本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因生物領(lǐng)域，特別涉及一種用于提高轉(zhuǎn)基因鼠生產(chǎn)hngf效率的注射液及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

90年代國(guó)內(nèi)外多家藥物研究機(jī)構(gòu)和制藥公司相繼開始了對(duì)藥用神經(jīng)生長(zhǎng)因子(hngf)的研發(fā)利用，有文獻(xiàn)報(bào)道顯示從牛精液、蛇毒、豚鼠前列腺、人唾液、血液、尿液、豬腦、牛腦等組織器官體液中均提取并純化得到了神經(jīng)生長(zhǎng)因子(lippsbvetal.，2000、iglesias-rodríguezpetal.，1959)。但由于成年雄性小鼠頜下腺中神經(jīng)生長(zhǎng)因子在自然界中含量最高且提取工藝簡(jiǎn)單，提取所得神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性較高，此后很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子的結(jié)構(gòu)、生物合成以及生物學(xué)活性的研究及其藥物的研發(fā)主要集中在鼠頜下腺提取的神經(jīng)生長(zhǎng)因子蛋白上，攻克了提取、分離、純化、含量控制等難題。2002年，小鼠頜下腺來源的注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物--恩經(jīng)復(fù)，成為世界上第一個(gè)上市的神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物。目前我國(guó)已開發(fā)上市“恩經(jīng)復(fù)”、“金路捷”和“蘇膚生”等小鼠頜下腺提純的神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物，并廣泛應(yīng)用于臨床上治療視神經(jīng)損傷等各種神經(jīng)退行性疾病。隨著這些注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物的開發(fā)上市，人們對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的療效作用研究也進(jìn)入了一個(gè)全新的階段。

然而鼠源神經(jīng)生長(zhǎng)因子(mngf)與人源神經(jīng)生長(zhǎng)因子(hngf)在生物化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)功能上顯著不同。注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子在臨床治療上有非常嚴(yán)重的注射局部疼痛現(xiàn)象，可能在使用鼠源神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療時(shí)，誘導(dǎo)患者對(duì)該外源蛋白的免疫原性應(yīng)答。最近有研究表明，在使用人胎腦和sd大鼠腦中提取的β—ngf培養(yǎng)pc12細(xì)胞時(shí)，發(fā)現(xiàn)人胎腦提取的β—ngf比sd大鼠腦中提取的β—ngf對(duì)pc12細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞分化能力(郝福榮等，2001)，當(dāng)比較人神經(jīng)生長(zhǎng)因子與鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的蛋白結(jié)構(gòu)、生理功能和生物學(xué)活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，人神經(jīng)生長(zhǎng)因子具有更強(qiáng)的促神經(jīng)細(xì)胞增殖分化等生物學(xué)活性和更強(qiáng)的抗降解能力(paoletti,fetal.，1854)。

因此從長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展角度和人文關(guān)懷角度來看，從小鼠頜下腺提取ngf制備注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物的方法有待改善，各大藥物研究機(jī)構(gòu)和制藥公司轉(zhuǎn)向?qū)χ亟M人神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物的研發(fā)和制備進(jìn)行了大量的探索。非常有必要生產(chǎn)起效快、生物利用度高、半衰期更長(zhǎng)的人神經(jīng)生長(zhǎng)因子，最大程度地維持有效治療濃度，確保更多活性的人神經(jīng)生長(zhǎng)因子被人體吸收、利用，以代替目前使用的注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子藥物，從而發(fā)揮更強(qiáng)的醫(yī)學(xué)藥理學(xué)作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種提高轉(zhuǎn)基因鼠生產(chǎn)hngf效率的注射液，另一個(gè)目的是提供一種該注射液的使用方法。本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供該注射液在提高轉(zhuǎn)基因鼠唾液的分泌量、唾液中總蛋白質(zhì)的濃度、唾液中hngf濃度以及唾液中hngf分泌量方面的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于提高轉(zhuǎn)基因鼠生產(chǎn)hngf效率的注射液，其有效成分為腎上腺素、去甲腎上腺素、毛果蕓香堿或者異丙腎上腺素其中一種。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了該用于提高轉(zhuǎn)基因鼠生產(chǎn)hngf效率的注射液的使用方法，采取頸部肌肉注射的方式，且其注射對(duì)象為性成熟后的轉(zhuǎn)基因鼠，所述性成熟后的轉(zhuǎn)基因鼠為大于等于63日齡的轉(zhuǎn)基因公鼠。

進(jìn)一步地，注射劑量為腎上腺素4μg/g、去甲腎上腺素0.6μg/g、毛果蕓香堿0.5μg/g或者異丙腎上腺素0.25μg/g。

進(jìn)一步地，在注射后20min內(nèi)收集轉(zhuǎn)基因鼠的唾液。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了該用于提高轉(zhuǎn)基因鼠生產(chǎn)hngf效率的注射液用于提高轉(zhuǎn)基因鼠唾液的分泌量的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了該用于提高轉(zhuǎn)基因鼠生產(chǎn)hngf效率的注射液用于提高轉(zhuǎn)基因鼠唾液中總蛋白質(zhì)的濃度的應(yīng)用，其中，該注射液的有效成分為腎上腺素或者異丙腎上腺素其中一種。

根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了該用于提高轉(zhuǎn)基因鼠生產(chǎn)hngf效率的注射液用于提高轉(zhuǎn)基因鼠唾液中hngf濃度的應(yīng)用，其中，該注射液的有效成分為異丙腎上腺素。

根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，提供了該用于提高轉(zhuǎn)基因鼠生產(chǎn)hngf效率的注射液用于提高轉(zhuǎn)基因鼠唾液中hngf分泌量的應(yīng)用，其中，該注射液的有效成分為毛果蕓香堿或者異丙腎上腺素其中一種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，該用于提高轉(zhuǎn)基因鼠生產(chǎn)hngf效率的注射液具有以下有益效果：

(1)能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因公鼠唾液分泌量以及hngf分泌量；

(2)能夠顯著提高性成熟后的轉(zhuǎn)基因鼠唾液分泌量以及hngf分泌量；

(3)選擇性成熟后的轉(zhuǎn)基因公鼠并在注射20min后收集其唾液進(jìn)行hngf蛋白純化可顯著提高生產(chǎn)人神經(jīng)生長(zhǎng)因子蛋白的效率。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1主要試劑、耗材：

c57bl-6小鼠、鼠籠、鼠架、普通級(jí)小鼠維持飼料、小鼠墊料購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；pmsg、hcg購(gòu)自寧波第二激素廠；pcr管購(gòu)自axygen公司；普通pcr用taq酶購(gòu)自廣州東盛生物科技公司；溴化乙錠(ethidiumbromide，eb)購(gòu)自北京天澤生物制品有限公司；瓊脂糖購(gòu)自invitrogen公司；氨水購(gòu)自成都科龍化工試劑廠；humanbeta-ngfelisa試劑盒、mousebeta-ngfelisa試劑盒購(gòu)自武漢尹艾博科技有限公司；dna抽提試劑盒購(gòu)自美國(guó)omega公司；dl500dnamarker購(gòu)自日本takara公司；一次性10ml注射器購(gòu)自上海聚民生物科技有限公司；毛果云香堿購(gòu)自美國(guó)sigma公司；腎上腺素；鹽酸異丙腎上腺素購(gòu)自北京solarbio公司；重酒石酸去甲腎上腺素購(gòu)自天津金藥業(yè)有限公；bca蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2主要儀器設(shè)備：

熒光燈(bls公司，中國(guó))；

微量移液器(eppendorf，德國(guó))；

微量核酸濃度儀(nanodrop2000，thermo，美國(guó))；

milli-q超純水純化系統(tǒng)(millipoe公司，美國(guó))；

pcr儀(美國(guó)life公司)；

電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；

電熱恒溫水浴鍋(dk-s24，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；

水平電泳槽及電泳儀(北京市六一儀器廠，中國(guó))；

凝膠成像系統(tǒng)(uvp，美國(guó))；

-80℃超低溫冰箱(thermo，美國(guó))；

-20℃超低溫冰箱(中科美菱)；

4℃低溫冰箱(中科美菱)；

制冰機(jī)(廣州市深華生物技術(shù)有限公司)；

電子秤(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))；

多通道移液器(eppendorf，德國(guó))；

lrh-70生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；

酶標(biāo)儀(synergy美國(guó)伯騰儀器有限公司)。

1.3分析軟件

pcr引物設(shè)計(jì)及分析軟件：primerpremier6.0

數(shù)據(jù)分析軟件：excel、spass19.0

2轉(zhuǎn)基因鼠唾液的收集

將轉(zhuǎn)基因鼠分別分為性成熟前(≤30天齡)和性成熟后(≥60天齡)的轉(zhuǎn)基因鼠，再按分別分為公母分為四組，每組四只。

毛果蕓香堿處理組：捏起轉(zhuǎn)基因鼠頸下皮膚肌肉注射，采用文獻(xiàn)(wallaceljetal.，1976)報(bào)道的方法，注射毛果蕓香堿0.5μg/g，注射后采集20min內(nèi)小鼠唾液。

同時(shí)將另一批轉(zhuǎn)基因鼠分組為未注射刺激物組、腎上腺素處理組、去甲腎上腺素處理組和異丙腎上腺素處理組，注射方法同上。其中注射劑量為腎上腺素4μg/g、去甲腎上腺素0.6μg/g、異丙腎上腺素0.25μg/g、未注射組不注射任何刺激物，處理后分別采集20min內(nèi)轉(zhuǎn)基因鼠的唾液。

用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因鼠唾液中hngf的濃度，用bca法檢測(cè)唾液總蛋白濃度。

3轉(zhuǎn)基因鼠唾液中總蛋白濃度測(cè)定

⑴：稀釋bsa標(biāo)準(zhǔn)品：用0.9％的生理鹽水稀釋標(biāo)準(zhǔn)品如下

⑵：配置bca工作液

①計(jì)算bca工作液總量:bca工作液總量＝(bsa標(biāo)準(zhǔn)品樣本個(gè)數(shù)+未知唾液樣本個(gè)數(shù))*復(fù)孔數(shù)*每個(gè)樣本bca工作體積

②根據(jù)計(jì)算出的bca工作液需要總量：將bca-a液和bca-b液按照50：1的體積比，配置bca工作液，充分混勻。

⑶：定量檢測(cè)：微孔檢測(cè)法(蛋白濃度檢測(cè)范圍為20-2000μg/ml)

①按上表，將稀釋好的a-gbsa標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)準(zhǔn)備好的唾液蛋白樣品各25μl分別加到作好標(biāo)記的試管中；

②每孔加入200μlbca工作液，充分混勻，蓋上96孔板蓋，37℃溫育30min，冷卻至室溫，3-5min內(nèi)完成檢測(cè)；

③用酶標(biāo)儀在540nm-590nm范圍內(nèi)，測(cè)定bsa標(biāo)準(zhǔn)品和每個(gè)樣品的吸光值；

④繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算唾液樣品中的蛋白濃度。

4轉(zhuǎn)基因鼠唾液中mngf濃度的測(cè)定

①標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：以樣品稀釋液稀釋標(biāo)準(zhǔn)品至1ml，蓋好后靜置10min以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為1000pg/ml，分別稀釋成500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.2pg/ml，15.6pg/ml，其原液直接作為最高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度為0pg/ml。

②樣品稀釋：所有樣品均500倍稀釋后，取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)樣品溶液各100μl加入酶標(biāo)孔里，酶標(biāo)板蓋上蓋，37℃溫育120min。設(shè)置復(fù)孔；

③棄去液體，甩干酶標(biāo)板，每孔直接添加檢測(cè)溶液a工作液100μl(在使用前半小時(shí)內(nèi)配制，輕輕晃動(dòng)混勻)，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育60min；

④棄去液體，甩干酶標(biāo)板，重復(fù)洗板3次，每次浸泡1-2min，大約400μl/孔，甩干酶標(biāo)板；

⑤每孔加檢測(cè)溶液b工作液100μl(在使用前半小時(shí)內(nèi)配制，輕輕晃動(dòng)混勻)，酶標(biāo)板加上覆膜37℃溫育60min；

⑥棄去液體，甩干酶標(biāo)板，洗板5次，每次浸泡1-2min，大約400μl/孔，甩干；

⑦依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光溫育30min；

⑧依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)；

⑨立即檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處各孔的od值。

⑩繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算唾液樣品中mngf濃度。

5轉(zhuǎn)基因鼠唾液中hngf濃度的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方法同上，轉(zhuǎn)基因鼠唾液樣品稀釋，其余操作同上。

6數(shù)據(jù)處理及分析

以下將各項(xiàng)數(shù)據(jù)列表進(jìn)行分析。

表1注射刺激物對(duì)性成熟前(28d)轉(zhuǎn)基因鼠的唾液分泌量

由表1可知，與未注射刺激物組相比，注射毛果蕓香堿、腎上腺素、異丙腎上腺素、去甲腎上腺素都可以顯著提高轉(zhuǎn)基因鼠唾液的分泌量。

表2注射刺激物對(duì)性成熟后(63d)轉(zhuǎn)基因鼠的唾液分泌量

由表2可知，與未注射刺激物組相比，注射腎上腺素或去甲腎上腺素對(duì)小鼠唾液的分泌沒有顯著影響，但注射毛果蕓香堿和異丙腎上腺素能夠顯著提高小鼠唾液的分泌量。

表3注射刺激物對(duì)性成熟后(63d)轉(zhuǎn)基因鼠唾液的總蛋白濃度

由表3可知，與未注射刺激物組相比，注射去甲腎上腺素對(duì)小鼠唾液中總蛋白濃度沒有顯著影響，注射毛果蕓香堿顯著降低小鼠唾液中總蛋白濃度，注射腎上腺素和異丙腎上腺素顯著提高小鼠唾液中總蛋白的濃度；

表4注射刺激物對(duì)性成熟后(63d)轉(zhuǎn)基因鼠唾液的hngf濃度

由表4可知，與未注射刺激物組相比，注射去甲腎上腺素對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠唾液中hngf的濃度沒有顯著影響，注射毛果蕓香堿顯著降低轉(zhuǎn)基因鼠唾液中hngf的濃度，注射腎上腺素和異丙腎上腺素能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因鼠唾液中hngf濃度。而且注射腎上腺素和異丙腎上腺素后，公鼠唾液中hngf的濃度顯著高于母鼠。

表5注射刺激物對(duì)性成熟后轉(zhuǎn)基因鼠唾液中hngf的分泌量

由表5可知，與未注射刺激物組相比，注射腎上腺素和去甲腎上腺素對(duì)轉(zhuǎn)基因鼠唾液中hngf的分泌量沒有顯著影響，注射毛果蕓香堿和異丙腎上腺素顯著提高轉(zhuǎn)基因鼠唾液中hngf的分泌量。

以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。