本發(fā)明涉及一種用于檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的試劑盒及其檢測方法。

背景技術：

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是自體免疫病因學(auto immune etiology)的炎癥性紊亂，主要發(fā)生在年輕女性中。SLE能影響許多的身體器官系統(tǒng)，包括腎、皮膚、關節(jié)、神經系統(tǒng)、漿膜、血細胞和脈管。雖然不清楚SLE的具體誘因，但許多因素與疾病的發(fā)展有關，包括基因、種族、激素和環(huán)境因素。

多種類型抗核抗體的存在是患SLE的重要血清學特點，所以目前SLE的快速診斷主要是依據血清自身抗體檢查，再結合以臨床表現觀察。其中抗核抗體(ANA)對SLE的敏感性為95％，特異性大約為65％，是目前最佳的SLE病情篩選指標，如多次呈陰性，則患SLE的可能性不大；抗雙鏈DNA抗體(dsDNA)對SLE的特異性高達95％，敏感性約為70％，對確診SLE和判斷狼瘡活動具有較大的參考價值；抗Sm抗體對SLE的特異性高達99％，但敏感性僅為25％，在SLE不活動時也可呈陽性，故多作為回顧性診斷的重要根據；此外抗單鏈DNA抗體(ss-DNA)也可作為SLE診斷指標之一。目前臨床血檢中對以上所述四種指標的檢測，主要是采用放射免疫測定法(RIA)，雖然其具有較好的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，但檢測過程較為煩瑣，操作不便，而且每次也只能分析一種指標，歷時較長，所提供的診斷信息量有限而不全面，諸多的不足為臨床診斷和治療帶來了不便。

CN 104655852 A中公開了一種特異性檢測血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平的試劑在制備用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷和/或預后評估的診斷工具中的應用。所述血清抗體中高甘露糖型N糖鏈水平的增高與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生密切相關，可用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的早期診斷和/或預后評估，進而用于指導系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療。但是該方法在小鼠層面上進行的實驗，在人體中是否能夠具有相應的鑒定效果無法預期。

CN 105229470 A公開了用于診斷、預后和治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的方法和試劑，其涉及根據紅細胞C4d(EC4d)標志物、B細胞C4d(BC4d)標志物、抗核抗體(ANA)。該方法中涉及了眾多的標志物檢測種類較多，而且檢測不便。

目前，臨床治療復雜的自身免疫性疾病(如SLE)的最艱巨的挑戰(zhàn)之一是患者的疾病的準確和早期鑒別。此外，沒有鑒別出使臨床醫(yī)師或其他人能夠準確地確定SLE的病理生理表現、臨床活動、對治療的響應或預后的可靠性診斷標記。

技術實現要素：

一種非診斷目的的系統(tǒng)性紅斑狼瘡階段性蛋白表達差異圖譜模型的構建方法，包括如下步驟:分別采集系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者組、健康對照組的外周血單個核細胞標本；分別對各所述外周血單個核細胞標本進行細胞總蛋白抽提和蛋白濃度測定；將所述細胞總蛋白經蛋白酶消化后，用相對和絕對定量的等量異位標簽標記，得到相對和絕對定量的等量異位標簽多重標記的多肽；將所述多肽經強陽離子交換和反相液相色譜分離，再進行串聯質譜鑒定和相對定量分析，得到所述系統(tǒng)性紅斑狼瘡階段性蛋白表達差異圖譜模型，通過表型鑒定，最終分析得到了SERPINA6和C4BPA這兩個蛋白，以該蛋白作為生物標志物對其表達量進行檢測可以用于指導SLE患者中的早期診斷。

本發(fā)明另外提供了SERPINA6和C4BPA這兩個蛋白用于制備SLE患者診斷的標志物。

另外，本發(fā)明對C4BPA在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人血液中的表達進行了定量檢測。

另外一方面，本發(fā)明提供了一種特異性的識別C4BPA的適配子，其序列如SEQ ID NO：1-13所示。

另外一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，用于特異性的診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡，其包含如SEQ ID NO：1-13所示的序列。

另外一方面，所述的適配子偶聯有磁珠以及篩選標記。

有益效果:本發(fā)明通過差異蛋白篩選，實驗結果表明C4BPA在系統(tǒng)性紅斑狼瘡出現明顯上調表達，可作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病臨床診斷標志物。并且本發(fā)明通過特異性的篩選獲得了C4BPA蛋白特異性結合的適配子，能夠用于定量檢測C4BPA蛋白的表達量，從而能夠用于精確檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病。

附圖說明

圖1是患者血液和健康對照組血液中C4BPA的濃度的統(tǒng)計分析圖。

圖2是ROC曲線顯示蛋白診斷系統(tǒng)性紅斑狼瘡的特異性和靈敏度。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。

實施例1

分別采集系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者20例、健康對照組20例的外周血單個核細胞標本；分別對各所述外周血單個核細胞標本進行細胞總蛋白抽提和蛋白濃度測定；將所述細胞總蛋白經蛋白酶消化后，用相對和絕對定量的等量異位標簽標記，得到相對和絕對定量的等量異位標簽多重標記的多肽；將所述多肽經強陽離子交換和反相液相色譜分離，再進行串聯質譜鑒定和相對定量分析，得到所述系統(tǒng)性紅斑狼瘡階段性蛋白表達差異圖譜模型，通過表型鑒定，最終分析得到了SERPINA6和C4BPA這兩個蛋白，差異表達顯著，可以作為生物標志物對其表達量進行檢測可以用于指導SLE患者中的早期診斷。

另外測量患者血清中C4BPA濃度明顯高于對照組血清(P＜0.05)，參見圖1。

另外，根據圖2 ROC曲線設定了C4BPA的cut-off值為100.9ng/ml，AUC達到了0.9823，其敏感性和特異性均大于94％，陽性率為96.5％。統(tǒng)計分析結果顯示，血液中C4BPA濃度與系統(tǒng)性紅斑狼瘡密切相關，綜合上述實驗研究，可以得出結論，C4BPA在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中高分泌，可以作為C4BPA和正常人群區(qū)分的一個特別好的標志物。

實施例2適配子的獲得

采用SELEX技術，篩選得到了特異性結合C4BPA蛋白的適配子，其序列如下文庫為TACGTAGAATGACTCGTGAG(N)35CAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-1：

TACGTAGAATGACTCGTGAGCTCCACCAACCTCTTCTACTACATATATTCAAAACCAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-2：

TACGTAGAATGACTCGTGAGTCTCCTCCATTCATCCTCAAAATACTATTATCACTCAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-3：

TACGTAGAATGACTCGTGAGAATTTAATCTAAAACCCATATTTTCCACCACATTACAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-4：

TACGTAGAATGACTCGTGAGCCCATCTATCCTCCATTTCATTTACTAACCCCAAACAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-5：

TACGTAGAATGACTCGTGAGCACCTAAACATACTATACTTTAATTTAACTCCACTCAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-6：

TACGTAGAATGACTCGTGAGCTTTATCAAACAACACTTCATTTTCCCAATATTATCAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-7：

TACGTAGAATGACTCGTGAGATCATCACTCCACCCTACCCTTCCTCCCCAAACAACAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-8：

TACGTAGAATGACTCGTGAGTTCCTTTTTCTAACCATAACCTTCCCATCAATCTCCAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-9：

TACGTAGAATGACTCGTGAGTTCTAACTTACAATCTCTTTTTAATCTCATACCATCAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-10：

TACGTAGAATGACTCGTGAGAAAACTATTATATTCCTTTATACTATAATTTTACCCAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-11：

TACGTAGAATGACTCGTGAGATTATATCCACTAATCAAACCCATAAACTATTATCCAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-12：

TACGTAGAATGACTCGTGAGATCACTACATCATCACACTTTAACCACATCCCCTCCAGTACGATGGATGCAGTGA

C4BPA-13：

TACGTAGAATGACTCGTGAGCTCATTTCTCAATTCCCAACTTCAACCCCACCCCCCAGTACGATGGATGCAGTGA

實施例3蛋白結合適配子的性能測定

基于氧化石墨烯氧化具有吸附單鏈DNA的特性，構建了寡核苷酸適配子親和性驗證方法。將固定濃度的C4BPA蛋白靶標(1μΜ)分別與與其對應一系列不同濃度(10，25，50，75，100，150，200uΜ)的候選寡核苷酸適配子進行孵育，總體積為300uL，37℃避光孵育2h，并以BB緩沖液代替靶標作為陰性對照組。孵育結合后加入最佳用量比的GO吸附未與靶標結合的適配子，離心操作后采用F-7000熒光光度計測定上清液490nm激發(fā)下520nm發(fā)射的熒光強度，實驗設置三次平行重復，實驗采用避光處理。以實驗組相對陰性對照組的熒光強度作為縱坐標，以適配子濃度作為橫坐標，采用GraphPad Prism 5.0軟件進行非線性回歸擬合計算適配子的解離常數Kd值。結果如下：

另外，通過與血清中其它人體的蛋白相接觸，本發(fā)明提供的適配子具有較好的結合特異性和穩(wěn)定性，同時也沒有任何溶血性，具有較好的生物學特性。

實施例4所述適配子疾病的診斷

將13個適配子分別與12個系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者患者進行檢測。

在酶標板孔中加入12個血清樣品以及對照健康樣本包被，并加入通過生物素標記的適配子13個，加入HRP標記的鏈酶親和素，37℃孵育1.5小時；PBS洗三次后加入TMB進行顯色5分鐘；2M硫酸終止反應后酶標儀讀數；進行檢測，結果所示，與健康志愿者相比，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中C4BPA蛋白的0D450均明顯升高(p＝0.0035)。通過標準曲線，計算得出，血清中C4BPA蛋白濃度均大于100.9ng/ml，而正常人群的C4BPA蛋白濃度均遠遠小于100.9ng/ml，結果證明13個適配子在系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷中具有應用前景。

以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

序列表

〈110〉申冬昌

〈120〉一種用于檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)的試劑盒及其檢測方法

〈160〉13

〈210〉1

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-1

TACGTAGAATGACTCGTGAGCTCCACCAACCTCTTCTACTACATATATTCAAAACCAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉2

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-2

TACGTAGAATGACTCGTGAGTCTCCTCCATTCATCCTCAAAATACTATTATCACTCAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉3

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-3

TACGTAGAATGACTCGTGAGAATTTAATCTAAAACCCATATTTTCCACCACATTACAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉4

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-4

TACGTAGAATGACTCGTGAGCCCATCTATCCTCCATTTCATTTACTAACCCCAAACAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉5

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-5

TACGTAGAATGACTCGTGAGCACCTAAACATACTATACTTTAATTTAACTCCACTCAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉6

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-6

TACGTAGAATGACTCGTGAGCTTTATCAAACAACACTTCATTTTCCCAATATTATCAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉7

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-7

TACGTAGAATGACTCGTGAGATCATCACTCCACCCTACCCTTCCTCCCCAAACAACAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉8

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-8

TACGTAGAATGACTCGTGAGTTCCTTTTTCTAACCATAACCTTCCCATCAATCTCCAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉9

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-9

TACGTAGAATGACTCGTGAGTTCTAACTTACAATCTCTTTTTAATCTCATACCATCAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉10

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-10

TACGTAGAATGACTCGTGAGAAAACTATTATATTCCTTTATACTATAATTTTACCCAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉11

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-11

TACGTAGAATGACTCGTGAGATTATATCCACTAATCAAACCCATAAACTATTATCCAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉12

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-12

TACGTAGAATGACTCGTGAGATCACTACATCATCACACTTTAACCACATCCCCTCCAGTACGATGGATGCAGTGA

〈210〉13

〈211〉75

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉C4BPA-13

TACGTAGAATGACTCGTGAGCTCATTTCTCAATTCCCAACTTCAACCCCACCCCCCAGTACGATGGATGCAGTGA