本發(fā)明涉及體外診斷醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種預(yù)處理丙肝抗原的方法、用這種預(yù)處理方法得到的丙肝抗原、用于對(duì)丙肝抗原實(shí)施這種預(yù)處理方法的試劑盒、包含用該方法預(yù)處理的丙肝抗原的檢測(cè)試劑盒以及它們?cè)跈z測(cè)丙型肝炎中的用途。

背景技術(shù)：

hcv是一種血源性病毒，其感染發(fā)病呈現(xiàn)世界性分布。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球丙型肝炎病毒(hcv)的感染率約為3％，每年新發(fā)hcv病例約315萬例。主要通過輸血或血制品、血透析、單采血漿、腎移植、靜脈注射毒品、性傳播、母嬰傳播等方式傳播。

丙型肝炎病毒(hepatitiscvirus,hcv)是單股正鏈的rna病毒，屬黃病毒科(flaviviridae)。在受感染者血清及肝組織內(nèi)數(shù)量少，不易通過電鏡觀測(cè)到。通過微濾技術(shù)判斷其大小約為30-60nm，沉淀系數(shù)140s，浮密度1.1g/cm³。hcv基因組全長(zhǎng)9.4-9.6kb，由編碼區(qū)、5’-非編碼區(qū)和3’-非編碼區(qū)組成。編碼區(qū)能編碼一段含3011個(gè)氨基酸的多蛋白，在特異的細(xì)胞和病毒蛋白酶的作用下可以裂解為各個(gè)不同功能區(qū)的產(chǎn)物，包括結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)(ns)基因，其中結(jié)構(gòu)基因分為c區(qū)(編碼核心蛋白)和e區(qū)(編碼包膜蛋白)，并由它們組裝病毒顆粒；非結(jié)構(gòu)基因分別為ns1、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b基因，并編碼相應(yīng)的蛋白。

hcv雖然在感染者體內(nèi)滴度較低，但其幾乎所有結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白都能夠誘發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。anti-hcv是人體免疫細(xì)胞對(duì)hcv感染做出免疫反應(yīng)而產(chǎn)生的抗體。人在感染hcv后大約40-70天后血清中會(huì)出現(xiàn)anti-hcv，抗體在血液中循環(huán)而且經(jīng)常性檢測(cè)到存在，是hcv感染的重要臨床標(biāo)志。anti-hcv從病毒感染到在體內(nèi)出現(xiàn)有一定時(shí)間的窗口期，但是anti-hcv的檢測(cè)對(duì)于篩查目標(biāo)是否感染hcv仍舊有重要的作用。抗c區(qū)抗體在hcv感染后出現(xiàn)較早，并具有較高的陽性率。ns2、ns3、ns4、ns5所編碼的四種蛋白，除ns2外其余均可以有效誘導(dǎo)hcv抗體應(yīng)答。其中抗ns3抗體免疫原性較強(qiáng)，相應(yīng)抗體滴度也較高，并且其出現(xiàn)早于其他抗體。但是與抗ns4和ns5抗體不同的是，使用ns3的合成多肽不能檢出相應(yīng)的特異性抗體，可能與其相應(yīng)的構(gòu)象依賴性有關(guān)；ns4區(qū)則含有至少2個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)序列位點(diǎn)，抗原性較強(qiáng)，絕大多數(shù)hcv感染者都會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該區(qū)的抗體反應(yīng)，但是通常在感染后延期出現(xiàn)，其持續(xù)呈現(xiàn)陽性可能與慢性化有關(guān)；而針對(duì)ns5中rna聚合酶區(qū)域所產(chǎn)生的抗體，可以在感染者抗ns3和抗ns4抗體陰性時(shí)依舊呈陽性。其血清轉(zhuǎn)換較早，可用于急性期感染的診斷。

由于anti-hcv檢測(cè)靈敏度較高且特異性較好，因而是針對(duì)hcv感染初步篩選的重要且普遍的手段。由于hcv以血源傳染為主要途徑，因此在與血液相關(guān)的臨床應(yīng)用中，anti-hcv的檢測(cè)對(duì)于防止hcv的傳播有著重要的意義。

由于丙肝抗原獨(dú)特的蛋白空間結(jié)構(gòu)，使其將主要的檢測(cè)位點(diǎn)置于蛋白結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，不易被檢測(cè)。傳統(tǒng)的hcv多使用多肽進(jìn)行交聯(lián)，但是會(huì)造成特異性不好等缺點(diǎn)；近些年來使用表達(dá)的基因工程抗原取代hcv多肽，但處理過程難控，且處理后的抗原穩(wěn)定性較差，不利于商業(yè)化，批間差異難控，且靈敏度較低。

因此，本領(lǐng)域急需一種簡(jiǎn)便的預(yù)處理丙肝抗原的方法，該方法得到的預(yù)處理丙肝抗原穩(wěn)定并且在檢測(cè)丙型肝炎時(shí)能夠具備高靈敏度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便的預(yù)處理丙肝抗原的方法，該方法得到的預(yù)處理丙肝抗原穩(wěn)定并且在檢測(cè)丙型肝炎時(shí)能夠具備高靈敏度。

在第一方面，本發(fā)明提供一種預(yù)處理丙肝抗原的方法，所述方法包括利用預(yù)處理劑處理丙肝抗原的步驟；

所述預(yù)處理劑選自：4-硝基苯硫酚或2-巰基乙烷磺酸鈉；優(yōu)選2-巰基乙烷磺酸鈉。

在具體的實(shí)施方式中，在利用預(yù)處理劑處理丙肝抗原后，還包括利用生物素交聯(lián)經(jīng)處理的丙肝抗原，從而得到生物素化的丙肝抗原。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法還包括將交聯(lián)后的生物素化丙肝抗原保存于含所述預(yù)處理劑的稀釋液中。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)丙肝抗原的預(yù)處理是在丙肝抗原中按照一定比例加入預(yù)處理劑，例如2-巰基乙烷磺酸鈉，并于2～8℃下反應(yīng)30分鐘。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用預(yù)處理劑，例如2-巰基乙烷磺酸鈉預(yù)處理丙肝抗原時(shí)，所述丙肝抗原與2-巰基乙烷磺酸鈉的反應(yīng)濃度分別為0.5～5mg/ml、0.5％～5％(w/v)，優(yōu)選1mg/ml、1％(w/v)。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，利用預(yù)處理劑，例如2-巰基乙烷磺酸鈉預(yù)處理丙肝抗原時(shí)，所述丙肝抗原與2-巰基乙烷磺酸鈉溶液的體積比為1:5～1:20，優(yōu)選1:10。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用生物素交聯(lián)經(jīng)處理的丙肝抗原時(shí)，所述生物素的功能基團(tuán)是氨基、羧基、羥基、或者巰基，優(yōu)選巰基。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用生物素交聯(lián)經(jīng)處理的丙肝抗原是將預(yù)處理的丙肝抗原與生物素按照一定比例進(jìn)行反應(yīng)，置于2～8℃，10mmpbs透析16～24小時(shí)。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用生物素交聯(lián)經(jīng)處理的丙肝抗原時(shí)，所述預(yù)處理的丙肝抗原與生物素的反應(yīng)濃度分別為0.5～5mg/ml、0.5～5mg/ml，優(yōu)選1mg/ml、2mg/ml。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，用生物素交聯(lián)經(jīng)處理的丙肝抗原時(shí)，所述預(yù)處理的丙肝抗原與生物素的摩爾濃度比例為1:5～1:50，優(yōu)選1:15。

在第二方面，本發(fā)明提供一種經(jīng)預(yù)處理的丙肝抗原，其特征在于，所述經(jīng)預(yù)處理的丙肝抗原采用本發(fā)明第一方面所述方法制備。

在第三方面，本發(fā)明提供一種丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒裝有：本發(fā)明第二方面所述的預(yù)處理的丙肝抗原，或本發(fā)明第一方面所述的方法制備的預(yù)處理的丙肝抗原。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒還裝有：包被丙肝抗原的微孔板；辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素；陰性對(duì)照；陽性對(duì)照；顯色液a；顯色液b；洗滌液。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述顯色劑a的主要成分為過氧化氫溶液，顯色劑b的主要成分為3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的生物素化丙肝抗原稀釋液的配方為：10～100mmph7.2～7.8pbs、50～300mmkcl、5～40％牛血清、5～25mmedta·2na、0.05～0.2％2-巰基乙烷磺酸鈉、0.05～0.2％proclin-300。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈霉親和素的稀釋液的配方為：10～100mmph7.2～7.8tris-hcl、50～300mmnacl、0.5～2％bsa、5～15％甘油、0.05～0.5％吐溫-20、0.05～0.2％proclin-300。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的洗滌液配方為：10～100mmph7.2～7.8tris-hcl，50～300mmnacl，0.1～1％吐溫-20，0.05～0.2％proclin-300。

在第四方面，本發(fā)明提供一種丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒裝有：本發(fā)明第二方面所述的預(yù)處理的丙肝抗原，或本發(fā)明第一方面所述的方法制備的預(yù)處理的丙肝抗原。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒還裝有：鏈霉親和素磁微粒；堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗人igg抗體；定標(biāo)品；化學(xué)發(fā)光底物；洗滌液。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述化學(xué)發(fā)光底物的主要成分為1,2-二氧雜環(huán)丁烷衍生物作為酶促化學(xué)發(fā)光底物。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述1,2-二氧雜環(huán)丁烷衍生物為：amppd(3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷)、cdp-star。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的磁微粒試劑的主要成分是超順磁性微粒，其粒徑為800nm～3μm，主要的活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺?；?。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的磁微粒試劑稀釋液的配方為：10～100mmph7.2～7.8tris-hcl、50～300mmnacl、0.5～2％bsa、2～15％甘油、0.05～0.2％proclin-300。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶標(biāo)記鼠抗人igg抗體的制備方法為戊二醛偶聯(lián)法，具體操作為：將堿性磷酸酶溶于終濃度5％戊二醛溶液中，室溫靜置過夜，生理鹽水透析后，加入鼠抗人igg抗體，50mmph9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中透析過夜，加入甘氨酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，等體積加入飽和硫酸銨，2～8℃2小時(shí)，4000rpm離心去上清，沉淀溶于50mmph7.40磷酸緩沖液中，對(duì)其透析過夜，加入等體積甘油，置于-20℃保存。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶標(biāo)記鼠抗人igg抗體的稀釋液的配方為：10～100mmph7.2～7.8tris-hcl、50～300mmnacl、0.5～2％bsa、5～15％甘油、0.05～0.5％吐溫-20、0.05～0.2％proclin-300。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的丙型肝炎病毒抗體定標(biāo)品的濃度分別約為2ncu/ml。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的丙型肝炎病毒抗體定標(biāo)品的稀釋液配方為：10～100mmph7.2～7.8pb，50～300mmnacl，3～8％bsa，3％～10％蔗糖，0.05～0.2％proclin-300。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的洗滌液配方為：10～100mmph7.2～7.8tris-hcl，50～300mmnacl，0.1～1％曲拉通x-100，0.05～0.2％proclin-300。

在第五方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第二方面所述的預(yù)處理的丙肝抗原或本發(fā)明第一方面所述的方法制備的預(yù)處理的丙肝抗原在制備丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒或丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒中的用途。

在第六方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第三方面所述的丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒或本發(fā)明第四方面所述的丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒的制備方法，所述方法包括將本發(fā)明第二方面所述的預(yù)處理的丙肝抗原，或本發(fā)明第一方面所述的方法制備的預(yù)處理的丙肝抗原制備成所述試劑盒。

在第七方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體的方法，所述方法包括利用本發(fā)明第二方面所述的預(yù)處理的丙肝抗原或本發(fā)明第一方面所述的方法制備的預(yù)處理的丙肝抗原或本發(fā)明第三方面所述的丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒或本發(fā)明第四方面所述的丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血液樣本中的丙型肝炎病毒抗體。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方法不限于診斷目的。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1顯示了丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法試劑的反應(yīng)原理；

圖2顯示了丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法試劑的反應(yīng)原理。

具體實(shí)施方式

發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)利用特定的預(yù)處理劑對(duì)丙肝抗原進(jìn)行預(yù)處理，并對(duì)預(yù)處理的丙肝抗原作生物素化后，得到的預(yù)處理丙肝抗原可以應(yīng)用于酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光分析法的丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒。采用本發(fā)明的方法預(yù)處理丙肝抗原，使得利用丙型肝炎病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)的靈敏度顯著提高，同時(shí)也顯著提升了丙肝抗原的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

發(fā)明人在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)中丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)靈敏度不足的主要原因在于，丙肝抗原自身蛋白結(jié)構(gòu)造成反應(yīng)的主要位點(diǎn)隱藏于內(nèi)部，不易于暴露。解決該問題的常規(guī)方法采用，例如添加二硫蘇糖醇來打開蛋白的空間結(jié)構(gòu)。但該方法存在穩(wěn)定性差，且有氣味等缺陷。因此，現(xiàn)有技術(shù)中的方法一方面對(duì)于試劑盒的靈敏度沒有太大的改善，另一方面還會(huì)造成試劑的不穩(wěn)定，此外，較大的氣味對(duì)于試劑使用者以及環(huán)境，均有一定的傷害。

然而，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用特定的預(yù)處理劑進(jìn)行丙肝抗原預(yù)處理，并將其生物素化后，丙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)靈敏度大大提高了，同時(shí)也確保了試劑的穩(wěn)定性。

本發(fā)明的預(yù)處理丙肝抗原及生物素化丙肝抗原及其制備方法

基于以上的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供一種預(yù)處理的丙肝抗原，所述丙肝抗原經(jīng)預(yù)處理劑處理一段時(shí)間，所述丙肝抗原預(yù)處理劑是4-硝基苯硫酚、或2-巰基乙烷磺酸鈉；優(yōu)選2-巰基乙烷磺酸鈉。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述丙肝抗原預(yù)處理是在丙肝抗原中按照一定比例加入2-巰基乙烷磺酸鈉反應(yīng)，置于2～8℃，反應(yīng)30分鐘。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行丙肝抗原和2-巰基乙烷磺酸鈉預(yù)處理反應(yīng)時(shí)，所述丙肝抗原與2-巰基乙烷磺酸鈉的反應(yīng)濃度分別為0.5～5mg/ml、0.5％～5％(w/v)，優(yōu)選1mg/ml、1％(w/v)。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行丙肝抗原和2-巰基乙烷磺酸鈉預(yù)處理反應(yīng)時(shí)，所述丙肝抗原與2-巰基乙烷磺酸鈉溶液的反應(yīng)的體積比為1:5～1:20，優(yōu)選1:10。

相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了生物素化上文所述預(yù)處理的丙肝抗原的制備方法，所述方法包括以下步驟：

1)在丙肝抗原中加入預(yù)處理劑，反應(yīng)一段時(shí)間；

2)利用生物素交聯(lián)處理后的丙肝抗原；

3)將交聯(lián)后的生物素化丙肝抗原保存于含預(yù)處理劑的稀釋液中。

在具體的實(shí)施方式中，具備優(yōu)異的丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性的本發(fā)明生物素化預(yù)處理丙肝抗原的制備過程中采用以下工藝參數(shù)。

在具體的實(shí)施方式中，所述丙肝抗原預(yù)處理劑是4-硝基苯硫酚、或2-巰基乙烷磺酸鈉；優(yōu)選2-巰基乙烷磺酸鈉。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述丙肝抗原預(yù)處理是在丙肝抗原中按照一定比例加入2-巰基乙烷磺酸鈉反應(yīng)，置于2～8℃，反應(yīng)30分鐘。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行丙肝抗原和2-巰基乙烷磺酸鈉預(yù)處理反應(yīng)時(shí)，所述丙肝抗原與2-巰基乙烷磺酸鈉的反應(yīng)濃度分別為0.5～5mg/ml、0.5％～5％(w/v)，優(yōu)選1mg/ml、1％(w/v)。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行丙肝抗原和2-巰基乙烷磺酸鈉預(yù)處理反應(yīng)時(shí)，所述丙肝抗原與2-巰基乙烷磺酸鈉溶液反應(yīng)的體積比為1:5～1:20，優(yōu)選1:10。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行生物素化丙肝抗原制備時(shí)，所述生物素(biotin)的功能基團(tuán)是氨基、羧基、羥基、或者巰基，優(yōu)選巰基。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述生物素化丙肝抗原制備是將預(yù)處理丙肝抗原與biotin按照一定比例進(jìn)行反應(yīng)，置于2～8℃，10mmpbs透析16～24小時(shí)。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行預(yù)處理丙肝抗原和biotin交聯(lián)時(shí)，所述預(yù)處理丙肝抗原與biotin的反應(yīng)濃度分別為0.5～5mg/ml、0.5～5mg/ml，優(yōu)選1mg/ml、2mg/ml。

在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行預(yù)處理丙肝抗原和biotin交聯(lián)時(shí)，所述預(yù)處理丙肝抗原與biotin的反應(yīng)的摩爾濃度比例為1:5～1:50，優(yōu)選1:15。

本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒

本發(fā)明的生物素化預(yù)處理丙肝抗原可以用于檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體或制備丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒，從而顯著提高檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體時(shí)的靈敏度和穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明還提供了一種丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒裝有本發(fā)明的生物素化預(yù)處理丙肝抗原試劑。

鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定所述肌鈣蛋白i檢測(cè)試劑盒中的其它組分，例如，在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒還可裝有：包被丙肝抗原的微孔板；辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素；陰性對(duì)照；陽性對(duì)照；顯色液a；顯色液b；洗滌液。

相應(yīng)地，本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒中的所述顯色劑a的主要成分為過氧化氫溶液，顯色劑b的主要成分為3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)。

本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒可如下所示進(jìn)行制備，包括：將本發(fā)明的生物素化預(yù)處理丙肝抗原，或本發(fā)明方法制備的生物素化預(yù)處理丙肝抗原制成丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒。

在具體的實(shí)施方式中，所述的生物素化丙肝抗原稀釋液的配方為：10～100mmph7.2～7.8pbs、50～300mmkcl、5～40％牛血清、5～25mmedta·2na、0.05～0.2％2-巰基乙烷磺酸鈉、0.05～0.2％proclin-300。

在具體的實(shí)施方式中，辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈霉親和素的稀釋液的配方為：10～100mmph7.2～7.8tris-hcl、50～300mmnacl、0.5～2％bsa、5～15％甘油、0.05～0.5％吐溫-20、0.05～0.2％proclin-300；所述的在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述的洗滌液配方為：10～100mmph7.2～7.8tris-hcl，50～300mmnacl，0.1～1％吐溫-20，0.05～0.2％proclin-300。

本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒

本發(fā)明的生物素化預(yù)處理丙肝抗原可以用于檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體或制備丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒，從而顯著提高檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體時(shí)的靈敏度和穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明還提供了一種丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒裝有本發(fā)明的生物素化預(yù)處理丙肝抗原試劑。

鑒于本發(fā)明的教導(dǎo)和現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以確定所述肌鈣蛋白i檢測(cè)試劑盒中的其它組分，例如，在具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒還可裝有：鏈霉親和素磁微粒；堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗人igg抗體；定標(biāo)品；化學(xué)發(fā)光底物；洗滌液。

相應(yīng)地，本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒中的所述化學(xué)發(fā)光底物的主要成分為1,2-二氧雜環(huán)丁烷衍生物，為酶促化學(xué)發(fā)光底物。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述1,2-二氧雜環(huán)丁烷衍生物為amppd(3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷)、cdp-star。

相應(yīng)地，本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒中的所述的磁微粒試劑的主要成分是超順磁性微粒，其粒徑為800nm～3μm，主要的活性功能基團(tuán)為羧基、氨基或苯甲磺?；?/p>

本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒可如下所示進(jìn)行制備，包括：將本發(fā)明的生物素化預(yù)處理丙肝抗原，或本發(fā)明方法制備的生物素化預(yù)處理丙肝抗原制成丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒。

在具體的實(shí)施方式中，所述的生物素化丙肝抗原稀釋液的配方為：10～100mmph7.2～7.8pbs、50～300mmkcl、5～40％牛血清、5～25mmedta·2na、0.05～0.2％2-巰基乙烷磺酸鈉、0.05～0.2％proclin-300。

在具體的實(shí)施方式中，堿性磷酸酶標(biāo)記鼠抗人igg抗體的制備方法為戊二醛偶聯(lián)法，具體為：將堿性磷酸酶溶于終濃度5％戊二醛溶液中，室溫靜置過夜，生理鹽水透析后，加入鼠抗人igg抗體，50mmph9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中透析過夜，加入甘氨酸，室溫反應(yīng)2小時(shí)，等體積加入飽和硫酸銨，2～8℃2小時(shí)，4000rpm離心去上清，沉淀溶于50mmph7.40磷酸緩沖液中，對(duì)其透析過夜，加入等體積甘油，置于-20℃保存。

在具體的實(shí)施方式中，所述的磁微粒試劑稀釋液的配方為：10～100mmph7.2～7.8tris-hcl、50～300mmnacl、0.5～2％bsa、2～15％甘油、0.05～0.2％proclin-300；所述的堿性磷酸酶標(biāo)記鼠抗人igg抗體的稀釋液的配方為：10～100mmph7.2～7.8tris-hcl、50～300mmnacl、0.5～2％bsa、5～15％甘油、0.05～0.5％吐溫-20、0.05～0.2％proclin-300；所述的丙型肝炎病毒抗體定標(biāo)品的濃度分別約為2ncu/ml；所述的丙型肝炎病毒抗體定標(biāo)品的稀釋液配方為：10～100mmph7.2～7.8pb，50～300mmnacl，3～8％bsa，3％～10％蔗糖，0.05～0.2％proclin-300；所述的洗滌液配方為：10～100mmph7.2～7.8tris-hcl，50～300mmnacl，0.1～1％曲拉通x-100，0.05～0.2％proclin-300。

本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)方法

在本發(fā)明的生物素化預(yù)處理丙肝抗原以及包含其的丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供一種檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體的方法，所述方法利用本發(fā)明的生物素化預(yù)處理丙肝抗原，或本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血液樣本中的丙型肝炎病毒抗體。

本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，本發(fā)明的丙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)方法可以用于診斷目的，但不限于診斷目的，例如，可用于科研目的等等。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)

1)本發(fā)明的丙肝抗原預(yù)處理工藝采用預(yù)處理劑與丙肝抗原優(yōu)先反應(yīng)，打斷丙肝抗原構(gòu)象中的二硫鍵，改變空間結(jié)構(gòu)，將包含在蛋白內(nèi)部的結(jié)合位點(diǎn)暴露出來，提高結(jié)合丙型肝炎病毒抗體的能力，提高靈敏度；

2)本發(fā)明使用2-巰基乙烷磺酸鈉作為預(yù)處理劑，在改變丙肝抗原的空間結(jié)構(gòu)的前提下，可以有效長(zhǎng)期保持位點(diǎn)的暴露，提高檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體的檢測(cè)穩(wěn)定性；

3)本發(fā)明使用生物素化預(yù)處理丙肝抗原，能夠極大的避免鉤狀效應(yīng)的產(chǎn)生，對(duì)于高濃度的丙型肝炎病毒抗體均無影響；

4)本發(fā)明的試劑盒特異性強(qiáng)；膽紅素、血紅蛋白、乳糜顆粒、類風(fēng)濕因子(rf)、抗核抗體(ana)、人抗鼠抗體(hama)對(duì)丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)結(jié)果均無明顯干擾。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

實(shí)施例

材料與方法

材料

以下實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑購(gòu)自國(guó)藥試劑

堿性磷酸酶購(gòu)自roche

辣根過氧化酶購(gòu)自roche

丙肝抗原購(gòu)自meridian

生物素購(gòu)自thermo。

實(shí)施例1.生物素化預(yù)處理丙肝抗原的制備

1)將丙肝抗原和2-巰基乙烷磺酸鈉分別用ph7.4,20mmpbs稀釋至1mg/ml和1％(w/v)；

2)按照1:10的比例在丙肝抗原中添加2-巰基乙烷磺酸鈉溶液，混勻，置于2～8℃，反應(yīng)30分鐘；

3)用ph7.4,20mmpbs稀釋預(yù)處理的丙肝抗原至1mg/ml；

4)將含有巰基功能團(tuán)的biotin溶解于純化水中，配制成2mg/mlbiotin溶液；

5)按照1:15的比例，在預(yù)處理的丙肝抗原中加入含有巰基功能團(tuán)的biotin溶液；

6)混勻，置于室溫，反應(yīng)30分鐘；

7)置于ph7.4,20mmpbs溶液透析過夜；

8)按體積比1:1加入甘油，混勻，置于-20℃保存，制得生物素化預(yù)處理丙肝抗原。

實(shí)施例2.丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒的制備

1.生物素化丙肝抗原試劑的制備

生物素化丙肝抗原試劑稀釋液配方：

將生物素化丙肝抗原用稀釋液稀釋至0.2μg/ml，室溫充分混勻至少30分鐘，制得生物素化丙肝抗原試劑。

2.鏈霉親和素酶試劑的制備

鏈霉親和素酶試劑稀釋液配方：

將辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素用酶稀釋液稀釋至1:1000～1:5000，室溫充分混勻至少30分鐘，制得鏈霉親和素酶試劑。

3.洗滌液的制備

洗滌液配方：

按配方配制洗滌液，室溫充分混勻至少30分鐘，制得洗滌液。

4.丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)方法

1)加入50μl血清或血漿樣本、50μl生物素化丙肝抗原試劑至已包被抗原的微孔板中；

2)37℃反應(yīng)60分鐘；

3)去上清液，加入300μl洗滌液；

4)重復(fù)步驟3)4次；

5)去上清液，加入100μl酶試劑；

6)37℃反應(yīng)30分鐘；

7)去上清液，加入300μl洗滌液；

8)重復(fù)步驟7)2次；

9)去上清液，加入50μl顯色劑a和50μl顯色劑b；

10)37℃下反應(yīng)30分鐘；

11)加入50μl終止液，讀od值。

實(shí)施例3.丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒的制備

1.鏈霉親和素磁微粒試劑的制備

鏈霉親和素磁微粒試劑稀釋液配方：

將鏈霉親和素磁微粒用磁微粒稀釋液稀釋至0.5mg/ml，室溫充分混勻至少30分鐘，制得肌鈣蛋白i磁微粒試劑。

2.堿性磷酸酶標(biāo)記鼠抗人igg抗體的制備

1)將堿性磷酸酶溶于終濃度5％戊二醛溶液中，使得堿性磷酸酶的濃度為10mg/ml；

2)室溫靜置過夜；

3)用生理鹽水(體積比大于1:200)透析至少4小時(shí)；

4)取出透析后的堿性磷酸酶，按照質(zhì)量1:1的比例加入鼠抗人igg抗體，充分混勻；

5)50mmph9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液中透析過夜；

6)取出透析液，按照體積比1:1000加入1m甘氨酸溶液，混勻，終止反應(yīng)2小時(shí)；

7)等體積加入飽和硫酸銨，2～8℃保存2小時(shí)；

8)4000rpm離心去上清，沉淀溶于50mmph7.40磷酸緩沖液中；

9)50mmph7.40磷酸緩沖液中透析過夜；

10)取出透析液加入等體積的甘油，制得堿性磷酸酶標(biāo)記鼠抗人igg抗體，置于-20℃保存。

3.酶試劑的制備

酶試劑稀釋液配方：

將堿性磷酸酶標(biāo)記鼠抗人igg抗體用酶稀釋液稀釋至1:1000～1:5000，室溫充分混勻至少30分鐘，制得酶試劑。

4.生物素化丙肝抗原試劑的制備

生物素化丙肝抗原試劑稀釋液配方：

將生物素化丙肝抗原用稀釋液稀釋至0.2μg/ml，室溫充分混勻至少30分鐘，制得生物素化丙肝抗原試劑。

5.洗滌液的制備

洗滌液配方：

按配方配制洗滌液，室溫充分混勻至少30分鐘，制得洗滌液。

6.丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法的檢測(cè)方法

1)加入10μl血清或血漿樣本、50μl磁微粒試劑、50μl生物化丙肝抗原試劑；

2)37℃反應(yīng)15分鐘；

3)磁吸后去上清液，加入300μl洗滌液；

4)重復(fù)步驟3)2次；

5)磁吸后去上清液，加入150μl酶試劑；

6)37℃反應(yīng)15分鐘；

7)磁吸后去上清液，加入300μl洗滌液；

8)重復(fù)步驟7)2次；

9)磁吸后去上清液，加入300μl化學(xué)發(fā)光底物；

10)37℃下反應(yīng)10分鐘；

11)光電倍增管(pmt)讀取相對(duì)發(fā)光單位(rlu)，自動(dòng)計(jì)算結(jié)果。

實(shí)施例4.丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒參考品結(jié)果

利用實(shí)施例2制備的丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)經(jīng)國(guó)家參考品標(biāo)化的丙型肝炎病毒抗體企業(yè)內(nèi)部參考品，檢測(cè)結(jié)果如下。

企業(yè)內(nèi)部參考品的陰性符合率為30/30，陽性符合率為30/30。

實(shí)施例5.丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒參考品結(jié)果

利用實(shí)施例3制備的丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒檢測(cè)經(jīng)國(guó)家參考品標(biāo)化的丙型肝炎病毒抗體企業(yè)內(nèi)部參考品，檢測(cè)結(jié)果如下。

企業(yè)內(nèi)部參考品的陰性符合率為30/30，陽性符合率為30/30。

實(shí)施例6.本發(fā)明的試劑盒與現(xiàn)有進(jìn)口試劑盒的臨床比對(duì)結(jié)果

本發(fā)明人利用本發(fā)明實(shí)施例2制備的丙型肝炎病毒抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑盒和實(shí)施例3制備的丙型肝炎病毒抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒以及市售可得的丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)定試劑盒(abbott公司)對(duì)共2059例臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，并通過spss19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行一致性分析。

對(duì)2059例樣本測(cè)定結(jié)果，按照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)，將參比試劑(abbott公司丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)定試劑盒)和考核試劑(本發(fā)明所述酶聯(lián)免疫法試劑盒、化學(xué)發(fā)光法試劑盒)測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行四格表分析，統(tǒng)計(jì)分析如下：

考核試劑(酶聯(lián)免疫法試劑盒)與參比試劑的陽性符合率(ppa)為100％(652/652)(95％置信區(qū)間為99.41％～100％)，陰性符合率(npa)為100％(1407/1407)(95％置信區(qū)間為99.73％～100％)，總符合率(opa)為100％(2059/2059)(95％置信區(qū)間為99.81％～100％)。

本次測(cè)定結(jié)果的kappa值為1>0.75，p<0.05，故可以認(rèn)為兩種試劑測(cè)定的結(jié)果存在較高的一致性。

現(xiàn)有的abbott公司的丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)定試劑盒是目前臨床上用于丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)市場(chǎng)份額最高的產(chǎn)品之一，其試劑盒的臨床性能已被臨床廣泛接受。本發(fā)明所述的試劑盒在臨床試驗(yàn)比對(duì)中，與進(jìn)口試劑的結(jié)果一致性高度吻合，因此，本發(fā)明的試劑盒能滿足目前市場(chǎng)上對(duì)丙型肝炎病毒抗體檢測(cè)的需求，且生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于該試劑盒。

對(duì)比例1.預(yù)處理對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

為驗(yàn)證本發(fā)明的使用預(yù)處理劑處理丙肝抗原的方法可以提高丙型肝炎病毒抗體弱陽性樣本的檢出能力，本發(fā)明人比較了預(yù)處理前后丙肝抗原對(duì)弱陽性樣本的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果明顯發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理后的丙肝抗原有著顯著的提升效果，能提高試劑靈敏度，降低漏檢風(fēng)險(xiǎn)。

從上表所示結(jié)果可以看出，未利用2-巰基乙烷磺酸鈉進(jìn)行預(yù)處理的弱陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)得到結(jié)果出現(xiàn)顯著的假陰性；而利用2-巰基乙烷磺酸鈉進(jìn)行預(yù)處理的弱陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)得到結(jié)果為陽性。

因此，作為丙肝抗原的預(yù)處理劑，使用本發(fā)明的預(yù)處理劑預(yù)處理的弱陽性樣本的檢測(cè)靈敏度顯著提高。

對(duì)比例2.不同預(yù)處理劑預(yù)處理丙肝抗原對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

本發(fā)明人進(jìn)一步比較了本發(fā)明的預(yù)處理劑與傳統(tǒng)的預(yù)處理劑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

通過比較本發(fā)明的預(yù)處理劑，2-巰基乙烷磺酸鈉與傳統(tǒng)的預(yù)處理劑，二硫蘇糖醇進(jìn)行預(yù)處理的試劑穩(wěn)定性結(jié)果，可以明顯發(fā)現(xiàn)，使用2-巰基乙烷磺酸鈉作為丙肝抗原預(yù)處理劑，能夠持續(xù)保持弱陽性的檢出，穩(wěn)定性明顯優(yōu)于利用二硫蘇糖醇進(jìn)行預(yù)處理所得的結(jié)果。

從上表所示結(jié)果可以看出，利用二硫蘇糖醇進(jìn)行預(yù)處理的弱陽性樣本在保持6個(gè)月后，進(jìn)行檢測(cè)得到顯著的假陰性結(jié)果；而利用2-巰基乙烷磺酸鈉進(jìn)行預(yù)處理的弱陽性樣本在保持6個(gè)月，甚至12個(gè)月后，進(jìn)行檢測(cè)得到結(jié)果均為陽性。

因此，作為丙肝抗原的預(yù)處理劑，本發(fā)明使用的預(yù)處理劑相比于傳統(tǒng)的處理劑(二硫蘇糖醇)，試劑穩(wěn)定性顯著更優(yōu)。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。