本發(fā)明屬于檢測領域，尤其涉及一種肌纖維細胞參數(shù)的圖像測量方法。
背景技術：
對肌肉纖維的定量分析可用于評價不同的飼養(yǎng)或成長環(huán)境對于肌肉的影響，也可用于選種等工作。現(xiàn)有的分析方法基本仍然依賴于人工測量，即通過人來觀察顯微鏡下的肌肉樣本，并進行相應的測量，存在著勞動量大、工作效率低、準確性差等問題。有部分文獻中使用了圖像處理軟件來幫助測量，但仍然依賴于人工選擇，勞動量和工作效率等方面沒有大的改觀。
例如在論文《不同圖像分析軟件定量計算肌纖維類型數(shù)量及面積》中，作者使用了imagej、imageproplus和photoshop等圖像處理軟件，通過人工交互的方式，手工選擇肌纖維細胞，然后由圖像處理軟件計算其面積。雖然利用圖像處理軟件計算面積提高了測量的準確性，避免了過去由人估算不規(guī)則形狀的肌纖維細胞的面積時造成的誤差，但是測量過程本質(zhì)上仍然依賴于人工。
在本發(fā)明中，我們在制備了豬肉的肌纖維樣本之后，采集顯微圖像，然后通過圖像處理算法，編寫程序來自動地分割出肌纖維細胞，并在此基礎上完成單個細胞的面積、直徑等參數(shù)的計算，從而實現(xiàn)豬肉肌纖維參數(shù)的自動測量，減少測量的工作量，提高測量的準確度。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種肌纖維細胞參數(shù)的圖像測量方法，本發(fā)明通過圖像處理的方法，能夠自動地完成豬肉肌纖維參數(shù)的測量，勞動量小，工作效率高，結果穩(wěn)定，準確度高，并可避免人工操作中因疲勞或主管判斷因素所引入的錯誤結果。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下所示：
一種肌纖維細胞參數(shù)的圖像測量方法，包括如下步驟:
(1)獲得肌纖維的圖像和圖像的標尺；
(2)肌纖維參數(shù)的圖像測量：
(2.1)將拍攝得到的彩色圖像i轉(zhuǎn)化為灰度圖像g，然后對g進行閾值分割得到二值圖像b1；b1中，深色的肌纖維細胞區(qū)域為黑色，背景區(qū)域為白色；
(2.2)對b1進行連通域標記，然后去除面積小于給定閾值ta1的白色區(qū)域；求取白色區(qū)域去除之后的二值圖像的反色圖像，得到b2；
(2.3)對b2進行連通域標記，得到標記圖像l1，然后去除l1中的貼邊區(qū)域，得到標記圖像l2；
(2.4)去除l2中面積小于給定閾值ta2或大于給定閾值ta3的區(qū)域，得到標記圖像l3；
(2.5)對l3中的每個區(qū)域，計算其面積與凸包面積之比r，去除l3中r值小于給定閾值tacar的區(qū)域，得到標記圖像l4；
(2.6)對l4中的每個區(qū)域，進行孔洞填充，即得肌纖維區(qū)域；
(2.7)根據(jù)肌纖維區(qū)域計算得到肌纖維細胞參數(shù)。
進一步的改進，步驟(2.7)中，所述肌纖維細胞參數(shù)包括肌纖維的實際面積，肌纖維的實際面積計算方法如下：
計算肌纖維區(qū)域的相對面積即肌纖維區(qū)域內(nèi)的像素點個數(shù)ai；根據(jù)圖像中所給的標尺，計算圖像中1像素長度所對應的實際長度s，于是肌纖維的實際面積a＝ai·s2。
進一步的改進，步驟(2.7)中，所述肌纖維細胞參數(shù)包括肌纖維的實際直徑，肌纖維的實際直徑計算方法如下：
提取肌纖維區(qū)域的輪廓，計算輪廓上每對相異點之間的距離，以所有相異點對的距離的最大值為肌纖維的直徑di，單位為像素；據(jù)圖像中所給的標尺，計算圖像中1像素長度所對應的實際長度s，于是肌纖維的實際直徑d＝di·s。
進一步的改進，步驟(2.3)中的貼邊區(qū)域即若某個肌纖維細胞區(qū)域中至少有一個像素點落在了圖像的外緣，即圖像的最上、最下行、最左列或最右列外的區(qū)域，則此肌纖維細胞在圖像l1內(nèi)的區(qū)域稱作貼邊區(qū)域。
進一步的改進，所述肌纖維細胞為豬肉纖維細胞。
進一步的改進，步驟(1)中，肌纖維的圖像通過相機拍攝多個視野的樣本顯微圖像獲得。
進一步的改進，所述樣本通過以下步驟制得：
(1.1)固定：用4％的多聚甲醛固定樣本24小時；
(1.2)脫水：將洗好后的樣品放入為70％、80％、90％、100％、100％的酒精中分別經(jīng)過過夜、8小時、8小時、1小時、1小時浸泡以脫去樣品中的水分；
(1.3)透明：以1:1的二甲苯:無水酒精浸泡1小時，再用二甲苯浸泡1小時，以置換出組織塊中的無水酒精；
(1.4)浸蠟和包埋：將透明好的樣品放入1:1的二甲苯:石蠟中過渡30分鐘，再將其放入裝有石蠟的蠟杯中30分鐘，需在溫箱中將石蠟熔化后進行，溫箱溫度不得高于56℃，將浸好蠟的組織塊放入盛有熔化石蠟的紙盒內(nèi)，使組織塊包埋于石蠟中，迅速放在水盆中，待其冷卻后備用；
(1.5)切片：將制好的組織蠟塊經(jīng)修切后粘附于臺木后用切片機切成6μm厚的薄片，薄片連續(xù)成蠟帶狀；
(1.6)展片和粘片：將切成的蠟帶展于30℃的溫水中，再以1:1的雞蛋清:甘油混合劑為粘附劑，將組織薄片粘附于載玻片上，再將其置于37℃溫箱中烘干，不少于24h；
(1.7)脫蠟復水：將水浴鍋溫度調(diào)至60℃，待水溫控制在60℃時，將切片連同切片架放入一個干燥的染色缸內(nèi)，放入水浴鍋中，蓋上蓋子，30min至蠟熔化；
(1.8)石蠟切片經(jīng)二甲苯ⅰ、ⅱ脫蠟各5min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％各級濃度的酒精溶液中各3-5min，再放入蒸餾水中3min；
(1.9)染色：切片放入蘇木精中染色15min；
(1.10)水洗：用自來水流水沖洗15min；使切片顏色變藍；
(1.11)分化：將切片放入1％鹽酸乙醇液中褪色，2秒至數(shù)十秒鐘；見切片變紅，顏色較淺即可；
(1.12)漂洗：切片再放入自來水流水中使其恢復藍色；
(1.13)脫水?。呵衅?0％乙醇→70％乙醇→80％乙醇中各3-5min；
(1.14)復染：用0.5％伊紅乙醇液對比染色1min；
(1.15)脫水ⅱ：將切片放入95％乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中3-5min；最后用吸水紙吸干多余的乙醇；
(1.16)透明：切片放入二甲苯ⅰ、ⅱ中各3-5min；
(1.17)封藏：中性樹膠封存。
具體實施方式
實施例
本發(fā)明所提方法包括兩個主要階段：豬肉肌肉樣本的制備和圖像獲取階段，以及圖像處理和測量階段。
(1)樣本制備與圖像獲取
(1.1)固定：用4％的多聚甲醛固定樣本24小時。
(1.2)脫水：將洗好后的樣品放入為70％、80％、90％、100％(無水酒精)、100％(無水酒精)的酒精中分別經(jīng)過過夜、8小時、8小時、1小時、1小時浸泡以脫去樣品中的水分。
(1.3)透明：以1:1的二甲苯:無水酒精浸泡1小時，再用二甲苯浸泡1小時，以置換出組織塊中的無水酒精。
(1.4)浸蠟和包埋：將透明好的樣品放入1:1的二甲苯:石蠟中過渡30分鐘，再將其放入裝有石蠟的蠟杯中30分鐘(需在溫箱中將石蠟熔化后進行，溫箱溫度不得高于56℃)。將浸好蠟的組織塊放入盛有熔化石蠟的紙盒內(nèi)，使組織塊包埋于石蠟中，迅速放在水盆中，待其冷卻后備用。
(1.5)切片：將制好的組織蠟塊經(jīng)修切后粘附于臺木后用切片機切成6μm厚的薄片，薄片應該連續(xù)成蠟帶狀。
(1.6)展片和粘片：將切成的蠟帶展于30℃的溫水中，再以1:1的雞蛋清:甘油混合劑為粘附劑，將組織薄片粘附于載玻片上，再將其置于37℃溫箱中烘干(不少于24h)。
(1.7)脫蠟復水：將水浴鍋溫度調(diào)至60℃，待水溫控制在60℃時，將切片連同切片架放入一個干燥的染色缸內(nèi)，放入水浴鍋中，蓋上蓋子(可密封)，30min至蠟熔化。
(1.8)石蠟切片經(jīng)二甲苯ⅰ、ⅱ脫蠟各5min，然后放入100％、95％、90％、80％、70％各級濃度的酒精溶液中各3-5min，再放入蒸餾水中3min。
(1.9)染色：切片放入蘇木精中染色約15min。
(1.10)水洗：用自來水流水沖洗約15min。使切片顏色變藍(或放入堿性水中也可)，但要注意流水不能過大，以防切片脫落。
(1.11)分化：將切片放入1％鹽酸乙醇液中褪色，約2秒至數(shù)十秒鐘。見切片變紅，顏色較淺即可。
(1.12)漂洗：切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。
(1.13)脫水?。呵衅?0％乙醇→70％乙醇→80％乙醇中各3-5min。
(1.14)復染：用0.5％伊紅乙醇液對比染色1min。
(1.15)脫水ⅱ：將切片放入95％乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中3-5min。最后用吸水紙吸干多余的乙醇。
(1.16)透明：切片放入二甲苯ⅰ、ⅱ中各3-5min。
(1.17)封藏：中性樹膠封存
(1.18)獲取圖像：將樣本置于顯微鏡下，通過相機拍攝多個視野的樣本顯微圖像，圖像中應加入標尺。
(2)肌纖維參數(shù)的圖像測量
(2.1)將拍攝得到的彩色圖像i轉(zhuǎn)化為灰度圖像g，然后對g進行閾值分割得到二值圖像b1。b1中，深色的肌纖維細胞區(qū)域為黑色，背景區(qū)域為白色；
(2.2)對b1進行連通域標記，然后去除面積小于給定閾值ta1的那些白色區(qū)域。求取區(qū)域去除之后的二值圖像的反色圖像，得到b2；
(2.3)對b2進行連通域標記，得到標記圖像l1，然后去除l1中的貼邊區(qū)域，即區(qū)域中至少有一個像素點落在了圖像的外緣(即圖像的最上和最下行以及最左和最右列)上，得到標記圖像l2；貼邊區(qū)域即指個別肌纖維細胞不是全部在圖像l1的范圍內(nèi)，而是一部分在圖像l1內(nèi)，另一部分在圖像l1外，在圖像l1內(nèi)的那部分不完整的肌纖維細胞區(qū)域即所說的貼邊區(qū)域。
(2.4)去除l2中面積小于給定閾值ta2或大于給定閾值ta3的區(qū)域，得到標記圖像l3；
(2.5)對l3中的每個區(qū)域，計算其面積與凸包面積之比r，去除l3中r值小于給定閾值tacar的區(qū)域，得到標記圖像l4；
(2.6)對l4中的每個區(qū)域，對其進行孔洞填充，即得豬肉的肌纖維區(qū)域；
(2.7)計算肌纖維區(qū)域的面積(即像素點個數(shù))ai；
(2.8)提取肌纖維區(qū)域的輪廓，計算輪廓上每對相異點之間的距離，以所有這些點對的距離的最大值為肌纖維的直徑(以像素為單位)di；
(2.9)根據(jù)圖像中所給的標尺，計算圖像中1像素長度所對應的實際長度s，于是肌纖維的實際面積為a＝ai·s2，實際直徑為d＝di·s。
本發(fā)明雖然是針對豬肉的肌纖維參數(shù)測量所提，但是如果是其他肉類的肌纖維參數(shù)測量，如果這些肉類的肌纖維形態(tài)與豬肉的類似，則本發(fā)明的方法同樣適用，因此應視為本發(fā)明所涵蓋的范圍。
本發(fā)明所指的肌纖維參數(shù)，主要指肌纖維橫斷面的面積和直徑測量。
如上所述，對本發(fā)明的實施實例進行了詳細的說明，但只要實質(zhì)上沒有脫離本發(fā)明的特點及效果，是可以有很多變形的，這對本領域的技術人員來說是顯而易見的，因此，這些變形的實例也全部包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。