技術(shù)鄰域

基于電化學技術(shù)與固定化酶的結(jié)合過程，本發(fā)明涉及一種基于鉑/碳化硅納米材料的生物傳感器的構(gòu)建，屬于電化學檢測技術(shù)鄰域。

背景技術(shù)：

現(xiàn)代社會農(nóng)藥被廣泛作為殺蟲劑使用來一方面可以起到防治蟲害的作用，另一方面它可以增加產(chǎn)量、保證收成，提高農(nóng)民生活水平的作用。也因此出現(xiàn)了因不同種類農(nóng)藥大量使用引發(fā)的對公眾健康、環(huán)境和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中的食品安全問題。因此，為了提高和保障食品質(zhì)量和生命安全，對農(nóng)藥殘留的高靈敏檢測成為了研究者們廣泛關(guān)注的熱點。目前，對于農(nóng)藥殘留的檢測常采用并且較成熟的方法主要有：gc、hplc、gc-mc聯(lián)用技術(shù)、毛細管電泳(ce)、免疫分析、電化學傳感器和生物傳感器等，它們已被廣泛的應(yīng)用到農(nóng)藥殘留檢測的實際工作中。但由于這些技術(shù)都有儀器昂貴、儀器操作復(fù)雜、儀器笨重、檢測時間長、樣品的前處理過程復(fù)雜、測量結(jié)果的重現(xiàn)性差、穩(wěn)定性差。因此，構(gòu)建操作簡便、分析檢測快速、高靈敏和高穩(wěn)定的農(nóng)藥殘留檢測方法，有效的解決由農(nóng)藥殘留超標導(dǎo)致的衛(wèi)生食品安全和環(huán)境污染迫在眉睫。

電化學分析傳感器是目前的分析定量檢測技術(shù)的最核心和最可靠的技術(shù)，其占有非常突出的地位，此傳感器的優(yōu)點如下：儀器操作簡單、成本低、靈敏度高、儀器自動化程度高、樣品用量少、分析檢測時間快，以此同時其檢測信號轉(zhuǎn)換為直觀易讀的濃度值，便于非專業(yè)人士使用，目前已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學、藥物學以及食品科學等領(lǐng)域。此外，固定化酶的方法也被引用到農(nóng)藥殘留的檢測中，為農(nóng)藥殘留的檢測提供了更具參考的價值，其突出的優(yōu)點主要表現(xiàn)在：實驗過程操作簡單、選擇性好、專一性高、檢測響應(yīng)快。

鉑納米粒子負載氨基化碳化硅納米材料目前還沒有被引用到很多與化學相關(guān)的領(lǐng)域，它屬于一種新型的氨基化納米復(fù)合材料。此材料的制備是基于鉑納米粒子屬于貴金屬納米材料，其尺寸較小具有較好的電催化活性、大的比表面積、良好的生物相容性和良好的導(dǎo)電性。碳化硅中si-c間通過sp3雜化共價結(jié)合，si-c鍵能很強，使sic具有諸多優(yōu)良性質(zhì)，如耐磨、機械強度高、硬度大、化學性質(zhì)穩(wěn)定、耐腐蝕、熱穩(wěn)定性、耐高溫、背景電流小、干擾小、優(yōu)良的半導(dǎo)體材料，因此碳化硅具有很大的應(yīng)用價值，在光學、電學、機械等許多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，它是理想的載體材料。因此，將鉑納米粒子負載到氨基化碳化硅上，制備的此納米復(fù)合材料具有更強的電催化活性，并且可以首次通過此種材料來固定乙酰膽堿酯酶進而用來定量檢測甲基對硫磷和西維因等兩種農(nóng)藥，達到對農(nóng)藥檢測所要求的靈敏度高、選擇性好、檢測時間短等需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種電催化活性高、靈敏度高、選擇性好、檢測時間短且有助于乙酰膽堿酯酶的固定的基于鉑納米粒子負載氨基化碳化硅的納米復(fù)合材料電化學生物傳感器及其應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：基于鉑納米粒子負載氨基化碳化硅納米復(fù)合材料的乙酰膽堿酯酶電化學生物傳感器的制備，它包括以下步驟：首先，以sic、glucost、ethanol、aptes、h2ptcl6、edta、naoh、nabh4、吡啶和檸檬酸鈉為起始原料，分別采用水熱的方法制備sic-nh2納米材料以及采用常溫還原的方法制備ptnp@sic-nh2納米復(fù)合材料；其次，用殼聚糖(cs)固定乙酰膽堿酯酶采用物理吸附將乙酰膽堿酯酶(ache)固定在ptnp@sic-nh2修飾的玻碳電極表面，基于ptnp@sic-nh2良好的電化學性能，構(gòu)建成電化學生物傳感器應(yīng)用于對甲基對硫磷和西維因等兩種農(nóng)藥的快速、靈敏檢測，其構(gòu)建過程與檢測機理：

(1)式中，ip,control是指乙酰膽堿酯酶傳感器對一定濃度的硫代乙酰膽堿產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)電流，ip,exp是指乙酰膽堿酯酶傳感器經(jīng)農(nóng)藥抑制后對同一濃度硫代乙酰膽堿產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)電流，通過比較酶抑制前后的電流信號即氧化峰大小，實現(xiàn)對對甲基對硫磷和西維因等兩種農(nóng)藥的定量檢測。

本發(fā)明的具體的技術(shù)解決方案如下：

(1)ptnp@sic-nh2納米復(fù)合材料的制備

①sic-nh2納米材料的制備

首先，100mgsic溶于40ml的超純水中，100mg葡萄糖溶于40ml的超純水中,分別超聲分散均勻后，轉(zhuǎn)移到100ml的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中于180℃反應(yīng)8小時，冷卻至室溫，用乙醇離心洗三次；然后，加入40ml乙醇和1ml3-氨丙基三乙氧基硅烷，攪拌12小時過夜，用乙醇離心洗三次，冷凍干燥樣品即得到sic-nh2納米材料。

②ptnp@sic-nh2復(fù)合材料的制備

首先，取2.0mg制得的sic-nh2材料，加入到2.0ml0.45mmh2ptcl6的溶液中；其次，加入5.0ml吡啶和1.0ml0.01m檸檬酸鈉到混合溶液中超聲10分鐘；最后，加入1.0ml0.01mnabh4溶液常溫攪拌10h，之后12000rpm離心20分鐘，用水洗三次，定容至10mg/ml，即得到ptnp@sic-nh2復(fù)合材料。(一)ptnp@sic-nh2納米復(fù)合材料的制備

(2)玻碳電極表面預(yù)處理

將直徑為3mm的玻碳電極glassycarbonelectrode(gce)用1.0μm，0.3μm，0.05μm的al2o3粉來拋光處理，依次用乙醇和二次蒸餾水超聲清洗，放置于空氣中自然干燥，然后在ph＝7.4的pbs溶液中于+1.75v恒電位下掃描300s，再于+0.3v～+1.25v和+0.3v～－1.3v之間循環(huán)掃描多次，待電流穩(wěn)定后，用二次水沖洗電極并在空氣中自然干燥備用。

(3)電化學生物傳感界面的構(gòu)建

(a)取1.0mlptnp@sic-nh2復(fù)合材料加入20μl5％的nafion溶液；

(b)取6ul有5％nafion溶液的ptnp@sic-nh2懸浮液滴涂于預(yù)先處理好的玻碳電極表面，放在室溫下干燥，即得到ptnp@sic-nh2修飾玻碳電極，記為ptnp@sic-nh2/gce；

(c)待ptnp@sic-nh2修飾的玻碳電極干后再接著在電極表面滴涂4.5μl的乙酰膽堿酯酶(ache)和殼聚糖(cs)的混合物，其中乙酰膽堿酯酶為3μl和殼聚糖為1.5μl，于冰箱中4℃環(huán)境下干燥過夜，即得到ache-cs/ptnp@sic-nh2/gce；

(4)對甲基對硫磷和呋喃丹等農(nóng)藥標準品進行檢測，建立標準曲線

把ache-cs/ptnp@sic-nh2/gce作為工作電極，飽和甘汞電極(saturatedcalomelelectrode)作為參比電極，鉑電極(platinumwireelectrode)作為對電極將工作電極置于含有不同濃度甲基對硫磷和西維因在pbs(0.1mol/lph＝7.4)中抑制4min循環(huán)伏安掃描多次，待背景電流穩(wěn)定后，在2mm的巰基乙酰膽堿(atcl)溶液中25℃下溫育10min，記錄它們各自所產(chǎn)生的循環(huán)伏安圖，根據(jù)電流值隨農(nóng)藥的不同濃度呈規(guī)律的變化，繪制標準曲線并確定農(nóng)藥的最佳線性范圍和檢測限。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明分別利用水熱的方法制備了sic-nh2納米材料和利用常溫還原方法制備了ptnp@sic-nh2納米復(fù)合材料，其具有優(yōu)異的電催化活性、生物相容性和化學穩(wěn)定性。

2、本發(fā)明所構(gòu)建的電化學生物傳感器，成功實現(xiàn)了對甲基對硫磷和西維因等兩種農(nóng)藥的高靈敏檢測，其中該傳感器對甲基對硫磷農(nóng)藥檢測的線性范圍為(10^-12)mol/l～(10^-8)mol/l，其檢出限為(5.52×10^-13)mol/l；對西維因農(nóng)藥檢測的線性范圍為(10^-12)mol/l～(10^-8)mol/l，其檢出限為(5.65×10^-13)mol/l。

3、本發(fā)明基于農(nóng)藥對酶修飾電極的抑制作用，實現(xiàn)了電化學檢測農(nóng)藥殘留的目的，該方法操作簡便，樣品用量少、檢測快速、檢測限低、線性范圍寬和靈敏度高，適用于農(nóng)藥殘留的分析與檢測。

附圖說明

圖1為幾種不同材料在0.1m(pbs＝7.4)和0.5mmatcl中的循環(huán)伏安圖(cv圖)，其電流響應(yīng)如圖所示：

a.nf/ache-cs/gceb.nf/ache-cs/sic-nh2/gcec.nf/ache-cs/ptnp/gced.nf/ache-cs/ptnp@sic-nh2/gce；

圖2為電化學生物傳感器電極nf/ache-cs/ptnp@sic-nh2/gce應(yīng)用于不同濃度的atcl檢測的標準曲線。

圖3為電化學生物傳感器電極nf/ache-cs/ptnp@sic-nh2/gce應(yīng)用于檢測不同濃度甲基對硫磷農(nóng)藥的標準曲線；

圖4為電化學生物傳感器電極nf/ache-cs/ptnp@sic-nh2/gce應(yīng)用于檢測不同濃度西維因農(nóng)藥的標準曲線。

具體實施方式

實施例一：

首先，100mgsic溶于40ml的超純水中，100mg葡萄糖溶于40ml的超純水中,分別超聲分散均勻后，轉(zhuǎn)移到100ml的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中于180℃反應(yīng)8小時，冷卻至室溫，用乙醇離心洗三次；然后，加入40ml乙醇和1ml3-氨丙基三乙氧基硅烷，攪拌12小時過夜，用乙醇離心洗三次，冷凍干燥樣品即得到sic-nh2納米材料。取2.0mg制得的sic-nh2材料，加入到2.0ml0.45mmh2ptcl6的溶液中，加入5.0ml吡啶和1.0ml0.01m檸檬酸鈉到混合溶液中超聲10分鐘，最后，加入1.0ml0.01mnabh4溶液常溫攪拌10h，之后12000rpm離心20分鐘，用水洗三次，定容至10mg/ml，即得到ptnp@sic-nh2復(fù)合材料。

首先，取1.0mlptnp@sic-nh2復(fù)合材料加入20μl5％的nafion溶液；其次，取6ul有5％nafion溶液的ptnp@sic-nh2懸浮液滴涂于預(yù)先處理好的玻碳電極表面，放在室溫下干燥，即得到ptnp@sic-nh2修飾玻碳電極，記為ptnp@sic-nh2/gce；最后，在已干的ptnp@sic-nh2修飾的玻碳電極表面滴涂4.5μl乙酰膽堿酯酶(ache)和殼聚糖(cs)混合物，在4℃環(huán)境中干燥過夜，即得到ache-cs/ptnp@sic-nh2/gce；

先在用pbs(0.1mol/lph＝7.4)配成的不同濃度的巰基乙酰膽堿atcl溶液中用循環(huán)伏安掃描多次，記錄所產(chǎn)生的循環(huán)伏安圖(如圖1所示)，建立標準曲線(如圖2所示)；后選用10^-12mol/l～10^-8mol/l濃度范圍的甲基對硫磷農(nóng)藥在pbs(0.1mol/lph＝7.4)中用循環(huán)伏安掃描多次，待背景電流穩(wěn)定后，在2mm的巰基乙酰膽堿atcl溶液中室溫下溫育15min，建立標準曲線(如圖3所示)，確定該電化學生物傳感器的檢出限為5.52×10^-13mol/l。

實施例二：

首先，100mgsic溶于40ml的超純水中，100mg葡萄糖溶于40ml的超純水中,分別超聲分散均勻后，轉(zhuǎn)移到100ml的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中于180℃反應(yīng)8小時，冷卻至室溫，用乙醇離心洗三次；然后，加入40ml乙醇和1ml3-氨丙基三乙氧基硅烷，攪拌12小時過夜，用乙醇離心洗三次，冷凍干燥樣品即得到sic-nh2納米材料。取2.0mg制得的sic-nh2材料，加入到2.0ml0.45mmh2ptcl6的溶液中，加入5.0ml吡啶和1.0ml0.01m檸檬酸鈉到混合溶液中超聲10分鐘，最后，加入1.0ml0.01mnabh4溶液常溫攪拌10h，之后12000rpm離心20分鐘，用水洗三次，定容至10mg/ml，即得到ptnp@sic-nh2復(fù)合材料。

首先，取1.0mlptnp@sic-nh2復(fù)合材料加入20μl5％的nafion溶液；其次，取6ul有5％nafion溶液的ptnp@sic-nh2懸浮液滴涂于預(yù)先處理好的玻碳電極表面，放在室溫下干燥，即得到ptnp@sic-nh2修飾玻碳電極，記為ptnp@sic-nh2/gce；最后，在已干的ptnp@sic-nh2修飾的玻碳電極表面滴涂4.5μl乙酰膽堿酯酶(ache)和殼聚糖(cs)混合物，在4℃環(huán)境中干燥過夜，即得到ache-cs/ptnp@sic-nh2/gce；

先在用pbs(0.1mol/lph＝7.4)配成的不同濃度的巰基乙酰膽堿atcl溶液中用循環(huán)伏安掃描多次，記錄所產(chǎn)生的循環(huán)伏安圖(如圖1所示)，建立標準曲線(如圖2所示)；后選用10^-12mol/l～10^-8mol/l濃度范圍的西維因農(nóng)藥在pbs(0.1mol/lph＝7.4)中用循環(huán)伏安掃描多次，待背景電流穩(wěn)定后，在2mm的巰基乙酰膽堿atcl溶液中室溫下溫育15min，建立標準曲線(如圖4所示)，確定該電化學生物傳感器的檢出限為5.65×10^-13mol/l。