本發(fā)明屬于新型功能納米材料、免疫分析和生物傳感技術領域，提供了一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器的制備方法及應用。
背景技術：
近年來，食品污染日趨嚴重和頻繁，不僅造成巨額的經(jīng)濟損失，還會嚴重影響人類的健康。赭曲霉毒素A是由多種生長在糧食(小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等)、花生、蔬菜等農(nóng)作物上的曲霉和青霉產(chǎn)生的。由于分布廣泛，很容易通過污染的糧食或飼料以及該飼料喂養(yǎng)的動物等進入食物鏈，間接的進入人體內，最終造成肝腎損傷、繁殖障礙、免疫抑制、致癌致畸等嚴重后果。
食品檢測是保證食品安全的重要環(huán)節(jié)，本發(fā)明提供了一種快速、簡便、靈敏度和選擇性高的光電化學免疫分析方法。光電化學傳感器是基于物質的光電轉換來確定待測物濃度的一類檢測裝置，光電化學檢測方法具有靈敏度高、設備簡單、易于微型化的特點，已經(jīng)成為一種極具應用潛力的分析方法，在食品、環(huán)境、醫(yī)藥等領域具有廣闊的應用前景。
本實驗成功構建了在可見光激發(fā)下檢測赭曲霉毒素A的光電化學免疫傳感器。該傳感器以TiO2和BiVO4為基底，其優(yōu)良的導電性和大的表面積能有效減小背景信號。通過在電極表面直接滴加AgNO3和Na2S溶液，原位生成高光電轉換率的窄帶隙Ag2S作為信號放大材料。本發(fā)明制備的基于原位生成Ag2S的光電化學傳感器，具有低成本、高靈敏、特異性好、檢測快速、制備過程簡單等優(yōu)點，在可見光區(qū)域實現(xiàn)了對赭曲霉毒素A的快速、靈敏檢測，有效克服了目前赭曲霉毒素A檢測方法的不足。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器的制備方法及應用，實現(xiàn)了對赭曲霉毒素A的超靈敏檢測。
本發(fā)明的目的之一是提供一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器的制備方法。
本發(fā)明的目的之二是將所制備的赭曲霉毒素A光電化學傳感器，用于檢測赭曲霉毒素A。
本發(fā)明的技術方案，包括以下步驟。
1. 一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器的制備方法，包括以下幾個步驟：
（1）將ITO導電玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超純水清洗30 min，氮氣吹干；
（2）取8 ~ 12 μL、5 mg/mL的TiO2滴加到導電玻璃的導電面，室溫下晾干，4 ~ 6 μL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO4/TiO2，然后在其上面原位生長Ag2S, 制得Ag2S@BiVO4/TiO2修飾電極；
（3）繼續(xù)在Ag2S@BiVO4/TiO2修飾電極表面滴加2 ~ 4 μL、3 mmol/L的巰基乙酸，室溫下晾干，滴加3 ~ 5 μL 的含 1×10-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺EDC和2×10-3 mol/L N-羥基琥珀酰亞胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；
（4）繼續(xù)將3 ~ 5 μL、10 μg/mL的赭曲霉毒素A抗體滴加到電極表面，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；
（5）繼續(xù)將3 μL、質量分數(shù)為1% ~ 2% 的BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，4 ℃冰箱中晾干，超純水沖洗電極表面；
（6）將4 μL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到電極表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超純水沖洗電極表面除去未結合的赭曲霉毒素A抗原，制得一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器。
2.所述 TiO2的制備，步驟如下：
取0.02~0.03 mol鈦酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超純水，攪拌120 min后，將混合溶液轉移到高壓釜中，200 ℃下反應10 ~ 14 h，所得產(chǎn)物用超純水和無水乙醇離心洗滌，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO2粉末。
3.所述 BiVO4的制備，步驟如下：
稱取1.90 ~ 1.98 g的Bi(NO3)3·5H2O和0.77 ~ 0.79 g檸檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；稱取0.46 ~ 0.47g NH4VO3 溶于25 mL蒸餾水，形成淺黃色溶液B，將B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL無水乙醇，攪拌30 min，再加入0.85 g Na2CO3調節(jié)pH，將混合溶液轉移到高壓釜中，180 ℃下反應20 ~ 24 h，所得產(chǎn)物用超純水和無水乙醇離心洗滌三次，60 ℃真空干燥18 ~22 h，得到BiVO4。
4.所述Ag2S@BiVO4/TiO2的制備，包括以下幾個步驟：
（1）BiVO4/TiO2的制備
取8 ~ 12 μL、5 mg/mL的TiO2滴加到導電玻璃的導電面，室溫下晾干，4 ~ 6 μL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO4/TiO2；
（2）Ag2S@BiVO4/TiO2的合成
取2 ~ 4 μL、0.1 mol/L 的巰基乙酸滴加到BiVO4/TiO2，室溫晾干，超純水沖洗，取2 ~ 4 μL、0.08 mol/L 的AgNO3滴加到巰基乙酸修飾的BiVO4/TiO2，避光反應30 ~35 min，超純水沖洗，最后取2 ~ 4 μL、0.1 mol/L的Na2S滴加到BiVO4/TiO2，室溫下反應30 ~ 40 min，超純水沖洗，得到Ag2S@BiVO4/TiO2。
5.赭曲霉毒素A的檢測，檢測步驟如下：
（1）使用電化學工作站以三電極體系進行測試，如權利要求1所制備的光電化學傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，在10 mL、pH 7.4的含0.1 mol/L抗壞血酸的PBS緩沖溶液進行測試；
（2）用時間-電流法對分析物進行檢測，設置電壓為0.1 V，運行時間100 s，照射LED燈波長為400 ~ 450 nm；
（3）當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔10 s開燈持續(xù)照射10 s，然后記錄光電流，繪制工作曲線；
（4）將待測的赭曲霉毒素A樣品溶液代替赭曲霉毒素A標準溶液進行檢測，檢測的結果可通過工作曲線查得。
本發(fā)明所用原材料均可在化學試劑公司或生物制藥公司購買。
本發(fā)明的有益成果
（1）本發(fā)明使用了以TiO2和BiVO4為基底，TiO2擁有良好的光電活性、大的表面積、高穩(wěn)定性和低成本；表面多孔結構的BiVO4，不但促進可見光的吸收，而且可加速電子空穴對的分離和增加其導電性；有效減小背景信號，以巰基乙酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺為交聯(lián)劑，促進了抗體的有效結合。
（2）采用在電極表面直接滴加AgNO3和Na2S溶液，原位生成高光電轉換率的窄帶隙Ag2S作為信號放大材料, Ag2S作為光敏劑擁有高可見光吸收和快速電子轉移路徑，在BiVO4表面原位生長窄帶隙的Ag2S，得到的Ag2S@BiVO4/TiO2有效促進電子轉移和降低電子空穴對的符合，從而提高光電轉化效率。在可見光區(qū)域實現(xiàn)了對赭曲霉毒素A的快速、從而提高了傳感器的靈敏度，降低了檢測限；
（3）一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器對赭曲霉毒素A的檢測，操作簡單，信號響應范圍寬，實現(xiàn)高靈敏檢測，其線性范圍5 pg/mL ~ 750 ng/mL，檢測限最低1.6 pg/mL，表明一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器可以達到準確測定的目的。
具體實施方式
現(xiàn)將本發(fā)明通過具體實施方式進一步說明，但不限于此
實施例1一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器的制備方法，包括以下幾個步驟：
（1）將ITO導電玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超純水清洗30 min，氮氣吹干；
（2）取8 μL、5 mg/mL的TiO2滴加到導電玻璃的導電面，室溫下晾干，4 μL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO4/TiO2，然后在其上面原位生長Ag2S, 制得Ag2S@BiVO4/TiO2修飾電極；
（3）繼續(xù)在Ag2S@BiVO4/TiO2修飾電極表面滴加2 μL、3 mmol/L的巰基乙酸，室溫下晾干，滴加3 μL 的含 1×10-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺EDC和2×10-3mol/L N-羥基琥珀酰亞胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；
（4）繼續(xù)將3 μL、10 μg/mL的赭曲霉毒素A抗體滴加到電極表面，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；
（5）繼續(xù)將3 μL、質量分數(shù)為1% 的BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，4 ℃冰箱中晾干，超純水沖洗電極表面；
（6）將4 μL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到電極表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超純水沖洗電極表面除去未結合的赭曲霉毒素A抗原，制得一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器。
實施例2一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器的制備方法，包括以下幾個步驟：
（1）將ITO導電玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超純水清洗30 min，氮氣吹干；
（2）取10 μL、5 mg/mL的TiO2滴加到導電玻璃的導電面，室溫下晾干，5 μL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO4/TiO2，然后在其上面原位生長Ag2S, 制得Ag2S@BiVO4/TiO2修飾電極；
（3）繼續(xù)在Ag2S@BiVO4/TiO2修飾電極表面滴加3 μL、3 mmol/L的巰基乙酸，室溫下晾干，滴加4 μL 的含 1×10-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺EDC和2×10-3mol/L N-羥基琥珀酰亞胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；
（4）繼續(xù)將4 μL、10 μg/mL的赭曲霉毒素A抗體滴加到電極表面，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；
（5）繼續(xù)將3 μL、質量分數(shù)為1.5% 的BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，4 ℃冰箱中晾干，超純水沖洗電極表面；
（6）將4 μL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到電極表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超純水沖洗電極表面除去未結合的赭曲霉毒素A抗原，制得一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器。
實施例3一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器的制備方法，包括以下幾個步驟：
（1）將ITO導電玻璃切割至2.5 cm × 1.0 cm大小，依次用丙酮、乙醇和超純水清洗30 min，氮氣吹干；
（2）取12 μL、5 mg/mL的TiO2滴加到導電玻璃的導電面，室溫下晾干，6 μL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO4/TiO2，然后在其上面原位生長Ag2S, 制得Ag2S@BiVO4/TiO2修飾電極；
（3）繼續(xù)在Ag2S@BiVO4/TiO2修飾電極表面滴加4 μL、3 mmol/L的巰基乙酸，室溫下晾干，滴加5 μL 的含 1×10-2 mol/L1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺EDC和2×10-3mol/L N-羥基琥珀酰亞胺NHS的混合溶液，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；
（4）繼續(xù)將5 μL、10 μg/mL的赭曲霉毒素A抗體滴加到電極表面，4 ℃冰箱中干燥，超純水沖洗；
（5）繼續(xù)將3 μL、質量分數(shù)為2% 的BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點，4 ℃冰箱中晾干，超純水沖洗電極表面；
（6）將4 μL、5 pg/mL-750 ng/mL的一系列不同濃度的赭曲霉毒素A抗原溶液滴加到電極表面，4 ℃冰箱中孵化30 min，超純水沖洗電極表面除去未結合的赭曲霉毒素A抗原，制得一種赭曲霉毒素A光電化學傳感器。
實施例4所述 TiO2的制備，步驟如下：
取0.02 mol鈦酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超純水，攪拌120 min后，將混合溶液轉移到高壓釜中，200 ℃下反應10 h，所得產(chǎn)物用超純水和無水乙醇離心洗滌，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO2粉末。
實施例5所述 TiO2的制備，步驟如下：
取0.025 mol鈦酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超純水，攪拌120 min后，將混合溶液轉移到高壓釜中，200 ℃下反應12 h，所得產(chǎn)物用超純水和無水乙醇離心洗滌，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO2粉末。
實施例6所述 TiO2的制備，步驟如下：
取0.03 mol鈦酸四丁酯溶解于30 mL乙醇中，30 ℃下加入10 mL超純水，攪拌120 min后，將混合溶液轉移到高壓釜中，200 ℃下反應14 h，所得產(chǎn)物用超純水和無水乙醇離心洗滌，50 ℃真空干燥24 h，得到TiO2粉末。
實施例7所述 BiVO4的制備，步驟如下：
稱取1.90 g的Bi(NO3)3·5H2O和0.77 g檸檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；稱取0.46 g NH4VO3 溶于25 mL蒸餾水，形成淺黃色溶液B，將B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL無水乙醇，攪拌30 min，再加入0.85 g Na2CO3調節(jié)pH，將混合溶液轉移到高壓釜中，180 ℃下反應20 h，所得產(chǎn)物用超純水和無水乙醇離心洗滌三次，60 ℃真空干燥18 h，得到BiVO4。
實施例8所述 BiVO4的制備，步驟如下：
稱取1.94 g的Bi(NO3)3·5H2O和0.78 g檸檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；稱取0.465 g NH4VO3 溶于25 mL蒸餾水，形成淺黃色溶液B，將B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL無水乙醇，攪拌30 min，再加入0.85 g Na2CO3調節(jié)pH，將混合溶液轉移到高壓釜中，180 ℃下反應22 h，所得產(chǎn)物用超純水和無水乙醇離心洗滌三次，60 ℃真空干燥20 h，得到BiVO4。
實施例9所述 BiVO4的制備，步驟如下：
稱取1.98 g的Bi(NO3)3·5H2O和0.79 g檸檬酸溶于10 mL乙二醇，形成溶液A；稱取0.47g NH4VO3 溶于25 mL蒸餾水，形成淺黃色溶液B，將B溶液逐滴加入A溶液，再加入30 mL無水乙醇，攪拌30 min，再加入0.85 g Na2CO3調節(jié)pH，將混合溶液轉移到高壓釜中，180 ℃下反應24 h，所得產(chǎn)物用超純水和無水乙醇離心洗滌三次，60 ℃真空干燥22 h，得到BiVO4。
實施例10所述Ag2S@BiVO4/TiO2的制備，包括以下幾個步驟：
（1）BiVO4/TiO2的制備
取8 μL、5 mg/mL的TiO2滴加到導電玻璃的導電面，室溫下晾干，4 μL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO4/TiO2；
（2）Ag2S@BiVO4/TiO2的合成
取2 μL、0.1 mol/L 的巰基乙酸滴加到BiVO4/TiO2，室溫晾干，超純水沖洗，取2 μL、0.08 mol/L 的AgNO3滴加到巰基乙酸修飾的BiVO4/TiO2，避光反應30 min，超純水沖洗，最后取2 μL、0.1 mol/L的Na2S滴加到BiVO4/TiO2，室溫下反應30 min，超純水沖洗，得到Ag2S@BiVO4/TiO2。
實施例11所述Ag2S@BiVO4/TiO2的制備，包括以下幾個步驟：
（1）BiVO4/TiO2的制備
取10 μL、5 mg/mL的TiO2滴加到導電玻璃的導電面，室溫下晾干，5 μL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO4/TiO2；
（2）Ag2S@BiVO4/TiO2的合成
取3 μL、0.1 mol/L 的巰基乙酸滴加到BiVO4/TiO2，室溫晾干，超純水沖洗，取3 μL、0.08 mol/L 的AgNO3滴加到巰基乙酸修飾的BiVO4/TiO2，避光反應33 min，超純水沖洗，最后取3 μL、0.1 mol/L的Na2S滴加到BiVO4/TiO2，室溫下反應35 min，超純水沖洗，得到Ag2S@BiVO4/TiO2。
實施例12所述Ag2S@BiVO4/TiO2的制備，包括以下幾個步驟：
（1）BiVO4/TiO2的制備
取12 μL、5 mg/mL的TiO2滴加到導電玻璃的導電面，室溫下晾干，6 μL、3 mg/mL的BiVO4滴加到TiO2上，室溫下晾干，450℃煅燒30 min，冷卻，得到BiVO4/TiO2；
（2）Ag2S@BiVO4/TiO2的合成
取4 μL、0.1 mol/L 的巰基乙酸滴加到BiVO4/TiO2，室溫晾干，超純水沖洗，取4 μL、0.08 mol/L 的AgNO3滴加到巰基乙酸修飾的BiVO4/TiO2，避光反應35 min，超純水沖洗，最后取4 μL、0.1 mol/L的Na2S滴加到BiVO4/TiO2，室溫下反應40 min，超純水沖洗，得到Ag2S@BiVO4/TiO2。
實施例13赭曲霉毒素A的檢測，檢測步驟如下：
（1）使用電化學工作站以三電極體系進行測試，如權利要求1所制備的光電化學傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，在10 mL、pH 7.4的含0.1 mol/L抗壞血酸的PBS緩沖溶液進行測試；
（2）用時間-電流法對分析物進行檢測，設置電壓為0.1 V，運行時間100 s，照射LED燈波長為400 ~ 450 nm；
（3）當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔10 s開燈持續(xù)照射10 s，然后記錄光電流，繪制工作曲線；
（4）將待測的赭曲霉毒素A樣品溶液代替赭曲霉毒素A標準溶液進行檢測，其線性范圍5 pg/mL ~ 750 ng/mL，檢測限最低1.6 pg/mL。