銨的比例選為4:1:1時，fmip的熒光變化量最大，表明該條件下所制備的fmips吸附性能最佳。

圖2c為使用不同洗脫液，所制備的fmips吸附靶細胞后的熒光變化水平圖；由圖2c可以看出，以去離子水為洗脫液的效果明顯優(yōu)于3％乙酸與1mol/lnacl的混合液。其原理是在低滲環(huán)境中，細菌可因吸水過度而膨脹死亡。本實驗中以去離子水為洗脫液，提供低滲環(huán)境，可使大腸桿菌發(fā)生死亡而洗脫下來。

圖2d為使用不同的靶細胞濃度時，所制備的fmips吸附靶細胞后的熒光變化水平圖；由圖2d可以看出，當e.coli285菌懸液濃度為10⁵cfu/ml時，熒光變化最為明顯，在小于10⁵cfu/ml時，隨著模板滴度增加，能與模板結合的功能單體數(shù)量也增加，致使結合位點數(shù)量增加，熒光變化增加。

實施例11理化性質分析試驗

圖3a為實施例1制得的e.coli-fmips-ⅰ的電鏡掃描圖；

圖3b為對比例1制得的fnip的電鏡掃描圖；

由圖3a和圖3b可看出，e.coli-fmips-ⅰ與fnip均為膜狀物，圖3a可見，大腸桿菌-丹磺酰多巴胺/多巴胺-載體復合體在洗脫完靶細胞后存在形態(tài)、大小不一的孔穴，這些孔穴為大腸桿菌去除后留下的三維孔穴結構，形狀有圓形、橢圓形，為大腸桿菌的橫斷面、不同側面留下的印跡?？籽ㄖ睆綖?.8～1.7μm，這與大腸桿菌的大小一致。圖3b的fnips膜并沒有看出明顯的孔穴。

在以硅膠微球為載體材料，制備多巴胺-載體復合體，對多巴胺-載體復合體上的單層聚多巴胺膜(pda)、大腸桿菌285-fmips和fnips膜用元素分析儀對n、c、h元素含量進行分析，結果見表1。從表1可以看出，fmips、fnips膜中n、c元素含量相比單層pda膜明顯增加，說明成功地在pda單層膜上制備了含更多n元素的丹磺酰多巴胺和多巴胺的fmips、fnips。

表1elementcompositionofpda,fmips,fnipsmembrane

圖3c為fmips膜的厚度的測量；

圖3d為修飾在載體上的單層多巴胺膜(pda)厚度的測量；

由圖3c和圖3d可以看出，fmips膜的厚度并不均一，范圍從16.0～48.0μm，而且明顯厚于單層多巴胺膜(約為2.8μm)。

圖3e為單層多巴胺膜(pda)、e.coli-fmips-ⅰ和fnip膜的熱重曲線；不同物質會隨著溫度不斷升高而發(fā)生分解，導致重量下降，通過熱重分析可判斷形成的薄膜量。多巴胺在248℃開始分解，而交聯(lián)后形成的聚多巴胺比較耐熱，在400℃開始分解。從圖3e中可以看出，從425℃開始三條線的重量有明顯的下降，該溫度正是聚多巴胺開始分解的溫度，說明三種膜均有聚多巴胺。至700℃單層pda膜失重約0.4％，fmip膜約失重2％，fnip膜約失重1.3％，說明fmip和fnip膜明顯厚于單層pda膜，成功在單層pda膜上制備了fmip。

實施例12e.coli-fmips-ⅰ對e.coli285的吸附特性

如圖4a，e.coli-fmips-ⅰ對e.coli285的吸附等溫曲線圖；配制不同濃度的e.coli285菌懸液，分別加入到e.coli-fmips-ⅰ和對應的fnip中，吸附平衡后，用平板涂布法測定上清液中細菌的滴度。以吸附量adsorption(cfu/cm²)為縱坐標，菌液起始滴度c0(cfu/ml)為橫坐標，繪制吸附等溫線。從圖4a可見當起始菌液滴度小于800cfu/ml時，吸附容量隨著菌液的濃度增加而增加，大于800cfu/ml時，曲線趨于平緩，說明此時fmip上的識別位點均已與大腸桿菌模板結合，達到吸附飽和狀態(tài)。

圖4b為e.coli-fmips-ⅰ吸附動力學曲線；將100cfu/ml的e.coli285加入到fmip和fnip中，分別在0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h時間點用平板涂布法測上清菌液滴度，同時測其熒光變化。以吸附量adsorption(cfu/cm2)為縱坐標，時間(h)為橫坐標，繪制吸附動力學曲線；圖4b顯示，出在前1個小時，隨時間增加，吸附量明顯增加，吸附速率較快，吸附在1h后達到平衡。

圖4c為e.coli-fmips-ⅰ吸附e.coli285時熒光隨時間變化趨勢線圖；將100cfu/ml的e.coli285加入到fmip和fnip中，分別在0.5h、1h、2h、3h、6h、9h、12h時間點測定fmips和fnips的熒光；圖4c顯示，fmips和fnips的熒光，與吸附率對應，均在吸附1h后達到平衡。顯示熒光變化量可以準確反映靶細胞的吸附率。

實施例13靶細胞fmips的吸附特異性

在大腸桿菌285(e.coli285)為模板所制備的fmips中，分別加入e.coli285，e.colitg1，e.colibl21，吸附2h后測定熒光變化量，圖5a顯示，e.coli285-fmips對其它大腸桿菌菌株也有一定的熒光響應，但對e.coli285的響應要略優(yōu)于其它菌株。不同大腸桿菌菌株可能存在血清型、基因型的差別，但其整體形態(tài)、結構、大小差別不大，因此e.coli285-fmips對其它大腸桿菌菌株的響應與e.coli285差別不大。

在e.coli285為模板所制備的fmips中，分別加入e.coli285,金黃色葡萄球菌(s.aureus)、蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)和釀酒酵母菌(saccharomycetes)，圖5bfmips對e.coli285的結合量最大，金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌和真菌能引起e.coli285-fmips一定的熒光變化，但變化程度沒有e.coli285大。金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌屬于革蘭陽性菌，其最外層的磷壁酸，酵母菌最外層的甘露聚糖，都有羥基可與多巴胺和丹磺酰多巴胺上的氨基反應，因此會引起e.coli285-fmips的熒光發(fā)生一定的變化。但熒光變化水平與e.coli285比較，有明顯差異，表面fmips可以區(qū)分屬不同的微生物。

分別以大腸桿菌的tg1和bl21、用同樣的方法制備fmips，比較各種大腸桿菌fmips對目標菌和其它菌的選擇性。從圖4c可以看出e.colitg1-fmips和e.colibl21-fmips對目標菌和其它大腸桿菌都有一定的吸附，該結果與e.coli285-fmips一致，說明該mips的制備方法可用于大腸桿菌種這一類細菌的檢測。

分別以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、釀酒酵母菌為模板，比較各種不同的微生物fmips對不同微生物的識別能力。從圖5d可以看出大腸桿菌fmips、金黃色葡萄球菌fmips、蠟樣芽孢桿菌fmips、釀酒酵母菌fmips，均對模板微生物有較好的響應，而對其它微生物的相應較弱。這主要是因為細菌及真菌因為形狀、大小和外層結構不同，對不同的fmips的識別能力有明顯區(qū)別。表明fmips具有屬特異性識別能力。

實施例14fmip檢測細菌活性(以大腸桿菌為例)

為評價大腸桿菌285-fmips在檢測過程中是否能區(qū)分活菌與死菌，分別在fmips、fnips中加入大腸桿菌285活菌、高壓滅活菌、酒精滅活菌，待吸附平衡后，測定熒光變化i0/i-1。圖6a顯示fmips可以特異性識別活菌，對不同方法滅活的靶細菌均可以有效識別。

用大腸桿菌285-fmips分別吸附不同起始滴度(約50～3000cfu/ml)的大腸桿菌285菌液，待吸附平衡后，測其熒光變化i0/i-1，以熒光變化i0/i-1為縱坐標，菌液起始滴度c0為橫坐標繪制標準曲線。圖6b可以看出在45～840cfu/ml的范圍內，熒光變化隨菌液滴度的增加而增加，線性方程為y＝0.0005x+0.2891，r2＝0.8973，其lod為15cfu/ml。

用大腸桿菌285-fmips分別吸附不同起始滴度(約50～3000cfu/ml)的滅活大腸桿菌285菌液，待吸附平衡后，測其熒光變化i0/i-1，以熒光變化i0/i-1為縱坐標，菌液起始滴度c0為橫坐標繪制標準曲線。圖6c可以看出該散點圖沒有明顯的線性規(guī)律，fmips僅對活菌具有線性，對滅活菌的檢測無線性。該方法可進行細菌活性檢測。

將自來水高壓滅菌后加入不同濃度的活菌，同時加入高壓滅活菌為干擾，用fmips進行吸附后，根據(jù)標準曲線計算出目標菌液滴度，結果如表2。經(jīng)t檢驗fmips傳感器測得細菌含量與平板涂布法之間的差異沒有統(tǒng)計學意義，尚不能認為fmips傳感器檢測大腸桿菌的結果與平板涂布法有差異，亦可證明滅活菌對于活菌的檢測幾乎沒有干擾。加標回收率為93.50％～102.20％。fmips可用于實際樣品中細菌活性檢測，不受樣品中所存在的滅活細菌的影響。

表2實際水樣檢測結果

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。