本發(fā)明涉及一種基于稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光法的抗繆勒氏管激素(amh)的定量檢測(cè)試劑及試劑盒的制備方法，屬生物技術(shù)和醫(yī)療器械的產(chǎn)品
技術(shù)領(lǐng)域：
，主要用于對(duì)女性卵巢儲(chǔ)備功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
背景技術(shù)：
：抗繆勒氏管激素(anti-mullerianhormone，amh)1947年首先發(fā)現(xiàn)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的成員之一，由兩個(gè)相同的70kd亞基通過二硫鍵連接組成的二聚糖蛋白，相對(duì)分子為140kd；人類amh編碼基因位于19號(hào)染色體短臂，大小2.4-2.8kb，含有5個(gè)外顯子。amh是評(píng)價(jià)卵巢儲(chǔ)備功能的良好指標(biāo)，且不受月經(jīng)周期影響，隨時(shí)可檢測(cè)，血液中amh含量可為多囊卵巢綜合癥(pcos)的診斷提供新的參考指標(biāo)；對(duì)卵巢早衰，卵巢顆粒細(xì)胞瘤，兒童性別發(fā)育異常的診斷有重要的意義；血液中amh含量在輔助生殖技術(shù)(art)前能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)卵巢反應(yīng)，并制定個(gè)體化刺激方案，一定程度提高妊娠率，降低并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)；可預(yù)測(cè)絕經(jīng)年齡；此外，amh在性腺器官發(fā)育過程中起著重要作用，是男女性腺功能的重要標(biāo)記物之一。在歐美國(guó)家，血液amh濃度水平已成為評(píng)估女性的卵巢功能的主要常規(guī)指標(biāo)，常用的檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫法和電化學(xué)發(fā)光法；國(guó)內(nèi)主要amh檢測(cè)主要是引入進(jìn)口的電化學(xué)法發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法和膠體金法；電化學(xué)法發(fā)光法主要是roche的amh電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)系統(tǒng)，酶聯(lián)免疫法和膠體金法主要如專利“人抗苗勒激素的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑，cn104865391b”和“人抗苗勒氏管激素膠體金免疫層析檢測(cè)試劑盒及方法，cn105527447a”分別公開的內(nèi)容，但電化學(xué)發(fā)光法為非開放系統(tǒng)，價(jià)格昂貴，且需要專門培訓(xùn)儀器使用人員，維修及檢測(cè)成本均高，不適于大范圍推廣使用；酶聯(lián)免疫法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、背景值高、易造成假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果；膠體金法檢測(cè)速度快，適合poct快速檢測(cè)，但靈敏度低、背景值高、易造成假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，定量檢測(cè)依靠色度或灰度比對(duì)，多為半定量檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果不能準(zhǔn)確定量。經(jīng)我們前期研究證實(shí)，稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒(ucp顆粒)的新型標(biāo)記物具有獨(dú)特光學(xué)特性：高靈敏度，零背景干擾，高穩(wěn)定性，高安全性等特點(diǎn)，使ucp顆粒作為生物標(biāo)記物有著極為廣泛的應(yīng)用前景，在poct快速領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和很高的應(yīng)用價(jià)值。因此，研制一種基于稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光法的抗繆勒氏管激素(amh)的定量檢測(cè)試劑及試劑盒，并應(yīng)用于amh的臨床poct快速檢測(cè)領(lǐng)域，具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種基于稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光法的抗繆勒氏管激素(amh)的定量檢測(cè)試劑及其試劑盒的制備和應(yīng)用方法，該試劑盒具有準(zhǔn)確定量、零背景干擾，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，檢測(cè)快速的特點(diǎn)。具體地，本發(fā)明提供一種基于稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光法的抗繆勒氏管激素(amh)的定量檢測(cè)試劑，其特征在于amh定量檢測(cè)試劑包括：樣品墊、試劑墊、疏水性保護(hù)膜、分析膜、吸水墊、粘性低襯、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置和固定卡殼，其中疏水性保護(hù)膜能使加入的樣品全部有效的通過試劑墊，并與試劑墊中的抗amh抗體標(biāo)記的ucp顆粒充分反應(yīng)，提高靈敏度，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置存儲(chǔ)有檢測(cè)試劑的基本信息和定量檢測(cè)的數(shù)據(jù)參數(shù)模型，可通過適配的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀直接讀取試劑信息和定量檢測(cè)的數(shù)據(jù)參數(shù)模型，代替使用外部標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行精確定量，并能有效降低不同批次試劑信息的錄入錯(cuò)誤率。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑墊中含有抗amh抗體標(biāo)記的ucp顆粒，分析膜中含有抗amh抗體包被的檢測(cè)線t線和羊抗鼠igg包被的質(zhì)控線c線；標(biāo)記用的抗amh抗體和包被用的抗amh抗體具有不同的抗原表位，可特異性的血液樣本中的抗繆勒氏管激素形成夾心復(fù)合物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述免疫層析試紙條的分析膜為硝酸纖維素膜，分析膜上的檢測(cè)線t線位于樣品墊的一端，質(zhì)控線c線位于吸水墊的一端。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品墊、試劑墊、疏水性保護(hù)膜、分析膜、吸水墊、粘性低襯共同組成amh定量檢測(cè)試劑條，其中樣品墊、試劑墊、分析膜和吸水墊均在粘性低襯依次排列，其中樣品墊和試劑墊部分重疊，試劑墊和分析膜部分重疊，分析膜和吸水墊部分重疊，疏水性保護(hù)膜位于試劑墊的上方，前段與樣品墊部分重疊，尾端與分析膜前端部分重疊，疏水性保護(hù)膜能使加入的樣品全部有效的通過試劑墊，并與試劑墊中的抗amh抗體標(biāo)記的ucp顆粒充分反應(yīng)，提高靈敏度。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置是數(shù)據(jù)芯片，或數(shù)據(jù)條形碼，或具有相同功能的其他數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置，其中所述數(shù)據(jù)芯片位于所述固定卡殼的內(nèi)部，所述數(shù)據(jù)條形碼位于所述固定卡殼的外部。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，amh定量檢測(cè)試劑條、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置和固定卡殼共同組成amh定量檢測(cè)試劑，其中固定卡殼上包括加樣孔、結(jié)果判讀窗口和終點(diǎn)指示窗口，加樣孔對(duì)應(yīng)于amh定量檢測(cè)試劑條上的樣品墊，結(jié)果判讀窗口對(duì)應(yīng)于分析膜上的檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，終點(diǎn)指示窗口對(duì)應(yīng)于吸水墊上的終點(diǎn)指示帶。本發(fā)明還提供一種基于稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光法的抗繆勒氏管激素(amh)的定量檢測(cè)試劑盒，主要包括上述amh定量檢測(cè)試劑。本發(fā)明克服了以往抗繆勒氏管激素檢測(cè)試劑的非開放系統(tǒng)，價(jià)格昂貴，不能精確定量等缺點(diǎn)，提供一種基于稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光法的抗繆勒氏管激素(amh)的定量檢測(cè)試劑盒，可對(duì)amh進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、定量的檢測(cè)并能應(yīng)用于臨床poct快速檢測(cè)的普及。附圖說明圖1為本發(fā)明某一實(shí)施方案(方案1)的基于稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光法的抗繆勒氏管激素(amh)的定量檢測(cè)試劑條的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明某一實(shí)施方案(方案1)的基于稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光法的抗繆勒氏管激素(amh)的定量檢測(cè)試劑的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為本發(fā)明某一實(shí)施方案(方案2)的基于稀土納米上轉(zhuǎn)發(fā)光法的抗繆勒氏管激素(amh)的定量檢測(cè)試劑的剖面結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為amh線性檢測(cè)結(jié)果分析圖。圖5為本發(fā)明amh-upt試劑盒和羅氏amh電化學(xué)發(fā)光試劑的性能對(duì)比結(jié)果。附圖標(biāo)記說明1為樣品墊、2為試劑墊、3為抗amh抗體-ucp結(jié)合物、4為疏水性保護(hù)膜、5分析膜、6為粘性低襯、7為檢測(cè)帶t線、8為質(zhì)控帶c線、9為吸水墊、10為數(shù)據(jù)存儲(chǔ)裝置、11和12為固定卡殼、13為加樣孔、14為結(jié)果判讀窗口、15為終點(diǎn)指示窗口、16參數(shù)條形碼。具體實(shí)施方式下面用實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的具體改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1：amh上轉(zhuǎn)發(fā)光試劑盒生產(chǎn)的工藝如下：(1)包被：將amh單抗(來(lái)自廈門大學(xué))稀釋到1.5mg/ml，作為t線包被液，將羊抗鼠igg(購(gòu)買自北京索萊寶生物科技有限公司)稀釋到2mg/ml，作為c線包被液；通過噴膜機(jī)，將t線包被液和c線包被液包被到硝酸纖維素膜上；晾干，獲得單克隆抗體包被膜條，即分析膜。(2)ucp標(biāo)記單抗：本試劑盒中的ucp標(biāo)記單克隆抗體主要是用以下步驟獲得，詳情如下：a)稱取10mgucp顆粒置于錐形瓶中；b)加入10mlph＝7.2的0.20mpb溶液；c)ucp顆粒懸濁液中加入0.5mg抗amh抗體，再加入無(wú)水戊二醛至終濃度0.1％，攪拌過夜；d)12000rpm，4℃，離心15min，棄上清；e)ucp沉淀物中加入10mlph＝7.20.20mpb，吹打混勻；f)12000rpm，4℃，離心15min，棄上清；g)ucp標(biāo)記沉淀物收集待用；(3)凍干試劑墊的制備：a)將50mgucp顆粒制備的ucp標(biāo)記沉淀物重懸，混勻，12000rpm，4℃，離心30min，棄上清；b)加入45ml的凍干液(ph＝7.20.20mpb，含2％bsa，3％蔗糖)；d)將ucp標(biāo)記物懸濁液按5cm2/ml加于玻璃纖維上；e)真空凍干11h，即得凍干的試劑墊；(4)裁剪試劑墊：將凍干的試劑墊裁剪成1cm寬的長(zhǎng)條。(5)組裝試紙條；依次將分析膜、吸水墊、試劑墊和樣品墊貼到粘性低襯上，并將疏水性保護(hù)膜貼在樣品墊、分析膜和試劑墊的上方，黏貼方式為樣品墊、試劑墊、分析膜和吸水墊均在粘性低襯依次排列，其中樣品墊和試劑墊部分重疊，試劑墊和分析膜部分重疊，分析膜和吸水墊部分重疊，疏水性保護(hù)膜位于試劑墊的上方，前段與樣品墊部分重疊，尾端與分析膜前端部分重疊，然后切成4.0mm寬的紙條，即為amh定量檢測(cè)試劑條。(6)裝塑料卡；將4.0mm寬的試紙條裝到塑料卡底殼中，并在尾端裝入已經(jīng)錄入試劑參數(shù)的數(shù)據(jù)芯片，蓋上塑料卡上殼，壓緊，即為amh定量檢測(cè)試劑，將amh定量檢測(cè)試劑裝入鋁箔袋，并加入干燥劑密封保存。(7)樣品稀釋液配制；樣品稀釋液成分為ph＝7.2的0.20mpb，1％tween20。實(shí)施例2：amh上轉(zhuǎn)發(fā)光定量檢測(cè)試劑盒的組成成份：1、amh-upt快速檢測(cè)試紙條(40人份)2、樣品稀釋液(1瓶，45ml)3、樣品管(40個(gè))4、使用說明書(1份)實(shí)施例3：amh-upt免疫層析試紙條的原理該試紙條的原理：amh-upt快速檢測(cè)試紙條采用雙抗體夾心免疫層析方法定量檢測(cè)樣品中amh。分析膜上測(cè)試區(qū)(t)預(yù)包被抗amh單抗，質(zhì)控區(qū)(c)預(yù)包被羊抗鼠igg，試劑墊上有ucp顆粒標(biāo)記的另一株抗amh單抗。反應(yīng)時(shí)樣品中amh與兩株抗體反應(yīng)結(jié)合，在t區(qū)形成抗amh抗體-amh抗原-ucp標(biāo)記的抗amh抗體復(fù)合物，ucp顆粒在紅外光激發(fā)下發(fā)射可見光，發(fā)射光的強(qiáng)度與樣品中amh的濃度成正比。無(wú)論樣品中是否存在amh，在c區(qū)都會(huì)形成羊抗鼠-ucp標(biāo)記的抗amh抗體復(fù)合物。實(shí)施例4：本發(fā)明的amh-upt試劑盒的檢測(cè)步驟采用本發(fā)明提供的檢測(cè)amh-upt的上轉(zhuǎn)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒進(jìn)行amh含量檢測(cè)的步驟為：a.在測(cè)試前先完整閱讀使用說明書，b.將待測(cè)樣品從儲(chǔ)存環(huán)境中取出，編號(hào)并且平衡至室溫(20℃-30℃)。c.取100μl血清放入試管中，滴入稀釋液150μl，混勻。d.將試紙條置于干凈平整的平面上，取100μl稀釋后的樣品加至upt免疫層析試紙的加樣孔，同時(shí)開始計(jì)時(shí)。d.放置15min后，利用適配的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀對(duì)amh定量檢測(cè)試劑進(jìn)行檢測(cè)分析。e.上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫分析儀顯示測(cè)量結(jié)果，y值為amh的濃度，系統(tǒng)默認(rèn)單位為ng/ml。實(shí)施例5：檢測(cè)指標(biāo)：1)檢測(cè)靈敏度：取amh陰性的血清樣品20份，用amh-upt定量檢測(cè)試劑檢測(cè)并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以平均值+2倍標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)應(yīng)的濃度為amh定量檢測(cè)試劑的檢測(cè)靈敏度，詳情如表1所述。檢測(cè)結(jié)果表明：amh定量檢測(cè)試劑的檢測(cè)靈敏度為0.283ng/ml。表1靈敏度檢測(cè)數(shù)據(jù)2)精密度：隨機(jī)抽取20人份試紙條，用同一份1.0ng/mlamh低值陽(yáng)性樣品按說明書操作步驟進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，計(jì)錄每次測(cè)定結(jié)果，并計(jì)算分析，如表2所述。檢測(cè)結(jié)果表明：amh的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差(sd)和變異系數(shù)cv分別為：1.015ng/ml、0.094ng/ml和9.29％，滿足變異系數(shù)(cv)不高于15％的要求，精密度良好。表2精密性檢測(cè)數(shù)據(jù)3)線性區(qū)間：根據(jù)取濃度為50ng/ml的amh純品，依次稀釋成濃度分別為25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml的稀釋樣品，稀釋樣品的測(cè)定結(jié)果詳見表3和圖4。檢測(cè)結(jié)果表明：由于0.25ng/ml的樣品濃度低于試劑檢測(cè)靈敏度0.283mg/ml，50ng/ml的樣品濃度檢測(cè)結(jié)果僅為36.237ng/ml，絕對(duì)偏差較大，均分析剔除，因此本試劑盒的檢測(cè)線性區(qū)間為0.5-25ng/ml，線性范圍靈敏度為0.5ng/ml，r2＝0.9894。表3amh定量檢測(cè)試劑線性區(qū)間檢測(cè)結(jié)果(單位：ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)濃度50251052.510.50.25檢測(cè)濃度36.23723.27311.4774.3272.8710.9040.4670.1524)準(zhǔn)確性：以本發(fā)明amh-upt試劑盒和羅氏amh電化學(xué)發(fā)光試劑的性能對(duì)比，隨機(jī)抽取amh臨床樣本20例，分別采用本發(fā)明amh-upt試劑盒和羅氏amh電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，并統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果詳見表4和圖5。檢測(cè)結(jié)果表明：兩種方法符合率較好，準(zhǔn)確性高，線性相關(guān)性r2＝0.9801。表4兩種amh檢測(cè)結(jié)果的比較(單位：ng/ml)編號(hào)1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#羅氏11.332.0954.26513.0357.7380.75.4654.2150.358.766熱景10.11.5353.78812.796.3880.9485.9954.9780.297.883編號(hào)11#12#13#14#15#16#17#18#19#20#羅氏0.9253.236.9551.5836.2580.942.7086.3185.68813.65熱景0.743.4436.180.945.2180.6453.2355.835.88512.855當(dāng)前第1頁(yè)12