本發(fā)明涉及生物醫(yī)學和透明樣本制備技術領域，具體涉及一種組織光透明劑及其制備方法和應用。

背景技術：

隨著光學成像技術的不斷發(fā)展，高分辨獲取生物組織的結構功能信息已成為可能，但生物組織的不透明性制約了光學成像技術在生物醫(yī)學領域中的應用。

近年來興起的組織光透明技術使得器官不必切片，就可在完整狀態(tài)下進行觀察研究，該技術的核心是向生物組織中引入高滲、高折射的化學試劑能夠有效降低生物組織的散射特性，使樣品變透明，極大地提高成像的深度。現有技術中采用的組織透明技術包括babb技術、scale技術、seedb技術、clarity技術等，其中babb技術采用有機溶劑，處理后組織透明效果雖好，當組織卻嚴重皺縮，且導致組織中熒光標記信號猝滅；scale技術是將生物組織持續(xù)浸泡在尿素溶液中，該方法使組織透明需要的時間較長，還會引起組織嚴重膨脹；seedb技術采用濃度不斷增加的果糖溶液浸泡組織，組織形態(tài)雖保持良好，但組織卻常變?yōu)樽厣?，而且果糖溶液粘稠，操作不便；clarity技術利用電泳去除組織中引起散射的脂類物質得以實現透明，該方法的組織透明效果很好，但需先采用特殊的水凝膠預先固定組織，且溶脂會造成細胞膜破壞、組織天然紋理消失。

以上報道的組織光透明方案或多或少都會改變樣品的形態(tài)，破壞組織的天然紋理結構，使光學信號受到破壞，影響成像結果。

技術實現要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種組織光透明劑，它能短時間有效降低生物組織散射，實現組織透明化，還能很好地保持生物組織的完整性，維持體積基本不變，使成像深度和信噪比得到極大提高，且內源熒光信號強度基本不受影響。

第一方面，本發(fā)明提供了一種組織光透明劑，所述組織光透明劑包括以下質量分數的各組分：

尿素：15-25％，甲酰胺：8-15％，曲拉通：10-20％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：20-25％，余量為水。

本發(fā)明中提供的所述組織光透明劑的配方合理高效，其中，尿素具有水化作用，可進入生物組織中緊密折疊區(qū)域的折射率高的蛋白質，產生滲透梯度以允許水份進入，但容易引起組織膨脹，但甲酰胺的加入，能很好地減少組織膨脹；曲拉通可起到透化作用，使得溶液能夠進入組織及細胞間隙；n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺能在有效占據生物組織表面的水結合位點的同時穩(wěn)定了空間結構，在以上4種主要成分的協同作用下，能夠使得生物組織的各組成成分(膠原纖維、細胞膜、細胞器等與組織間液)的折射率相匹配，在快速有效地降低生物組織散射，使組織變得透明的同時，還能較好地控制生物組織體積基本不變，避免發(fā)生膨脹或收縮，組織不會變得易脆，能最大限度地維持生物組織的空間結構，使得成像深度和質量得到極大提高，且使內源性光學強度不受影響。

所述組織光透明劑適用于大腦、眼球、肌肉等富含膠原纖維的生物組織的透明化，對生物組織深層結構成像以重建3d組織結構，研究其結構功能具有重要意義。

優(yōu)選地，所述組織光透明劑中，曲拉通的質量分數為15-20％。

優(yōu)選地，所述組織光透明劑中，甲酰胺的質量分數為8-12％。進一步可選為8-10％。

進一步地，所述組織光透明劑中，所述尿素與甲酰胺的質量比為(1.2-2.5)：1。優(yōu)選為(1.3-2.0)：1。

本發(fā)明的一實施例中，所述組織光透明劑包括以下質量分數的各組分：尿素：25％，甲酰胺：10％，曲拉通：20％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：10％，余量為水。

本發(fā)明的另一實施例中，所述組織光透明劑包括以下質量分數的各組分：尿素：20％，甲酰胺：15％，曲拉通：10％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：20％，余量為水。

本發(fā)明的另一實施例中，所述組織光透明劑包括以下質量分數的各組分：尿素：15％，甲酰胺：8％，曲拉通：15％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：20％，余量為水。

本發(fā)明的另一實施例中，所述組織光透明劑包括以下質量分數的各組分：尿素：25％，甲酰胺：12％，曲拉通：20％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：15％，余量為水。

第二方面，本發(fā)明提供了一種組織光透明劑的制備方法，包括以下步驟：

將尿素、甲酰胺、曲拉通、n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺與水混合，并于35-47℃下加熱溶解，直至溶液澄清透明，即得到所述組織光透明劑，其中，所述組織光透明劑中各組分的質量分數為：尿素：15-25％，甲酰胺：8-15％，曲拉通：10-20％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：20-25％，余量為水。

在制備所述組織光透明劑的過程中，加熱溶解的溫度不能過高，以免尿素和甲酰胺分解。優(yōu)選地，所述加熱溶解的溫度為35-40℃。

本發(fā)明實施例中，組織光透明劑的各組分可以先一起加入到水中，再加熱溶解；也可以將粉末的尿素加入水中加熱溶解后，再按比例加入其他溶液成分，混勻即可。本發(fā)明第二方面提供的所述組織光透明劑的制備方法簡單，成本低廉。

第三方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面所述的組織光透明劑或第二方面所述的組織光透明劑的制備方法在組織透明化處理和/或組織成像中的應用。其中，所述組織為離體生物組織。所述組織可以是大腦、眼球、肌肉等富含膠原纖維的生物組織。

經上述組織光透明劑處理后的透明生物組織，可以用于各種光學顯微鏡的生物成像，如寬場熒光顯微鏡、激光片層掃描顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、基于雙光子激發(fā)熒光和二次諧波的多光子顯微鏡等。

本發(fā)明一實施方式中，提供了一種使組織透明的方法，包括以下步驟：

(1)將生物組織進行固定和分離；

(2)將上述所得生物組織浸泡在本發(fā)明第一方面所述的組織光透明劑中，直至生物組織變得透明。

本發(fā)明的一實施例中，在將生物樣品經灌注處理、清除血液后，在低溫下采用質量分數為4％的多聚甲醛里固定8-12小時后，取出用磷酸鹽緩沖溶液(pbs)漂洗后，得到固定好的生物樣品，以便接著在組織光透明劑中浸泡。

具體地，所述步驟(1)是采用心臟灌注的方法進行：腹腔麻醉后，打開胸腔，經心夾出將輸液器針頭穿入左心室，灌注生理鹽水或pbs，迅速剪開右心耳，沖洗體循環(huán)血液，待血液沖洗完成后再灌注質量分數為4％的多聚甲醛溶液進行固定8-12小時。

優(yōu)選地，所述組織為腦組織、皮膚、眼球、肌肉、胚胎、腎臟、肝臟、脾臟、肺、胃、腸道組織、卵巢組織等。

本申請中，可根據不同生物組織的來源、年齡、體重等，在適當的范圍內調節(jié)所用組織光透明劑內的各組分的比例以及浸泡的時間。例如，對于胚胎期或剛出生的小鼠，其腦組織的脂質成分居多，且水分含量很大，可適當調低尿素和甲酰胺比例，時間控制在2-3天即可達到透明效果，且形態(tài)大小基本保持不變。此時，適用于胚胎期或剛出生的小鼠的全腦組織的透明劑的配方為：尿素：15％，甲酰胺：8％，曲拉通：15％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：20％，余量為水。

再例如，該組織透明試劑對腎臟、肝臟、脾臟、肺、胃、腸道組織等完整組織進行浸泡4-5天就能達到很好的透明效果。

特別地，當所述生物組織為腎臟、肝臟、脾臟時，相對于肺組織，其透明化處理較難，優(yōu)選地，將生物組織置于上述組織透明試劑中后，并置于35-47℃的水浴鍋中進行透明處理，這樣可以提高透明化速度和透明效果。

本發(fā)明一實施方式中，當所述組織為生物組織薄片時，所述浸泡的時間為5-8min?？梢杂^察到組織變得透明，形態(tài)大小基本保持不變。適用于該組織薄片的所述組織光透明劑，包括以下質量分數的各組分：尿素：20％，甲酰胺：10％，曲拉通：20％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：20％，余量為水。

本發(fā)明上述提供的使組織透明的方法中，所述組織光透明劑可在短時間有效降低生物組織散射，實現組織透明化，還能很好地保持生物組織的完整性，維持生物組織體積基本不變，不發(fā)生膨脹或收縮，組織不會變得易脆，不破壞組織內的膠原蛋白結構，能最大限度地維持生物組織的空間結構，不僅使成像的深度和信噪比等得到極大提高，且使內源性光學強度不受影響。

附圖說明

圖1為c57/bl6小鼠全腦在透明前后的對比圖，其中第一行為透明處理前，第二行為透明處理后；

圖2為500μm厚的c57/bl6小鼠腦組織切片在透明8min前后的對比圖，其中第一行為透明處理前，第二行為透明處理后；

圖3為thy1-gfp小鼠腦組織切片透明前后的雙光子成像圖(z＝405μm)，其中a為透明處理前，b為透明處理后。

具體實施方式

以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。

如無特殊說明，本發(fā)明中所用的各試劑均為商品化試劑。

其中，所用曲拉通為聚乙二醇單辛基苯基醚(octylphenylpolyethyleneglycol)，其通用名為曲拉通x-100(tritonx-100)，可通過常用的試劑公司alfa、sigma等購買到。其具有如下的結構式：

其中，n為9-10的整數。

實施例1

一種組織光透明劑的制備方法，包括以下步驟：

將尿素、甲酰胺、曲拉通x-100(sigma-aldrich試劑)、n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺與水混合，并于35℃下加熱溶解，直至溶液澄清透明，即得到所述組織光透明劑，其中，所述組織光透明劑中各組分的質量分數為：尿素：25％，甲酰胺：10％，曲拉通：20％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：25％，水：20％。該組織光透明劑適合于幼齡小鼠腦組織，對整腦組織透明時透明效果較好，且組織形態(tài)基本保持不變，尤其是對薄片腦組織能較快達到較好的透明效果，能在5-8min實現組織透明。

實施例2

一種組織光透明劑的制備方法，包括以下步驟：

將尿素、甲酰胺、曲拉通x-100、n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺與水混合，并于37℃下加熱溶解，直至溶液澄清透明，即得到所述組織光透明劑，其中，所述組織光透明劑中各組分的質量分數為：尿素：20％，甲酰胺：15％，曲拉通：10％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：20％，余量為水。該組織光透明劑適合于幼齡小鼠含水量較高的組織，如肺組織。還適用于薄片腦組織。在對薄片腦組織透明時，透明速度相對較慢，但最終透明效果仍然也較理想?？稍谕该魈幚頃r適當提高透明劑的透明溫度，能加快透明效果。

實施例3

一種組織光透明劑的制備方法，包括以下步驟：

將尿素、甲酰胺、曲拉通x-100、n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺與水混合，并于35℃下加熱溶解，直至溶液澄清透明，即得到所述組織光透明劑，其中，所述組織光透明劑中各組分的質量分數為：尿素：25％，甲酰胺：8％，曲拉通：2015％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：15％，余量為水。該組織光透明劑較適合于對肝臟、腎組織的透明，其整體組織的透明時間可控制在3-4天。

實施例4

一種組織光透明劑的制備方法，包括以下步驟：

將尿素、甲酰胺、曲拉通x-100、n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺與水混合，并于37℃下加熱溶解，直至溶液澄清透明，即得到所述組織光透明劑，其中，所述組織光透明劑中各組分的質量分數為：尿素：25％，甲酰胺：12％，曲拉通：20％，n,n,n',n'-四(2-羥基丙基)乙二胺：15％，余量為水。該組織光透明劑同樣適用于前面實例的各種組織，包括腦、肝、肺、腸、腎。其中對腦組織的透明效率沒有實例1效果理想，對腦組織薄片的透明時間需要在20min以上。

實施例5

采用實施例1制得的組織光透明劑進行小鼠腦組織、腦組織薄片的透明化處理，包括以下步驟：

1.取材

取約4周齡的健康雄性thy1-gfp小鼠和c57/bl6小鼠，體重約10-15g，對其腹腔注射160-200μl的麻醉藥(2％水合氯醛+10％烏來糖水溶液)，待小鼠麻醉后將其固定。

2.固定

心臟灌注：將上述組織經心夾出將輸液器針頭穿入左心室，灌注預冷的pbs，迅速剪開右心耳，沖洗體循環(huán)血液；

待清除血液后，繼續(xù)灌注預冷的質量分數為4％的多聚甲醛溶液固定8-12小時后，取出所需整腦組織、肝、肺、腎等組織，4％多聚甲醛繼續(xù)4℃固定過夜，透明實驗前取出用磷酸鹽緩沖溶液(pbs)漂洗后，得到固定好的生物樣品(例如全腦組織，全肺組織等)；

3.切片：

對于薄片樣品(例如腦組織切片)，采用腦模具將固定好的腦組織切成1mm、500μm的冠狀薄片，用于后續(xù)透明使用。

4、透明化：將上述獲得的腦組織或腦組織切片浸泡在實施例1制得的組織光透明劑中，直至變得透明。

圖1為c57/bl6小鼠全腦在經實施例1的組織光透明劑進行透明化處理前后的對比圖。現有文獻報道的組織光透明劑在對全腦進行透明時，都在一定程度上破壞腦組織形態(tài)，或變得膨脹易碎，或收縮，如經典的cubic和scalea2。本發(fā)明則在達到較好透明效果的同時，能很好地保持腦組織形態(tài)的完整性，體積不發(fā)生明顯變化。

圖2是500μm厚的c57/bl6小鼠腦組織切片在經實施例1的組織光透明劑進行透明化處理前后10min的對比圖。與現有的其他方法(如cubic和scalea2)相比，實施例1的組織光透明劑能使500μm厚的腦組織切片在5-8min能實現完全透明，且較好地保持生物組織體積基本不變，避免發(fā)生膨脹或收縮；而現有的方法在透明化處理10min后，小鼠腦組織切片仍未達到全透明。

圖3是thy1-gfp小鼠的腦組織切片在相同位置同一深度(具體是405μm)透明前后的雙光子成像對比圖(其中激發(fā)波長為920nm，接收波長為360～540nm)。

從圖3可以看出，腦組織切片在實現快速透明化后，在較深深度405μm處的熒光成像信號保存良好，成像深度更深、成像質量更高，細小神經更是清晰可辨。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。