本發(fā)明涉及d-二聚體含量檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是一種測(cè)定d-二聚體含量中化學(xué)發(fā)光板的包被方法。
背景技術(shù)：
：目前，d-二聚體的含量檢測(cè)是深靜脈血栓，肺栓塞，彌漫性血管內(nèi)凝血等疾病的關(guān)鍵指標(biāo)。這些疾病會(huì)造成體內(nèi)凝血系統(tǒng)或纖溶系統(tǒng)的激活，從而造成d-二聚體水平的升高，而且這種凝血系統(tǒng)或纖溶系統(tǒng)的激活與疾病的病期、嚴(yán)重程度、治療情況密切相關(guān)，因而在這些疾病中檢測(cè)d-二聚體的水平，可以作為疾病分期、判斷預(yù)后和指導(dǎo)治療的一項(xiàng)評(píng)判標(biāo)志。目前，應(yīng)用較多的d-二聚體檢測(cè)方法主要有：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、乳膠顆粒凝集試驗(yàn)、免疫過濾膠體金染色法、雙抗體rbc凝集法和放免法。臨床最常用的是：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、乳膠顆粒凝集試驗(yàn)和免疫過濾膠體金染色法，其中乳膠顆粒凝集試驗(yàn)法測(cè)定速度快，但敏感度不如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法敏感度高，但檢測(cè)時(shí)耗時(shí)較長?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析是靈敏度較高的一種檢測(cè)技術(shù)，其具有標(biāo)記物穩(wěn)定性好，無污染，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，該方法能夠很好的彌補(bǔ)上述其他方法的不足。包被抗體的化學(xué)發(fā)光板是化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)試劑盒中重要的一部分，它是檢測(cè)d-二聚體含量的基體，對(duì)于該發(fā)光板包被的處理能夠反應(yīng)該檢測(cè)試劑盒的性能指標(biāo)。該檢測(cè)試劑盒的性能指標(biāo)的準(zhǔn)確度和靈敏度等性能的好壞，對(duì)于血清中d-二聚體含量的測(cè)定發(fā)揮重要的作用，能為臨床診斷、監(jiān)測(cè)治療提供科學(xué)依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種測(cè)定d-二聚體含量中化學(xué)發(fā)光板的包被方法，該化學(xué)發(fā)光板的包被方法能夠準(zhǔn)確地對(duì)血清中d-二聚體的含量進(jìn)行定量定性分析，該化學(xué)發(fā)光板的包被方法能夠提升檢測(cè)試劑盒的性能指標(biāo)，使其具有較高的靈敏度，較寬的線性范圍等特點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種測(cè)定d-二聚體含量中化學(xué)發(fā)光板的包被方法，其特征在于，包括以下步驟：①制備包被過程中的使用液，該使用液包括包被液、清洗液、復(fù)合酶液、偶聯(lián)液、保護(hù)液，所述包被液由15mm的ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液、2.5ug/ml的d-二聚體抗體、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％的brij-35、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的甘油、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03％的pc-300組成；所述2.5ug/ml的d-二聚體抗體制備過程如下：選取d-二聚體抗體，加入50微升復(fù)合酶液，酶切過程中溫度條件為37℃，時(shí)間為2h；所述清洗液由15mm的ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03％的tween-80組成；所述復(fù)合酶液是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶組成，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比例為0.5:0.1；所述偶聯(lián)液采用2mm的n,n’-羰基二咪唑的醇溶液；所述保護(hù)液采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60％的甘油-磷酸鹽緩沖液；②選取材質(zhì)為96孔白色不透明的聚苯乙烯微孔板，③聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的偶聯(lián)液，室溫條件下孵育30min，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；④聚苯乙烯微孔板的每孔再加入100微升的包被液，偶聯(lián)過程中溫度條件為室溫，時(shí)間為1.5h，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；⑤再在聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的保護(hù)液，低溫，風(fēng)干。采用上述方案，本發(fā)明的發(fā)光板的包被方法對(duì)于某些干擾物有較好的抵抗能力，如類風(fēng)濕因子等，其靈敏度高、簡便快速、抗干擾能力強(qiáng)，在d-二聚體含量的測(cè)定中發(fā)揮重要作用，能夠?yàn)榕R床診斷、監(jiān)測(cè)治療提供科學(xué)依據(jù)。下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。附圖說明附圖1為本發(fā)明具體實(shí)施例6試劑方法與參考方法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)分析圖，采用化學(xué)發(fā)光儀，對(duì)40個(gè)血清樣本進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)分析。其中相關(guān)系數(shù)：r2＝0.996，線性方程為：y＝1.008x-0.004。具體實(shí)施方式本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述具體實(shí)施方式，本領(lǐng)域一般技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，可以采用其他多種具體實(shí)施方式實(shí)施本發(fā)明的，或者凡是采用本發(fā)明的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)和思路，做簡單變化或更改的，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的具體實(shí)施例所采用的測(cè)定d-二聚體含量中化學(xué)發(fā)光板的包被方法，其包括以下步驟：①制備包被過程中的使用液，該使用液包括包被液、清洗液、復(fù)合酶液、偶聯(lián)液、保護(hù)液，其中，包被液由15mm的ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液、2.5ug/ml的d-二聚體抗體、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％的brij-35、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％的蔗糖、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％的甘油、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03％的pc-300組成；所述2.5ug/ml的d-二聚體抗體制備過程如下：選取d-二聚體抗體，加入50微升復(fù)合酶液，酶切過程中溫度條件為37℃，時(shí)間為2h；所述清洗液由15mm的ph＝7.4的磷酸鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03％的tween-80組成；所述復(fù)合酶液是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶組成，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的質(zhì)量比例為0.5:0.1；所述偶聯(lián)液采用2mm的n,n’-羰基二咪唑的醇溶液；所述保護(hù)液采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60％的甘油-磷酸鹽緩沖液；②選取材質(zhì)為96孔白色不透明的聚苯乙烯微孔板，③聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的偶聯(lián)液，室溫條件下孵育30min，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；④聚苯乙烯微孔板的每孔再加入100微升的包被液，偶聯(lián)過程中溫度條件為室溫，時(shí)間為1.5h，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；⑤再在聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的保護(hù)液，低溫，風(fēng)干。具體實(shí)施例1自4℃冰箱中取出d-二聚體的測(cè)定試劑盒，該試劑盒中包括有d-二聚體抗體酶結(jié)合物、d-二聚體抗體包被板、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、濃縮洗滌液、洗滌稀釋液、發(fā)光底物a和發(fā)光底物b，d-二聚體抗體酶結(jié)合物中d-二聚體抗體濃度為2.5ug/ml，d-二聚體抗體包被板為白色不透明的96孔聚苯乙烯塑料板，d-二聚體標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)品濃度分別為0ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，400ng/ml，d-二聚體標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的生理鹽水，質(zhì)控品包括d-二聚體抗原、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的bsa、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9％的氯化鈉、10mm的ph為7.4的磷酸鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％的pc-300，濃縮洗滌溶液包括150mm的ph＝7.0～8.0的磷酸鹽緩沖液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05％的pc-300，150mm的ph＝7.0～8.0的磷酸鹽緩沖液中含有體積分?jǐn)?shù)為0.1％的brij-35，洗滌稀釋液采用由磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀組成的磷酸鹽緩沖液，發(fā)光底物a包括20mm的3-氨基鄰苯二甲酰肼、15g/l的甘氨酸、5mm的硫酸鎂的100mm碳酸鉀，發(fā)光底物b包括體積分?jǐn)?shù)為10％的過氧化氫、15mm的磷酸緩沖液。試劑盒取出后，室溫平衡15分鐘，然后按下表程序進(jìn)行操作：d-二聚體加樣測(cè)定程序表單位：μl注：待測(cè)樣品的濃度計(jì)算按下列方法進(jìn)行：用化學(xué)發(fā)光分析儀中的數(shù)據(jù)處理程序(擬合類型：線性擬合，坐標(biāo)選擇：log(x)-log(y)，實(shí)驗(yàn)方法：夾心法。)直接給出校準(zhǔn)曲線及樣品的濃度值。該包被板的類風(fēng)濕因子干擾試驗(yàn)：板一包被液中的抗體是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照二者的比例為0.5:0.1處理過的；板二包被液中的抗體是由胃蛋白酶處理過的；板三包被液中的抗體是由木瓜蛋白酶處理過的；板四包被液中的抗體是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照二者的比例為0.5:0.3處理過的；板五包被液中的抗體是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照二者的比例為0.5:0.5處理過的；同體積的混合血清分別加入不同濃度的類風(fēng)濕因子，如50u/l，120u/l，150u/l；檢測(cè)結(jié)果如下表。名稱50(u/l)120(u/l)150(u/l)板一49.5120.3159.9板二45.1113.5100.7板三45.9115.199.8板四51.9127.9149.6板五52.9124.1151.2通過試驗(yàn)結(jié)果綜合比較表明，板一的實(shí)際濃度與理論濃度的差異較小，并且在測(cè)定類風(fēng)濕因子小于120u/l時(shí)無干擾。具體實(shí)施例2通過上述具體實(shí)例1的結(jié)果，選擇包被板一繼續(xù)檢測(cè)該包被板的溶血干擾，脂血干擾，膽紅素干擾試驗(yàn)：將15mg/l的血紅蛋白(hb)配制成不同濃度的血紅蛋白(hb)，分別加入同體積的無溶血血清中，檢測(cè)其d-二聚體的含量；將一定濃度的脂肪乳取不同體積加入到相同體積的混合血清中，檢測(cè)其d-二聚體的含量；將一定濃度的膽紅素取不同體積加入到相同體積的混合血清中，檢測(cè)其d-二聚體的含量；檢測(cè)結(jié)果如下表。通過試驗(yàn)結(jié)果綜合比較表明，加入不同濃度干擾物情況下，檢測(cè)目的物質(zhì)實(shí)際濃度與理論濃度的差異比較，當(dāng)血紅蛋白(hb)濃度小于10mg/l，甘油三酯(tg)濃度小于2.50ug/ml，膽紅素濃度小于4.00ug/ml對(duì)d-二聚體的含量檢測(cè)無干擾。具體實(shí)施例3精密度的檢測(cè)：對(duì)化學(xué)發(fā)光板的批內(nèi)精密度和批間精密度的進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如下：批內(nèi)精密度：對(duì)某一血清樣本測(cè)定10次，對(duì)下述數(shù)據(jù)計(jì)算，批內(nèi)精密度差異結(jié)果為1.74％，測(cè)得差異較小。批間精密度：選取3個(gè)不同批次的發(fā)光板，分別對(duì)某一血清樣本測(cè)定10次，結(jié)果如下表格所示，分別算出3批濃度的差異結(jié)果為2.98％，3.09％，1.13％；3個(gè)3個(gè)不同批次的發(fā)光板相比較，差異變化較小。具體實(shí)施例4包被液中抗體酶切條件的篩選：由于類風(fēng)濕因子容易與抗體結(jié)合，對(duì)目的物的測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較多干擾，利用酶切抗體的方式，增強(qiáng)該板的抗干擾能力，對(duì)d-二聚體的含量進(jìn)行測(cè)定，酶切條件和結(jié)果如下表：綜合上述試驗(yàn)結(jié)果表明：酶切條件在37℃，時(shí)間為2h時(shí)，理論濃度與實(shí)際濃度差異最小。具體實(shí)施例5包被過程中偶聯(lián)條件的篩選：由于抗體在結(jié)合過程中的結(jié)合速度受時(shí)間和溫度條件影響較大，為了使操作簡便，提升包被效率，對(duì)d-二聚體的含量進(jìn)行測(cè)定，偶聯(lián)條件和結(jié)果如下表：綜合上述試驗(yàn)結(jié)果表明：偶聯(lián)條件在室溫，時(shí)間為1.5h時(shí)，理論濃度與實(shí)際濃度差異最小。具體實(shí)施例6相關(guān)性檢測(cè)：選取40個(gè)血清樣本，分別用已有酶聯(lián)免疫方法的檢測(cè)試劑盒作為參考方法與上述制備發(fā)光板的檢測(cè)結(jié)果作為試驗(yàn)方法，二者進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示線性關(guān)系良好，檢測(cè)結(jié)果如下：當(dāng)前第1頁12