本發(fā)明屬于化學(xué)分析檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于lc-ms檢測黃曲霉菌代謝組學(xué)的前處理方法。

背景技術(shù)：

黃曲霉代謝組是黃曲霉菌基因組、轉(zhuǎn)錄組、產(chǎn)毒機(jī)理等系統(tǒng)生物學(xué)研究中不可缺少一環(huán)，但目前的黃曲霉代謝組檢測方法遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足系統(tǒng)生物學(xué)研究的需要。前處理方法不佳嚴(yán)重影響了黃曲霉代謝組的覆蓋率，往往含量較低且具有重要標(biāo)志作用的代謝化合物沒有被檢測出來。

黃曲霉代謝組研究屬于微生物代謝組學(xué)研究范疇。微生物代謝組學(xué)是以微生物為研究對象，旨在研究細(xì)胞生長周期某一時(shí)刻胞內(nèi)外所有小分子量的代謝物。微生物是地球上代謝最多樣的生物體，細(xì)胞內(nèi)酶系活躍，代謝物轉(zhuǎn)換迅速，因此樣品的培養(yǎng)條件是否穩(wěn)定及樣品的處理方法會顯著影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

目前，微生物代謝組學(xué)正處于其發(fā)展初級階段。由于微生物本身具有系統(tǒng)簡單、基因組數(shù)據(jù)豐富及代謝網(wǎng)絡(luò)和生理特性了解全面等系列優(yōu)勢，微生物代謝組學(xué)已經(jīng)成功地應(yīng)用于新藥開發(fā)、突變體篩選、微生物代謝工程、微生物降解污染物以及微生物與宿主間的病理關(guān)系等方面。有關(guān)黃曲霉菌的代謝組學(xué)研究剛剛起步，roze等人用代謝組學(xué)的方法比較了黃曲霉菌野生型菌株和vea突變的菌株的代謝物，發(fā)現(xiàn)有些揮發(fā)性成分的變化，揭示了vea調(diào)節(jié)分支氨基酸和乙醇代謝的功能。

因此，發(fā)明一種黃曲霉代謝組的高效前處理方法和寬覆蓋率檢測方法，對于深入研究黃曲霉菌生理代謝及相關(guān)環(huán)境響應(yīng)機(jī)制具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種用于lc-ms檢測黃曲霉菌代謝組學(xué)的前處理方法。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種用于lc-ms檢測黃曲霉菌代謝組學(xué)的前處理方法，包括如下步驟：

(1)黃曲霉菌菌株培養(yǎng)：黃曲霉菌在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，用無菌水將孢子從培養(yǎng)基上洗下，然后接種至液體培養(yǎng)基中擴(kuò)培后得到黃曲霉菌樣品；

(2)黃曲霉菌淬滅：將步驟(1)所得黃曲霉菌樣品加入到冷甘油緩沖溶液淬滅劑中，快速混合渦旋、均質(zhì)，然后置于低溫條件下冷卻，再通過真空抽濾快速過濾混合液，收集固體樣品，冷凍干燥；

(3)黃曲霉菌細(xì)胞被膜破碎及代謝組提取：將步驟(2)冷凍干燥所得黃曲霉菌細(xì)胞樣品破碎，利用代謝組提取液進(jìn)行提取處理，再經(jīng)離心、膜過濾后得到代謝組提取溶液；

(4)黃曲霉菌代謝組分析：步驟(3)所得代謝組提取溶液進(jìn)入hplc-ms系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測，然后依據(jù)所得譜圖進(jìn)行黃曲霉菌代謝組分析。

上述方案中，所述黃曲霉菌菌株培養(yǎng)的方法為：黃曲霉接種在察氏固體培養(yǎng)基基上、置于18～38℃培養(yǎng)8～12d后，用無菌水將孢子從固體培養(yǎng)基上洗下，然后接種至沙氏液體培養(yǎng)基中、置于恒溫?fù)u床培養(yǎng)5～7天，得到黃曲霉菌樣品。

上述方案中，所述無菌水中含有體積分?jǐn)?shù)為0.05～0.2％的吐溫-80，所述沙氏液體培養(yǎng)基中黃曲霉菌的接種量為1×10⁵～5×10⁵個(gè)/ml；所述恒溫?fù)u床培養(yǎng)的溫度為25～30℃，搖床轉(zhuǎn)速為150～250r/min。

上述方案中，步驟(2)所述冷甘油緩沖溶液淬滅劑是由丙三醇和nacl溶液以1：1～2：1的體積比混合而成，所述冷甘油緩沖溶液淬滅劑預(yù)冷到-30℃以下使用，所述nacl溶液的濃度為13.5g/l。

上述方案中，步驟(2)所述黃曲霉菌樣品和冷甘油緩沖溶液淬滅劑的體積比為1:4～1:6。

上述方案中，步驟(2)所述低溫條件下冷卻為：混合液置于-20～-40℃條件下冷卻3～5min。

上述方案中，步驟(2)所述冷凍干燥的時(shí)間為8～12小時(shí)。

上述方案中，步驟(3)所述代謝組提取液是由甲醇(meoh)、dcm(二氯甲烷)、acn(乙腈)、ea(乙酸乙酯)和hcooh(甲酸)按體積比20～30：20～30：20～30：20～30：1～2混合形成。

上述方案中，步驟(3)中，以100～200mg黃曲霉菌細(xì)胞樣品為基準(zhǔn)，所述代謝組提取液的加入量為1～2ml。

上述方案中，步驟(3)所述細(xì)胞被膜破碎及代謝組提取為超聲破碎提取，超聲的功率為240w～300w，超聲破碎提取的時(shí)間為15～20min。

上述方案中，步驟(3)所述離心的轉(zhuǎn)速為8000～10000rpm，離心時(shí)間為5～10min。

上述方案中，步驟(3)所述膜過濾的濾膜為0.22μm有機(jī)系濾膜。

上述方案中，步驟(4)所述hplc-ms系統(tǒng)分析檢測的質(zhì)譜條件為：離子源加熱溫度250～350℃，噴霧電壓：正離子模式下為3.5～4kv，負(fù)離子模式下為3.0～3.5kv，鞘氣為30～40arb，輔氣為5～10arb，離子傳輸毛細(xì)管溫度為300～320℃。

本發(fā)明中，黃曲霉菌細(xì)胞代謝組化合物進(jìn)入hplc-ms系統(tǒng)進(jìn)行分析，hplc-ms系統(tǒng)分析檢測采集到原始數(shù)據(jù)后，對原始數(shù)據(jù)分別進(jìn)行峰對齊，提取，代謝物譜庫檢索得到原始峰表，然后進(jìn)行代謝組分析；質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)文件提取峰表和代謝物定性通過sieve3.0實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明采用冷甘油緩沖溶液結(jié)合快速抽濾法對黃曲霉菌細(xì)胞進(jìn)行淬滅，不僅能夠快速淬滅細(xì)胞酶活性，使其定格在取樣時(shí)的生理代謝時(shí)刻，以獲取精確的代謝組數(shù)據(jù)；而且本發(fā)明淬滅方法不容易使黃曲霉菌細(xì)胞被膜破損，可較大程度維持細(xì)胞組織的完整性，具有重復(fù)性和準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)；(2)本發(fā)明以meoh/dcm/acn/ea/hcooh混合溶液作為提取溶液，實(shí)現(xiàn)了高效提取不同極性化合物的目標(biāo)，代謝組化合物覆蓋率高；(3)本發(fā)明采用超聲破碎提取工藝，通過一步法同步完成細(xì)胞被摸破碎和代謝組化合物提取，簡化了前處理過程，節(jié)省了勞力與時(shí)間成本；(4)采用本發(fā)明所述方法對黃曲霉菌細(xì)胞代謝組學(xué)進(jìn)行前處理可以保證代謝組學(xué)分析方法的可重復(fù)性、穩(wěn)定性，降低檢測結(jié)果的假陽性。

附圖說明

圖1為18℃培養(yǎng)的黃曲霉菌代謝組質(zhì)譜色譜圖，其中fig.1a為正離子采集模式，fig.1b為負(fù)離子采集模式。

圖2為28℃培養(yǎng)的黃曲霉菌代謝組質(zhì)譜色譜圖，其中fig.2a為正離子采集模式，fig.2b為負(fù)離子采集模式。

圖3為38℃培養(yǎng)的黃曲霉菌代謝組質(zhì)譜色譜圖，其中fig.3a為正離子采集模式，fig.3b為負(fù)離子采集模式。

圖4為三種不同淬滅方式在激光共聚焦顯微鏡下的結(jié)果，其中(1)液氮淬滅，(2)冷甲醇淬滅，(3)冷甘油-緩沖溶液結(jié)合快速過濾淬滅。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。

實(shí)施例1

18℃察氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的黃曲霉菌代謝組分析前處理方法，包括如下步驟：

(1)黃曲霉菌株培養(yǎng)：黃曲霉菌接種剛在察氏固體培養(yǎng)基上，再18℃條件下培養(yǎng)8～12d后，用無菌水(含0.05～0.2％的吐溫-80)將孢子從培養(yǎng)基上洗下；然后將黃曲霉孢子懸液接種到沙氏液體培養(yǎng)基中，接種量達(dá)到1×10⁵～5×10⁵個(gè)/毫升，將培養(yǎng)瓶置于25～30℃恒溫?fù)u床(150～250r/min)培養(yǎng)5～7天從而得到黃曲霉菌樣品；

(2)采用冷甘油緩沖溶液結(jié)合快速抽濾法對黃曲霉菌細(xì)胞進(jìn)行淬滅：

①快速轉(zhuǎn)移黃曲霉菌樣品到一個(gè)含有冷甘油緩沖溶液淬滅劑(丙三醇和nacl溶液以1:1體積比混合而成，＜-30℃)的離心管中，樣品和淬滅劑體積比保持在1：4之間；

②將樣品和冷甘油緩沖溶液淬滅劑的混合液快速渦旋8～12s，均質(zhì)，然后將混合液于-20℃冷卻3～5min；

③真空抽濾快速過濾混合液，收集固體樣品，冰凍后置于冷凍干燥8小時(shí)；

(3)黃曲霉菌細(xì)胞被膜破碎及代謝組提?。喝?～2ml代謝組提取液加入100～200mg步驟(2)冷凍干燥后的菌球樣品中，超聲破碎提取處理15min，超聲功率為240w，8000～10000rpm離心5～10min，0.22μm有機(jī)系濾膜過濾，得代謝組提取溶液；所述代謝組提取液的組分配比為：meoh/dcm/acn/ea/hcooh的體積比＝24.5/24.1/24.7/25.7/1；

(4)黃曲霉菌代謝組分析：步驟(4)所得代謝組提取溶液進(jìn)入hplc-ms系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測，質(zhì)譜條件為：離子源加熱溫度250～350℃，噴霧電壓：正離子模式下為3.5～4kv，負(fù)離子模式下為3.0～3.5kv，鞘氣為30～40arb，輔氣為5～10arb，離子傳輸毛細(xì)管溫度為300～320℃，hplc-ms采集到原始數(shù)據(jù)后，對原始數(shù)據(jù)分別進(jìn)行峰對齊，提取，代謝物譜庫檢索得到原始峰表，進(jìn)行代謝組分析。

本實(shí)施例hplc-ms采集到的18℃培養(yǎng)的黃曲霉菌代謝組質(zhì)譜色譜圖見圖1。圖1說明了采用本前處理方法處理18℃培養(yǎng)的黃曲霉菌，0～5分鐘的極性化合物，5～10分鐘的中等極性化合物，10～18分鐘的弱極性化合物，全部通過前處理方法提取及色譜洗脫完成；在正離子采集模式和負(fù)離子采集模式下，質(zhì)譜色譜圖均顯示出出峰多的特點(diǎn)。

實(shí)施例2

28℃察氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的黃曲霉菌代謝組分析前處理方法，包括如下步驟：

(1)黃曲霉菌株培養(yǎng)：黃曲霉菌接種剛在察氏固體培養(yǎng)基上，再28℃條件下培養(yǎng)8～12d后，用無菌水(含0.05～0.2％的吐溫-80)將孢子從培養(yǎng)基上洗下；然后將黃曲霉孢子懸液接種到沙氏液體培養(yǎng)基中，接種量達(dá)到1×10⁵～5×10⁵個(gè)/毫升，將培養(yǎng)瓶置于25～30℃恒溫?fù)u床(150～250r/min)培養(yǎng)5～7天從而得到黃曲霉菌樣品；

(2)采用冷甘油緩沖溶液結(jié)合快速抽濾法對黃曲霉菌細(xì)胞進(jìn)行淬滅：

①快速轉(zhuǎn)移黃曲霉菌樣品到一個(gè)含有冷甘油緩沖溶液淬滅劑(丙三醇和nacl溶液以3:2體積比混合而成，＜30℃)的離心管中，樣品和淬滅劑體積比保持在1：5之間；

②將樣品和冷甘油緩沖溶液淬滅劑的混合液快速渦旋8～12s，均質(zhì)，然后將混合液于-30℃冷卻3～5min；

③真空抽濾快速過濾混合液，收集固體樣品，冰凍后置于冷凍干燥10小時(shí)；

(3)黃曲霉菌細(xì)胞被膜破碎及代謝組提?。喝?～2ml代謝組提取液加入到100～200mg步驟(2)冷凍干燥后的菌球樣品中，超聲破碎提取處理15～20min，超聲功率為260w，8000～10000rpm離心5～10min，0.22μm有機(jī)系濾膜過濾，得代謝組提取溶液；所述代謝組提取液的組分配比為：meoh/dcm/acn/ea/hcooh的體積比＝24.5/24.1/24.7/25.7/1；

(4)黃曲霉菌代謝組分析：步驟(4)所得代謝組提取溶液進(jìn)入hplc-ms系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測，質(zhì)譜條件為：離子源加熱溫度250～350℃，噴霧電壓：正離子模式下為3.5～4kv，負(fù)離子模式下為3.0～3.5kv，鞘氣為30～40arb，輔氣為5～10arb，離子傳輸毛細(xì)管溫度為300～320℃，hplc-ms采集到原始數(shù)據(jù)后，對原始數(shù)據(jù)分別進(jìn)行峰對齊，提取，代謝物譜庫檢索得到原始峰表，進(jìn)行代謝組分析。

本實(shí)施例hplc-ms采集到的28℃培養(yǎng)的黃曲霉菌代謝組質(zhì)譜色譜圖見圖2。圖2說明了采用本前處理方法處理28℃培養(yǎng)的黃曲霉菌，0～5分鐘的極性化合物，5～10分鐘的中等極性化合物，10～18分鐘的弱極性化合物，全部通過前處理提取及色譜洗脫完成；在正離子采集模式和負(fù)離子采集模式下，質(zhì)譜色譜圖均顯示出出峰多的特點(diǎn)。

實(shí)施例3

38℃察氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的黃曲霉菌代謝組分析前處理方法，包括如下步驟：

(1)黃曲霉菌株培養(yǎng)：黃曲霉菌接種剛在察氏固體培養(yǎng)基上，再38℃條件下培養(yǎng)8～12d后，用無菌水(含0.05～0.2％的吐溫-80)將孢子從培養(yǎng)基上洗下；然后將黃曲霉孢子懸液接種到沙氏液體培養(yǎng)基中，接種量達(dá)到1×10⁵～5×10⁵個(gè)/毫升，將培養(yǎng)瓶置于25～30℃恒溫?fù)u床(150～250r/min)培養(yǎng)5～7天從而得到黃曲霉菌樣品；

(2)采用冷甘油緩沖溶液結(jié)合快速抽濾法對黃曲霉菌細(xì)胞進(jìn)行淬滅：

①快速轉(zhuǎn)移黃曲霉菌樣品到一個(gè)含有冷甘油緩沖溶液淬滅劑(丙三醇和nacl溶液以2:1體積比混合而成，＜30℃)的離心管中，樣品和淬滅劑體積比保持在1：6之間；

②將樣品和冷甘油緩沖溶液淬滅劑的混合液快速渦旋8～12s，均質(zhì)，然后將混合液于-20～-40℃冷卻3～5min；

③真空抽濾快速過濾混合液，收集固體樣品，冰凍后置于冷凍干燥8～12小時(shí)；

(3)黃曲霉菌細(xì)胞被膜破碎及代謝組提?。喝?～2ml代謝組提取液加入到100～200mg步驟(2)冷凍干燥后的菌球樣品中，超聲破碎提取處理15～20min，超聲功率為300w，8000～10000rpm離心5～10min，0.22μm有機(jī)系濾膜過濾，得代謝組提取溶液；所述代謝組提取液的組分配比為：meoh/dcm/acn/ea/hcooh的體積比＝24.5/24.1/24.7/25.7/1；

(4)黃曲霉菌代謝組分析：步驟(4)所得代謝組提取溶液進(jìn)入hplc-ms系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測，質(zhì)譜條件為：離子源加熱溫度250～350℃，噴霧電壓：正離子模式下為3.5～4kv，負(fù)離子模式下為3.0～3.5kv，鞘氣為30～40arb，輔氣為5～10arb，離子傳輸毛細(xì)管溫度為300～320℃，hplc-ms采集到原始數(shù)據(jù)后，對原始數(shù)據(jù)分別進(jìn)行峰對齊，提取，代謝物譜庫檢索得到原始峰表，進(jìn)行代謝組分析。

本實(shí)施例hplc-ms采集到的38℃培養(yǎng)的黃曲霉菌代謝組質(zhì)譜色譜圖見圖1。圖3說明了采用本前處理方法處理38℃培養(yǎng)的黃曲霉菌，0～5分鐘的極性化合物，5～10分鐘的中等極性化合物，10～18分鐘的弱極性化合物，全部通過前處理方法提取及色譜洗脫完成；在正離子采集模式和負(fù)離子采集模式下，質(zhì)譜色譜圖均顯示出出峰多的特點(diǎn)。

本發(fā)明還對黃曲霉菌淬滅方法進(jìn)行了比較：為獲取一份有生物學(xué)意義的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，微生物代謝組樣品準(zhǔn)備第一步應(yīng)及時(shí)淬滅細(xì)胞內(nèi)外酶活性，而理想的淬滅技術(shù)應(yīng)包括兩個(gè)基本原則：(1)快速淬滅酶活，(2)盡可能維持細(xì)胞組織的完整性。

本發(fā)明考察了三種不同低溫淬滅方式是否會造成黃曲霉等絲狀真菌胞代謝物泄漏，包括液氮淬滅法(＜-196℃)，冷甲醇(＜-30℃)淬滅，冷甘油緩沖溶液(＜-30℃)結(jié)合快速過濾法，結(jié)果如圖4所示，其中(1)液氮淬滅，(2)冷甲醇淬滅，(3)冷甘油-緩沖溶液結(jié)合快速過濾淬滅。溴化丙啶(pi)染色原理是失活的細(xì)胞被膜受到損傷后，pi可進(jìn)入細(xì)胞并與細(xì)胞內(nèi)dna結(jié)合，在熒光顯微鏡下可以觀察到結(jié)合處發(fā)紅光，因此基于此原理研究細(xì)胞在不同淬滅溶劑處理后其細(xì)胞被膜破損情況。由圖4可見，以冷甲醇和液氮淬滅方式對黃曲霉菌細(xì)胞被膜會造成輕微的損傷，造成細(xì)胞內(nèi)代謝物外流，從而降低實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性；冷甘油緩沖溶液淬滅具有較溫和的特性，不易使細(xì)胞被膜破損，是一種有前景的淬滅溶劑，但因甘油密度大，絲狀真菌質(zhì)量輕，容易懸浮而不易使絲狀真菌體與淬滅劑離心分離，本發(fā)明采用冷甘油緩沖溶液淬滅劑結(jié)合快速抽濾分離，克服了冷甘油密度大，黃曲霉菌浮于上層不易離心分離的缺陷。本發(fā)明中將冷甘油緩沖液淬滅結(jié)合快速過濾法分離作為黃曲霉菌全組分代謝組學(xué)取樣淬滅方法。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的實(shí)例，而并非對實(shí)施方式的限制。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之內(nèi)。