本發(fā)明屬于一種定量檢測(cè)納米限域空間內(nèi)酶活性的生物傳感技術(shù)，具體涉及一種電學(xué)監(jiān)測(cè)納米限域空間內(nèi)酶催化動(dòng)力學(xué)的裝置及方法，利用納米孔道陣列監(jiān)測(cè)酶在納米限域空間內(nèi)催化沉積。

背景技術(shù)：

酶是廣泛存在生物體內(nèi)的活性物質(zhì)，具有催化效率高、選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于合成、催化、燃料電池等領(lǐng)域。多年來，水溶性酶的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和催化能力是通過溶解在一定成分濃度和溫度緩沖水溶液中來分析它們的結(jié)構(gòu)，研究它們的催化活性。從這個(gè)角度來說，某種經(jīng)純化可溶性酶的體外特性可以用來闡述酶催化特定化學(xué)反應(yīng)能力及反應(yīng)機(jī)制。然而，簡(jiǎn)單緩沖溶液并不能反映酶催化通常發(fā)生在成分復(fù)雜的生物介質(zhì)環(huán)境。大多數(shù)生物體內(nèi)酶催化反應(yīng)發(fā)生在分子擁擠的環(huán)境中或在限域空間內(nèi)，如在表面上，嵌入表面，或在體積小內(nèi)。因此，體內(nèi)感興趣的酶在被綜合模擬時(shí)這些因素是需要被考慮的。傳統(tǒng)的酶活性檢測(cè)是在體外緩沖溶液中進(jìn)行，無法反應(yīng)酶在體內(nèi)空間受限情況的催化性能。離子通道又稱為膜蛋白，嵌入細(xì)胞膜在生命活動(dòng)中扮演至關(guān)重要的角色。受到蛋白質(zhì)通道的啟發(fā)，固態(tài)納米通道相比生物納米通道具有良好的機(jī)械強(qiáng)度，通道大小可調(diào)，容易進(jìn)行功能修飾的優(yōu)點(diǎn)，近年來引起越來越多的研究興趣。在固態(tài)納米通道內(nèi)檢測(cè)酶的活性可以很好地模擬酶在限域空間內(nèi)的催化性能。目前現(xiàn)有的固態(tài)納米通道內(nèi)檢測(cè)酶活性的研究方法主要是基于熒光和電化學(xué)檢測(cè)方法。

現(xiàn)有技術(shù)有的在檢測(cè)端粒酶活性過程中，在鉀離子存在形成g-四聯(lián)體，對(duì)通過納米孔道的指示分子產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。還有的在檢測(cè)疾病相關(guān)的脂肪酸分子和醛類分子采用電化學(xué)阻抗信號(hào)變化。這些檢測(cè)方法都僅對(duì)反應(yīng)前后兩種狀態(tài)的信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，無法對(duì)酶催化反應(yīng)的整個(gè)過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，不能得到酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)。這些檢測(cè)方法無法收集游離產(chǎn)物的實(shí)時(shí)信號(hào)，其檢測(cè)過程也會(huì)受到擴(kuò)散和傳質(zhì)影響，導(dǎo)致信號(hào)收集效率低。因此，結(jié)合納米通道陣列和酶催化沉積的優(yōu)勢(shì)發(fā)展對(duì)酶催化過程進(jìn)行簡(jiǎn)單、靈敏地分析監(jiān)測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)酶動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行分析具有重要的意義，為開發(fā)更為靈敏的檢測(cè)手段提供理論依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種電學(xué)監(jiān)測(cè)納米限域空間內(nèi)酶催化動(dòng)力學(xué)的裝置及方法。本發(fā)明中針對(duì)酶催化生成聚合物，聚合物在納米通道中沉積從而使通道的有效孔徑減小，通過適時(shí)測(cè)定通道離子電流信號(hào)來監(jiān)測(cè)酶催化過程，根據(jù)得到的電流-時(shí)間信號(hào)，計(jì)算出酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

本發(fā)明的目的是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一、一種電學(xué)監(jiān)測(cè)納米限域空間內(nèi)酶催化動(dòng)力學(xué)的裝置：

包括檢測(cè)池腔體和檢測(cè)電極，檢測(cè)池腔體分為進(jìn)樣池腔體和滲透池腔體，進(jìn)樣池腔體和滲透池腔體之間通過打孔石英片連接，所述的石英片設(shè)有中心通孔，中心通孔處安裝修飾酶的多孔陽(yáng)極氧化鋁圓片，進(jìn)樣池腔體和滲透池腔體的腔體上端設(shè)有檢測(cè)電極，檢測(cè)電極下端插入到進(jìn)樣池腔體和滲透池腔體中。

所述的修飾酶的多孔陽(yáng)極氧化鋁圓片通過環(huán)氧樹脂膠固定粘接在中心通孔的一側(cè)所述的孔端面，使得陽(yáng)極氧化鋁圓片的中心和中心通孔的中心重合。

所述的石英片尺寸為20mm*20mm*0.5mm，中心通孔為直徑0.2mm～3mm的圓孔。

所述的檢測(cè)電極采用雙ag/agcl飽和kcl溶液電極。

所述檢測(cè)電極連接到電化學(xué)工作站。

二、一種電學(xué)監(jiān)測(cè)納米限域空間內(nèi)酶催化動(dòng)力學(xué)的方法，包括以下步驟：

(1)在多孔陽(yáng)極氧化鋁(anodicaluminumoxide，aao)納米孔陣列的孔壁上修飾酶；

(2)將修飾酶的多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列固定于打孔石英片的中心通孔，將打孔石英片置于進(jìn)樣池和滲透池之間，制作形成檢測(cè)池；

進(jìn)樣池和滲透池中均加入pbs溶液。

(3)向進(jìn)樣池中加入反應(yīng)底物，觸發(fā)多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列上的修飾酶發(fā)送催化反應(yīng)，并在中心通孔的多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列的納米孔道中生成聚合物，形成沉淀；

(4)利用電學(xué)方法對(duì)通過多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列的納米孔道的通道電流進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，間隔采集到不同時(shí)刻的電流數(shù)據(jù)；

(5)根據(jù)采集到的電流-時(shí)間數(shù)據(jù)擬合繪制電流-時(shí)間關(guān)系曲線，作出lineweaver-burk圖，根據(jù)lineweaver-burk圖計(jì)算得到酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

所述的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括米氏常數(shù)(km)和最大反應(yīng)速度(vmax)。

所述步驟(5)中，在獲得電流-時(shí)間關(guān)系曲線后，對(duì)電流-時(shí)間關(guān)系曲線進(jìn)行歸一化處理，具體方法是以在pbs溶液中穩(wěn)定后的電流平均值作為基準(zhǔn)值，將加入反應(yīng)物前后的電流除以基準(zhǔn)值即得到歸一化曲線，先計(jì)算反應(yīng)初期50s內(nèi)電流下降速率作為酶促反應(yīng)速率v，接著根據(jù)酶促反應(yīng)速率v的倒數(shù)1/v對(duì)反應(yīng)底物濃度s的倒數(shù)1/s作lineweaver-burk圖，lineweaver-burk圖中曲線分別在x和y軸上的截距分別作為米氏常數(shù)(km)和最大反應(yīng)速度(vmax)的倒數(shù)。這兩個(gè)參數(shù)就可以反映酶在納米限域空間內(nèi)催化活性。

所述步驟(1)中所選用的納米通道陣列是采用多孔陽(yáng)極氧化鋁(anodicaluminumoxide，aao)，孔徑為10nm～150nm，優(yōu)選為30nm，使用前裁剪成直徑為0.2mm～10mm的圓片。

所述步驟(1)中的酶采用酶促催化沉積的酶。采用但不限于辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，alp)、尿酶(urease)、漆酶(laccase)或者[辣根過氧化物酶和葡萄糖氧化酶]、[辣根過氧化物酶和膽堿氧化酶]組成的復(fù)合酶體系。

所述步驟(3)中的反應(yīng)底物包括與所用酶對(duì)應(yīng)特異性催化的底物和聚合物基底物。與所用酶對(duì)應(yīng)特異性催化的底物采用但不限于與辣根過氧化物酶hrp對(duì)應(yīng)的過氧化氫(h2o2)、與堿性磷酸酶alp對(duì)應(yīng)的對(duì)硝基苯磷酸二鈉(pnpp)、與尿酶對(duì)應(yīng)的尿素，與漆酶對(duì)應(yīng)的對(duì)苯二酚，葡萄糖氧化酶對(duì)應(yīng)的葡萄糖，膽堿酶對(duì)應(yīng)的乙酰膽堿。所述聚合物基底物為苯二胺。

所述的多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列的孔徑為10nm～150nm。

所述步驟(4)是用兩電極分別置于進(jìn)樣池和滲透池中，在兩電極上加載恒定電壓，電壓范圍為-0.5v～0.5v，通過線性掃描伏安法表征納米通道中催化反應(yīng)電流變化，然后記錄電流-時(shí)間數(shù)據(jù)，獲得聚合物在納米孔道中沉積情況。

所述步驟(4)的電學(xué)方法是采用雙ag/agcl飽和kcl溶液電極進(jìn)行檢測(cè)，雙ag/agcl飽和kcl溶液電極分別置于進(jìn)樣池和滲透池中。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明結(jié)合酶催化效率高和納米通道的優(yōu)勢(shì)，利用監(jiān)測(cè)通道電流的方法直接檢測(cè)限域空間內(nèi)酶催化反應(yīng)活性，不需要復(fù)雜的材料和裝置，制作出簡(jiǎn)易檢測(cè)池，檢測(cè)通道電流信號(hào)來監(jiān)測(cè)酶催化沉積過程，并評(píng)價(jià)納米限域空間內(nèi)催化活性。

本發(fā)明有效避免檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物受外界因素干擾的缺點(diǎn)，具有靈敏度高、檢測(cè)成本低、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)，并且方法快速、高效、成本低。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列修飾hrp過程示意圖。

圖2為實(shí)施例1中hrp、極氧化鋁納米孔陣列和hrp修飾陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列的傅里葉變換紅外光譜圖。

圖3為實(shí)施例1中制作納米孔陣列檢測(cè)裝置示意圖。

圖4為實(shí)施例2中為不同濃度hrp修飾陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列的電壓-電流曲線。

圖5為實(shí)施例2中為加入反應(yīng)物后的電流-時(shí)間曲線。

圖6為實(shí)施例2中反應(yīng)前后驗(yàn)證圖，其中a為反應(yīng)前后掃描電鏡圖，b為反應(yīng)前后的電壓-電流曲線。

圖7為實(shí)施例3中hrp催化鄰苯二胺聚合歸一化后電流-時(shí)間曲線，其中鄰苯二胺濃度為1～20mm，h2o2濃度為6mm。

圖8為實(shí)施例3中鄰苯二胺濃度變化的lineweaver-burk圖。

圖9為實(shí)施例4中hrp催化鄰苯二胺聚合歸一化后電流-時(shí)間曲線，其中鄰苯二胺濃度為20mm，h2o2濃度為0.2～10mm歸一化后的電流-時(shí)間曲線。

圖10為實(shí)施例4中h2o2濃度變化的lineweaver-burk圖。

圖中：檢測(cè)電極1、檢測(cè)池2、石英片3，多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列4，環(huán)氧樹脂膠5。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)描述，但并不是限制本發(fā)明。

本發(fā)明的實(shí)施例如下：

實(shí)施例1：

(1)陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列修飾hrp：

參見圖1，本實(shí)施例以hrp(辣根過氧化物酶)作為所選酶為例，將多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列4裁剪成直徑為3mm的圓片，具體實(shí)施的多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列的來源是商業(yè)化產(chǎn)品，其孔徑為30nm，分別在蒸餾水、乙醇、蒸餾水中清洗浸沒5min，然后用大量的蒸餾水清洗除去表面的污漬和雜質(zhì)，在30％h2o2水溶液中煮沸0.5h使得氧化鋁表面帶上-oh，取出后用氮?dú)獯蹈?，將羥基化的陽(yáng)極氧化鋁浸沒在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5％的3-氨丙基三甲氧基硅烷丙酮溶液中過夜。

為了防止納米通道被阻塞，取出后立即用丙酮充分清，氮?dú)獯蹈?，?20℃中烘烤2h。取出后再放入5％戊二醛水溶液，浸沒過夜，取出后用純水充分清洗。再氮?dú)獯蹈珊?，放入含hrp濃度有500μgml^-1的10mm、ph7.4的pbs溶液中充分振蕩，在4℃左右的冰箱中靜置2h，取出利用蒸餾水充分清洗后，加入10mm的pbs(ph7.4)溶液，置于4℃左右的冰箱中備用。

圖2為hrp、陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列和hrp修飾陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列的傅里葉變換紅外光譜圖，發(fā)現(xiàn)經(jīng)hrp修飾后的aao和hrp在1500cm^-1具有類似的峰，表明hrp很好地修飾在多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列4上。

(2)檢測(cè)池制作：

在20mm*20mm*0.5mm的正方形石英片3中心打圓形的孔，圓孔徑為1mm。

首先將hrp修飾的陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列取出用蒸餾水清洗氮?dú)獯蹈蓚溆茫瑢⒋蚩资⑵謩e在乙醇、蒸餾水中利用超聲波清洗，氮?dú)獯蹈伞?/p>

然后將環(huán)氧樹脂膠5的膠粘劑和固化劑(v/v＝1:1)混合均勻后，取少量混合膠涂在石英片一孔端面周圍，用氮?dú)鈱⒛z均勻吹在孔周圍同時(shí)保證石英孔不被膠堵住。

石英片另一孔端面保持干凈，將修飾hrp酶的多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列圓片放置在涂有環(huán)氧樹脂膠的石英片面上，盡量使得陽(yáng)極氧化鋁圓片中心同石英孔中心重合。

接著，在2ml圓柱形離心管的頂部?jī)蓚?cè)用打孔器分別打一個(gè)直徑約6mm的孔，作為電極插入孔，然后切分為兩部分，一個(gè)作為進(jìn)樣池一個(gè)作為滲透池。再將黏有納米孔陣列的石英片夾在進(jìn)樣池和滲透池之間，并用硅膠將進(jìn)樣池和滲透池黏在石英片上成為檢測(cè)池2，參見圖3。

(3)電化學(xué)檢測(cè)：

在檢測(cè)池的進(jìn)樣池和滲透池中都加入10mmpbs溶液，取兩支ag/agcl飽和kcl電極作為檢測(cè)電極1分別插入進(jìn)樣池和滲透池中，將兩電極接在電化學(xué)工作站上，進(jìn)行電流-電壓曲線的測(cè)量，具體測(cè)量參數(shù)為電勢(shì)范圍-0.05v～0.05v，采樣間隔0.01v。

不同濃度的hrp修飾極氧化鋁納米孔陣列的電壓-電流曲線見圖4，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過hrp修飾后的通道電流輕微降低。

接著進(jìn)行電流-時(shí)間曲線的測(cè)量，待電流穩(wěn)定后，在進(jìn)樣池中加入h2o2和鄰苯二胺混合物，使得h2o2最終濃度為6mm，鄰苯二胺最終濃度為10mm，在具體電流測(cè)量參數(shù)為兩電極之間電位-0.05v，采樣間隔0.1s，采樣時(shí)間為2500s。

以加入h2o2和鄰苯二胺的反應(yīng)物前穩(wěn)定電流平均值作為基線電流，進(jìn)行歸一化處理，不同濃度的hrp修飾陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列的電壓-電流曲線見圖5。從圖5可以看出，500μgml^-1hrp修飾陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列中加入反應(yīng)底物以后，由于酶高效的催化效率，電流在500s內(nèi)從基線電流100％下降到60.65％，下降39.35％，所用的陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列孔徑30nm，厚度60μm，理論計(jì)算出每個(gè)孔的體積約為4.23×10^-13l。

5μgml^-1hrp修飾時(shí)，每個(gè)孔內(nèi)約含有2個(gè)hrp酶分子，即利用此裝置和方法相結(jié)合可以達(dá)到孔內(nèi)單分子檢測(cè)，當(dāng)僅有少量酶時(shí)也能達(dá)到高效檢測(cè)，相比于將酶固定在電極上檢測(cè)的方法，本方法能更靈敏地檢測(cè)產(chǎn)生的信號(hào)。

裝置檢測(cè)成本低，多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列圓片4元，打孔石英片30元，電極180元，進(jìn)樣池和滲透池4元，環(huán)氧樹脂膠2元，共220元，其中除多孔陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列圓片以外，其他材料都可重復(fù)使用，即每次檢測(cè)需要約5元即可，成本低。

hrp催化鄰苯二胺聚合反應(yīng)前后見圖6：圖6(a)為反應(yīng)前后掃描電鏡(scanningelectronmicroscopy,sem)圖，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)前納米孔和通道保持打開的狀態(tài)，反應(yīng)后納米孔被覆蓋，納米通道被聚合物阻塞；圖6(b)為反應(yīng)前后的電壓-電流曲線，兩者差異明顯。由此表明hrp催化反應(yīng)在納米通道陣列中發(fā)生。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例采用與實(shí)施例1相同的檢測(cè)池裝置進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。參考底物采用鄰苯二胺，采用含hrp濃度有500μgml^-1的10mm、ph7.4的pbs溶液對(duì)陽(yáng)極氧化鋁納米孔陣列進(jìn)行修飾。

在實(shí)施例1檢測(cè)池裝置中加入10mmpbs，采用實(shí)施例2中的檢測(cè)方法，進(jìn)行電流-時(shí)間曲線的測(cè)量，待基線電流穩(wěn)定后，在進(jìn)樣池中加入h2o2和鄰苯二胺混合溶液，使得h2o2最終濃度為6mm，鄰苯二胺最終濃度為1～20mm，具體電流測(cè)量參數(shù)為兩電極之間電位-0.05v，采樣間隔0.1s，采樣時(shí)間為2000s；以加入反應(yīng)物前200s穩(wěn)定電流平均值作為基線進(jìn)行歸一化處理，見圖7。

根據(jù)得到不同濃度底物歸一化后的電流-時(shí)間曲線，由于酶高效的催化效率，電流迅速下降產(chǎn)生響應(yīng)信號(hào)，計(jì)算每個(gè)濃度曲線在反應(yīng)發(fā)生后50s內(nèi)電流-時(shí)間線性關(guān)系，得到的系數(shù)即為反應(yīng)速率v，該方法能高效完成信號(hào)檢測(cè)。

接著根據(jù)酶促反應(yīng)速率v的倒數(shù)1/v對(duì)反應(yīng)底物濃度s的倒數(shù)1/s作出lineweaver-burk雙倒數(shù)圖，見圖8，圖中x和y軸上的截距分別代表米氏常數(shù)(km)和最大反應(yīng)速度(vmax)的倒數(shù)，根據(jù)截距算出km為63.80mm和vmax為0.62，這些參數(shù)就可以反映酶在納米限域空間內(nèi)催化活性。

實(shí)施例3：

以h2o2作為參考底物測(cè)定納米限域空間內(nèi)酶催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)，本實(shí)例中用到的試劑和儀器、酶的修飾方法、檢測(cè)裝置、檢測(cè)方法同實(shí)施例2。

進(jìn)行電流-時(shí)間曲線的測(cè)量過程中，待基線電流穩(wěn)定后，在進(jìn)樣池中加入h2o2和鄰苯二胺混合溶液，使得鄰苯二胺最終濃度為20mm，h2o2最終濃度為0.2～10mm，具體電流測(cè)量參數(shù)為兩電極之間電位-0.05v，采樣間隔0.1s，采樣時(shí)間為1500s；以加入反應(yīng)物前200s穩(wěn)定電流平均值作為基線進(jìn)行歸一化處理，見圖9。

根據(jù)得到的不同濃度底物歸一化后的電流-時(shí)間曲線，計(jì)算每個(gè)濃度曲線在反應(yīng)發(fā)生后50s內(nèi)電流-時(shí)間線性關(guān)系，得到的系數(shù)即為反應(yīng)速率v。

接著根據(jù)酶促反應(yīng)速率v的倒數(shù)1/v對(duì)反應(yīng)底物濃度s的倒數(shù)1/s作出lineweaver-burk雙倒數(shù)圖，見圖10，圖中x和y軸上的截距分別代表km和vmax的倒數(shù)，根據(jù)截距算出km為3.65mm和vmax為0.27。

由上述實(shí)施例可見，本發(fā)明制作出了簡(jiǎn)易檢測(cè)池，檢測(cè)通道電流信號(hào)來監(jiān)測(cè)酶催化沉積過程獲得了納米限域空間內(nèi)催化活性，有效避免了檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物受外界因素干擾的缺點(diǎn)，具有靈敏度高、檢測(cè)成本低、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)，并且方法快速、高效、成本低，技術(shù)效果顯著突出。