本發(fā)明屬于電化學(xué)傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于zntcpp@mof的電化學(xué)免疫檢測微囊藻毒素的方法。

背景技術(shù)：

長期以來，水體富營養(yǎng)化和藍藻水華現(xiàn)象頻繁發(fā)生，致使水體中微囊藻毒素(mcs)的污染日益嚴(yán)重。微囊藻毒素mc-lr對水生生物及人類健康具有極大危害作用，世界衛(wèi)生組織在《飲用水衛(wèi)生基準(zhǔn)》(2004版)中規(guī)定了飲用水中mc-lr的安全限值為1.0μg/l，因此飲用水源中mc-lr濃度的監(jiān)測顯得尤為重要。

張新愛等人在玻碳電極表面修飾了碳納米管納米金復(fù)合膜，利用mc-lr與抗體之間的特異性識別作用構(gòu)建“三明治”夾心結(jié)構(gòu)的免疫分析模式，對mc-lr的線性檢測范圍為0.50～12.0μg/l，檢測限為0.30μg/l，但是該方法存在成本較高，線性范圍窄和檢測限較低的缺點(張新愛等.碳納米管/納米金復(fù)合膜電化學(xué)免疫傳感器用于微囊藻毒素的檢測研究[j].分析化學(xué),2014,42.)。張金果等人以辣根過氧化物酶偶聯(lián)的微囊藻毒素(mclr-hrp)為標(biāo)記物，基于直接競爭的免疫分析模式構(gòu)建了mc-lr電流型免疫傳感器，對mc-lr的線性檢測范圍為0.79～12.9μg/l，檢測限為0.38μg/l，然而該方法操作步驟繁瑣，線性范圍窄，且檢測限低(張金果等.基于fe3o4@au磁性納米粒子修飾絲網(wǎng)印刷電極的微囊藻毒素免疫傳感器研究[j].分析化學(xué),2013,41(9):1353-1358.)。因此，設(shè)計一種簡單便宜、快速方便，靈敏性更好的mc-lr檢測方法具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有的微囊藻毒素檢測方法中存在的成本高、線性范圍窄和檢測限低的問題，本發(fā)明提供了一種簡單、快速、成本低的基于zntcpp@mof的電化學(xué)免疫檢測微囊藻毒素的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種基于zntcpp@mof的電化學(xué)免疫檢測微囊藻毒素的方法，具體步驟如下：

步驟1，zntcpp@mof的制備：將均苯三酸和鋅卟啉加入到等體積的無水乙醇和n,n-二甲基甲酰胺(dmf)的混合溶劑中，攪拌至分散均勻，加入cu(no3)2·3h2o溶液，混合均勻后置于60～120℃下進行水熱反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至常溫，離心，棄去上清液，真空干燥即得到鋅卟啉功能化金屬有機框架材料zntcpp@mof；

步驟2，傳感器組裝：按鋅卟啉功能化金屬有機框架物zntcpp@mof和toab(四辛基溴化銨)的質(zhì)量比為1:1，將zntcpp@mof和toab溶于甲苯中，將混合溶液滴加到潔凈的電極表面，常溫下干燥，滴加摩爾比為4:1的n-羥基琥珀酰亞胺/1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc/nhs)的水溶液對框架物進行羧基活化，淋洗，滴加待檢測的微囊藻毒素lr，溫育淋洗后滴加抗微囊藻毒素lr單克隆抗體，進行免疫反應(yīng)，溫育淋洗，即組裝得到電化學(xué)免疫傳感器；

步驟3，電致化學(xué)發(fā)光檢測：以鉑絲電極為對電極，ag/agcl電極為參比電極，步驟2中的電極為工作電極，以含有0.1mkno3的0.1m，ph7.4的pbs為電解液，檢測ecl信號強度，根據(jù)微囊藻毒素lr的濃度和ecl信號的線性關(guān)系，計算得到待檢測的微囊藻毒素lr的濃度。

優(yōu)選地，步驟1中，所述的水熱反應(yīng)時間為6～12h；離心的轉(zhuǎn)速為9000r/min，離心時間為10～20min；真空干燥的溫度為60～80℃，干燥時間為12～24h。

優(yōu)選地，步驟2中，溫育條件為37℃下溫育1h。

優(yōu)選地，步驟3中，所述的電致化學(xué)發(fā)光參數(shù)為：光電倍增管偏置電壓為1kv，放大級數(shù)為3，掃描電位范圍為-1.7～-0.5v，掃描速率為100mv·s^-1。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點如下：

(1)本發(fā)明將zntcpp嵌裝到具有多孔結(jié)構(gòu)的金屬有機框架內(nèi)制備得到了功能化材料zntcpp@mof，該材料結(jié)合了zntcpp的發(fā)光性和金屬框架材料的大比表面積，與抗原充分作用，具有更好的電化學(xué)發(fā)光信號，檢測靈敏度更高；

(2)本發(fā)明采用抗原和抗體直接免疫進行信號傳遞，制備步驟簡單快捷，操作方便，成本較低，構(gòu)建的傳感器對微囊藻毒素lr的線性檢測范圍為0.1μg/l～20μg/l，其最低檢測限可達0.06μg/l。

附圖說明

圖1為實施例1中卟啉功能化金屬有機框架材料zntcpp@mof合成流程示意圖。

圖2為實施例1中zntcpp@mof(a)和hkust-1(cu)(b)的sem圖。

圖3為實施例1中zntcpp@mof(a)和hkust-1(cu)(b)的xrd圖譜(a)和紅外光譜圖(b)。

圖4為實施例2中toab質(zhì)量與zntcpp@mof的ecl信號關(guān)系圖(a)，其中m(toab)表示1ml10mg/mlzntcpp@mof甲苯溶液中的質(zhì)量；(b)對應(yīng)10mgtoab下zntcpp@mof的ecl信號與時間關(guān)系圖。

圖5為實施例3中電化學(xué)免疫傳感器的組裝示意圖。

圖6為實施例3中電極組裝過程電化學(xué)交流阻抗變化圖。

圖7為實施例4中傳感器檢測微囊藻毒素lr的ecl信號圖及其線性曲線圖。

圖8為實施例5中傳感器對no^3-，ca²⁺，mg²⁺，fe³⁺和mc-rr抗干擾實驗性結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳述。

實施例1

卟啉功能化金屬有機框架材料zntcpp@mof的制備方法，可參考文獻【porphyrin-encapsulatedmetal-organicframeworksasmimeticcatalystsforelectrochemicaldnasensingviaallostericswitchofhairpindna】制備得到，具體步驟如下：

(1)0.5g均苯三酸(h3btc)和30mg鋅卟啉(zntcpp)，加入到15ml1：1(v：v)無水乙醇與dmf的混合液中，然后再與7.5mlcu(no3)2·3h2o(1.04g)的水溶液混合，將上述混合液超聲20min，使其充分均相分散；

(2)將混合液分裝在50ml的聚四氟乙烯罐中并用高壓反應(yīng)釜密封，將反應(yīng)釜放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，在60℃下加熱7h后冷卻至常溫。

(3)將步驟(2)中的冷卻混合液在9000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，濾去上清液后，用無水乙醇溶解沉淀顆粒，相同條件下離心洗滌沉降顆粒，連續(xù)洗滌3次后收集得到沉淀顆粒，移入真空干燥箱中60℃下真空干燥12h，即制備得到卟啉功能化的金屬有機框架材料zntcpp@mof。制備過程如圖1所示。

對卟啉功能化金屬有機框架材料zntcpp@mof及其原型金屬有機框架材料hkust-1(cu)進行sem、xrd和紅外表征分析，結(jié)果如圖2所示。由sem圖可以看出，原型金屬有機框架材料hkust-1(cu)(圖2b)和zntcpp@mof(圖2a)都具有典型的八面體構(gòu)型和晶體結(jié)構(gòu)，說明鋅卟啉并未改變原型框架材料hkust-1(cu)的八面體晶體結(jié)構(gòu)。分析xrd圖譜(圖3a)可知，hkust-1(cu)和zntcpp@mof樣品均在11.8，13.5，14.9，17.6，19.2，20.4角度處出現(xiàn)衍射峰，對應(yīng)于八面體晶型結(jié)構(gòu)標(biāo)準(zhǔn)卡片(jcpdf卡號：36-1452)中的(222)，(400)，(331)，(333)，(420)和(442)晶面，進一步證實了鋅卟啉功能化金屬有機框架材料為八面體晶型結(jié)構(gòu)。由紅外光譜圖可以看出，zntcpp(圖3b(b))和zntcpp@mof(圖3b(a))在1000cm^-1均有峰出現(xiàn)，這是由于zntcpp吡咯環(huán)上的c-h鍵的彎曲振動所產(chǎn)生的的峰，說明zntcpp成功修飾了金屬框架物hkust-1(cu)從而得到功能化金屬框架物材料zntcpp@mof。

實施例2

分別將1mg、5mg、10mg、15mg和20mg的toab溶于1ml10mg/mlzntcpp@mof的甲苯溶液中，分別取20μl上述溶液修飾到玻碳電極上，常溫下放置干燥，以鉑絲電極為對電極，ag/agcl電極為參比電極，將上述修飾好的電極作為工作電極，以含有0.1mkno3的0.1mph7.4pbs為電解液，檢測ecl信號強度。電致化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置：光電倍增管偏置電壓為1kv，放大級數(shù)為3，掃描電位范圍設(shè)置為-1.7～-0.5v，掃描速率為100mv·s-1。檢測結(jié)果如圖4(a)所示，當(dāng)toab用量過少時，zntcpp@mof在電極上穩(wěn)定性不夠，容易脫落，而用量過多時，toab在電極表面成膜過厚，會阻礙電子傳遞，使ecl信號減弱，在toab為10mg(27mm)用量下，zntcpp@mof(10mg/ml)的ecl信號最好，圖4(b)對應(yīng)于10mgtoab時，zntcpp@mof的發(fā)光信號與時間關(guān)系，ecl信號強且穩(wěn)定性更好，所以選擇質(zhì)量比1:1為toab和zntcpp@mof的最優(yōu)配比。

實施例3

mc-lr電化學(xué)免疫傳感器組裝過程如圖5所示，主要步驟如下：

將20μl10mg/mlzntcpp@mof和10mg/ml四辛基溴化銨(toab)的甲苯混合溶液滴修飾gce電極表面，室溫下自然晾干，制得zntcpp@mof(toab)/gce電極；在zntcpp@mof(toab)/gce電極上滴加20μl400mmedc和100mmnhs的混合水溶液，對金屬有機框架物zntcpp@mof進行羧基活化，室溫下反應(yīng)30min后，用0.01mph7.4的pbs溶液淋洗電極表面，然后在電極上修飾20μl抗原mc-lr，并置于37℃溫育箱中孵育1h后，用pbs溶液淋洗電極表面，除去過量的mc-lr，即制得mc-lr/zntcpp@mof(toab)/gce；最后在修飾電極mc-lr/zntcpp@mof(toab)/gce上滴加20μl10μg/ml抗mc-lr單克隆抗體(anti-mc-lr)，37℃溫育箱中孵育1h后，用ph7.4的pbs溶液淋洗電極表面，制得電極anti-mc-lr/mc-lr/zntcpp@mof(toab)/gce，mc-lr電化學(xué)免疫傳感器即組裝完成。

電化學(xué)交流阻抗(eis)常被用于電極修飾過程界面變化的表征，圖6表示電極修飾過程中阻抗變化情況。曲線a和曲線b分別表示裸玻碳電極baregce和修飾了zntcpp@mof的電極zntcpp@mof/gce的交流阻抗圖，可以看出交流阻抗值變化不大，這是由于zntcpp@mof在電極上穩(wěn)定性不好，容易脫落到電解液中。四辛基溴化銨(toab)能夠增加zntcpp@mof在電極上的穩(wěn)定性。曲線c和曲線d分別表示修飾了toab的電極toab/gce和電極zntcpp@mof(toab)/gce的交流阻抗圖，可以看出交流阻抗值相比裸電極明顯增大，且曲線d大于曲線c的阻抗值，說明toab成功將zntcpp@mof固定在了電極上。曲線e表示結(jié)合了mc-lr的電極mc-lr/zntcpp@mof(toab)/gce的交流阻抗圖，曲線f表示滴加抗mc-lr單克隆抗體(anti-mc-lr)后，即anti-mc-lr/mc-lr/zntcpp@mof(toab)/gce的交流阻抗圖，因為抗原、抗體均不導(dǎo)電，阻礙了電子傳遞，故曲線e和f相比曲線d，交流阻抗值明顯增加，且交流阻抗值z(f)＞z(e)，說明抗原和抗體發(fā)生免疫反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，該復(fù)合物電活性更低，具有更大阻抗效應(yīng)。從阻抗變化情況可以看出，微囊藻毒素lr電化學(xué)免疫傳感器的組裝過程是成功的。

實施例4

金屬有機框架材料zntcpp@mof可應(yīng)用于檢測微囊藻毒素lr，檢測過程如下：

配置濃度梯度為0.1μg/l、1μg/l、5μg/l、10μg/l、15μg/l和20μg/l的mc-lr標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實施例3組裝mc-lr免疫傳感電極，以鉑絲電極為對電極，ag/agcl電極為參比電極，anti-mc-lr/mc-lr/zntcpp@mof(toab)/gce作為工作電極，以含有0.1mkno3的0.1mph7.4pbs為電解液，檢測ecl信號強度。電致化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置：光電倍增管偏置電壓為1kv，放大級數(shù)為3，掃描電位范圍設(shè)置為-1.7～-0.5v，掃描速率為100mv·s-1。

如圖7a表示空白和mc-lr濃度分別為0.1、1、5、10、15和20μg/l的ecl強度(由高到低)，圖7b說明抗原mc-lr濃度與ecl信號呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，其線性檢測范圍為0.1μg/l～20μg/l，檢測下限達到0.06μg/l，說明該ecl電化學(xué)免疫傳感器可實現(xiàn)對微囊藻毒素lr的高靈敏檢測。

實施例5

配置濃度為5μg/l的mc-lr標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入1000倍的no^3-，ca²⁺，mg²⁺，fe³⁺和10倍的mc-rr作為干擾物質(zhì)，按照實施例4步驟，檢測ecl信號。檢測結(jié)果如圖8所示，干擾物質(zhì)對傳感器檢測mc-lr的ecl信號基本無影響，表明該傳感器對mc-lr具有較好的選擇性。