本發(fā)明涉及污染物監(jiān)測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛奶樣品的前處理方法及二噁英的測定方法。
背景技術(shù)：
多氯二苯并對二噁英和多氯二苯并呋喃(PCDD/Fs)是一類氯代含氧芳香類化合物，由于分子中氯原子個數(shù)和取代位置的不同，共有210種同類物，國際上常檢測的是17種毒性最強的2,3,7,8位氯原子取代的多氯代二苯并對二噁英和多氯二苯并呋喃，因其毒性極高，世界衛(wèi)生組織(WHO)已將其列為劇毒化合物，并規(guī)定人體每日允許攝入量為1～40pg/kg體重。這類物質(zhì)非常穩(wěn)定，熔點較高，極難溶于水，是無色無味的脂溶性物質(zhì)，容易在生物體內(nèi)積累，具有較高的人體健康風(fēng)險。美國環(huán)保署研究表明，人類的二噁英暴露90％是通過動物性食物攝入的。
牛奶樣品中含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪成分，普通的索氏抽提等提取方法，無法有效地水解蛋白質(zhì)，分離出脂肪成分，因此，有必要提供一種牛奶樣品的前處理方法及二噁英的測定方法，以減少蛋白質(zhì)及脂肪等雜質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種牛奶樣品的前處理方法及二噁英的測定方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
第一方面，本發(fā)明提供了一種牛奶樣品的前處理方法，包括如下步驟：
(1)將牛奶樣品水解后，加入第一溶劑萃取，分離出第一水相和第一有機相，再向第一水相中加入第二溶劑萃取，分離出第二水相和第二有機相，合并第一有機相和第二有機相，經(jīng)氮吹濃縮后獲得濃縮液，將所述濃縮液與混合試劑混合均勻，離心分離，去除濃硫酸層，制得提取液；其中，所述第一有機溶劑與所述第二有機溶劑為相同或不同的有機溶劑；所述有機溶劑包括但不限于乙醚、丙酮、二甲基亞砜、甲苯、正己烷、二氯甲烷中的一種或幾種；
(2)將步驟(1)所得的提取液依次進(jìn)行酸性硅膠柱、酸性氧化鋁硅膠柱凈化，得到凈化液；
(3)將步驟(2)所得的凈化液經(jīng)氮吹濃縮，加入13C-PCDD/Fs內(nèi)標(biāo)，得到儀器分析用凈化試樣。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述牛奶樣品為市售的液態(tài)牛奶或天然的液態(tài)牛奶。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述水解的步驟，具體包括：
將牛奶樣品與堿性蛋白酶溶液混合，在40～55℃、pH＝8.5～10.0的條件下水解3～5h；再加入堿性溶液在70～80℃水解15～35min，再加入有機醇震蕩混合均勻，其中，所述堿性蛋白酶溶液中堿性蛋白酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1～5％(進(jìn)一步優(yōu)選為2％)；所述堿性蛋白酶溶液與所述牛奶樣品的體積比為1:10～20；所述堿性溶液包括但不限于氨水溶液、氫氧化鈉水溶液、氫氧化鉀水溶液中的一種或幾種；所述有機醇包括但不限于乙醇、甲醇、丁二醇、丙醇中的一種或幾種。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述堿性溶液為氨水溶液，其中，氨水溶液的質(zhì)量百分濃度為25～30％。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述堿性溶液與所述牛奶樣品的體積比為0.1～2:1(更進(jìn)一步優(yōu)選為0.5:1)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述有機醇為乙醇。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述有機醇與所述牛奶樣品的體積比為0.5～4:1(進(jìn)一步優(yōu)選為1:1)。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述的加入第一有機溶劑萃取，分離出水相和第一有機相的步驟，具體包括：
加入第一有機溶劑，振蕩萃取3～10min(優(yōu)選為5min)，分離出水相和第一有機相。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述第一有機溶劑為乙醚、正己烷和二氯甲烷的混合溶劑，其中，乙醚、正己烷和二氯甲烷的體積比為1～3:1～3:1(更進(jìn)一步優(yōu)選為2:2:1)。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，向第一水相中加入第二有機溶劑萃取，分離出第二水相和第二有機相的步驟，具體包括：
向第一水相中加入第二有機溶劑，振蕩萃取3～10min(優(yōu)選為5min)，分離出第二水相和第二有機相。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述第二有機溶劑為正己烷和二氯甲烷的混合溶劑，其中，正己烷和二氯甲烷的體積比為0.5～3:1(更進(jìn)一步優(yōu)選為1:1)。
可以理解的是，本發(fā)明對步驟(1)中所述的離心分離的方法沒有特別限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)的離心分離方法即可。
優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述的將所述濃縮液與混合試劑混合均勻，離心分離，去除濃硫酸層，制得提取液的步驟，具體包括：
將所述濃縮液與溶劑、無機酸溶液旋渦振蕩均勻，再采用離心機以2000～4000r/min(進(jìn)一步優(yōu)選為3000r/min)的離心速率離心0.5～4min(進(jìn)一步優(yōu)選為1min)，然后用滴管吸去下層的濃硫酸，制得提取液，其中，所述溶劑包括但不限于乙醚、丙酮、二甲基亞砜、甲苯、正己烷、二氯甲烷中的一種或幾種；所述溶劑與所述濃縮液的體積比為1～10:1；所述無機酸溶液與所述濃縮液的體積比為1～10:1。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述溶劑為正己烷。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(1)中，所述無機酸溶液為濃硫酸溶液，其中，濃硫酸溶液中濃硫酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70～98％。
優(yōu)選地，所述步驟(2)，具體包括：
采用已用第一預(yù)淋洗劑預(yù)淋洗后的酸性硅膠柱對步驟(1)所得的提取液進(jìn)行凈化，經(jīng)第一淋洗劑淋洗后，濃縮得到第一凈化液；采用第二淋洗劑將所述凈化液轉(zhuǎn)移至已預(yù)淋洗處理的酸性氧化鋁硅膠柱中，采用第二淋洗劑進(jìn)行淋洗后，將所述酸性氧化鋁硅膠柱反過來后，采用第三淋洗劑淋洗，并收集得到第二凈化液；
其中，所述第一預(yù)淋洗劑包括但不限于乙醚、甲苯、正己烷和二氯甲烷中的一種或多種；所述第一淋洗劑包括但不限于乙醚、甲苯、正己烷和二氯甲烷中的一種或多種；所述第二淋洗劑包括但不限于正己烷、二氯甲烷、甲醇、甲苯中的一種或幾種；所述第三淋洗劑包括但不限于正己烷、二氯甲烷、甲苯中的一種或幾種。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述酸性硅膠柱中酸性硅膠的高度為5～10cm(更進(jìn)一步優(yōu)選為8cm)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第一預(yù)淋洗劑和第一淋洗劑為相同或不同的有機溶劑。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第一預(yù)淋洗劑為正己烷。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第一預(yù)淋洗劑的用量為10～25mL(更進(jìn)一步優(yōu)選為15mL)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第一淋洗劑為正己烷。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第一淋洗劑的用量為20～30mL(更進(jìn)一步優(yōu)選為23mL)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第二淋洗劑為二氯甲烷、甲醇和甲苯的混合溶劑，其中，所述二氯甲烷、甲醇和甲苯體積比為12～16:2～5:1，(更進(jìn)一步優(yōu)選為15:4:1)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第三淋洗劑為甲苯。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第三淋洗劑的用量為25～50mL(更進(jìn)一步優(yōu)選為30mL)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述酸性氧化鋁硅膠柱中酸性氧化鋁硅膠的高度為5～10cm(更進(jìn)一步優(yōu)選為8cm)。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述已預(yù)淋洗處理的酸性氧化鋁硅膠柱為采用下述方法制得：
采用第二預(yù)淋洗劑對所述酸性氧化鋁硅膠柱進(jìn)行第一次預(yù)淋洗，再采用第三預(yù)淋洗劑對所述酸性氧化鋁硅膠柱進(jìn)行第二次預(yù)淋洗，再采用第四預(yù)淋洗劑對所述酸性氧化鋁硅膠柱進(jìn)行第三次預(yù)淋洗，再采用第五預(yù)淋洗劑對所述酸性氧化鋁硅膠柱進(jìn)行第四次預(yù)淋洗，其中，所述第二預(yù)淋洗劑、第三預(yù)淋洗劑、第四預(yù)淋洗劑、第五預(yù)淋洗劑為相同或不同的預(yù)淋洗有機溶劑，其中，所述預(yù)淋洗有機溶劑包括但不限于正己烷、二氯甲烷、甲醇、甲苯中的一種或幾種。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第二預(yù)淋洗劑為正己烷和二氯甲烷的混合溶劑，其中，所述正己烷和二氯甲烷的體積比為14～18:1。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第二預(yù)淋洗劑的用量為5～10mL。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第三預(yù)淋洗劑為正己烷和二氯甲烷的混合溶劑，其中，所述正己烷和二氯甲烷的體積比為1～3:1。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第三預(yù)淋洗劑的用量為10～20mL。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第四預(yù)淋洗劑為甲苯。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第四預(yù)淋洗劑的用量為7～15mL。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第五預(yù)淋洗劑為正己烷。
更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述第五預(yù)淋洗劑的用量為5～10mL。
優(yōu)選地，所述步驟(3)，具體包括：
將步驟(2)所得的凈化液轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，氮吹至干，轉(zhuǎn)移至容量為1.5mL的樣品瓶中，放置10～14h，加入內(nèi)標(biāo)定容，制得儀器分析用的凈化試樣。
第二方面，本發(fā)明還提供了一種牛奶樣品中二噁英的測定方法，包括如下步驟：
取如第一方面所述的牛奶樣品前處理方法制得的凈化試樣，采用同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀對所述凈化試樣進(jìn)行儀器分析測定，得出牛奶中二噁英含量的測定結(jié)果。
優(yōu)選地，所述同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀的測定參數(shù)如下：
氣相色譜條件為：進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣1μL，進(jìn)樣口溫度為280℃，載氣流量為1.0mL/min，色質(zhì)接口溫度為280℃，色譜柱為DB-5ms(60m×0.25mm×0.1μm)；初始溫度90℃，保持2min后以18℃/min的速度升溫至220℃，再以1.4℃/min升溫至260℃，停留4min；再以4℃/min升溫至305℃，停留4min；
質(zhì)譜條件為：色質(zhì)接口溫度為300℃，離子源溫度為280℃，EI源碰撞能量為70eV，采用選擇離子(SIM)方式對[M]+、[M+2]+和[M+4]+特征離子進(jìn)行監(jiān)測。
本發(fā)明的有益效果在于：
(1)本發(fā)明所提供的牛奶樣品前處理方法，將牛奶樣品采用酶解及水解蛋白質(zhì)成分，有效地提取出脂肪成分，提取過程具有快速、高效、化學(xué)選擇性高、提取效率高等特點；
(2)本發(fā)明所提供的牛奶樣品的前處理方法及二噁英的測定方法，簡單易行，可減少溶劑消耗，降低了成本，具有極高的推廣應(yīng)用價值。
具體實施方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，以便清楚理解本發(fā)明所保護(hù)的技術(shù)方案。
實施例1
本發(fā)明提供了一種牛奶樣品的前處理方法及二噁英的測定方法，包括如下步驟：
(1)提?。喝?00mL市售的液態(tài)奶，加入15mL 2％(w/w)堿性蛋白酶，在50℃、pH＝9.0的條件下水解4h，再加入100mL氨水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％)，70～80℃水解20min，加入200mL乙醇溶劑(乙醇溶劑中乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95％)，振蕩10min混勻，加入200mL乙醚、正己烷和二氯甲烷的混合溶劑(所述混合溶劑中，乙醚、正己烷和二氯甲烷的體積比為2:2:1)，振蕩5min，取第一有機相，再加入200mL正己烷和二氯甲烷的混合溶劑(正己烷和二氯甲烷的體積比為1:1)，振蕩5min，取第二有機相，并合并第一有機相和第二有機相裝入樣品瓶中，再經(jīng)氮吹濃縮近干，獲得濃縮樣品；再向濃縮液中加入7mL正己烷和8mL濃硫酸(其中，濃硫酸中硫酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75％)，旋渦振蕩均勻后，采用離心機以3000r/min的離心速率離心1min，然后用滴管吸去下層的濃硫酸(重復(fù)此步驟至無明顯黃色)，制得提取液；
(2)凈化：
裝柱的步驟如下：加入玻璃棉，用玻璃棒弄平整，用二氯甲烷清洗并用吹風(fēng)機吹干，量好8cm酸硅，8cm酸性氧化鋁的位置(用馬克筆做好標(biāo)志)，分別裝好酸硅和酸性氧化鋁，制得酸性硅膠柱及酸性氧化鋁硅膠柱；
酸性硅膠柱凈化的步驟如下：
將酸性硅膠柱的柱管和接液槽用連接器連接起來，在所述酸性硅膠柱下放置廢液缸，采用滴管將15mL正己烷分2次加入酸性硅膠柱中，待柱中的正己烷快干時，用樣品瓶替換廢液缸，再用21mL正己烷分3次沖洗樣品瓶，將步驟(1)所得的提取液轉(zhuǎn)移到酸性硅膠柱中，然后用2mL正己烷沖洗柱子的壁；等酸性硅膠柱里的溶液滴完后，收集得到第一凈化液，并把酸性硅膠柱移開；
酸性氧化鋁硅膠柱凈化的步驟如下：
將酸性氧化鋁硅膠柱的柱管和接液槽用連接器連接起來，在所述酸性氧化鋁硅膠柱下放置廢液缸，采用滴管將8mL正己烷和二氯甲烷的混合溶劑(正己烷和二氯甲烷的體積比為94:6，分4次，每次2mL)加入酸性氧化鋁柱中；等到柱中的正己烷和二氯甲烷的混合溶劑快干后，再采用16mL正己烷和二氯甲烷的混合溶劑(其中，正己烷和二氯甲烷的體積比為3:2，分4次每次4mL)沖洗柱子；先用10mL甲苯分3-4次加入沖洗柱子；再加入6mL正己烷沖洗柱子；
沖洗完就把柱子反過來，使用8mL正己烷和二氯甲烷的混合溶劑(正己烷和二氯甲烷的體積比為1:1，分4次加入，每次2mL)沖洗樣品瓶，將所述第一凈化液轉(zhuǎn)移到酸性氧化鋁硅膠柱中；再加入二氯甲烷、甲醇和甲苯的混合溶劑(其中，二氯甲烷、甲醇和甲苯體積比為15:4:1)；待溶液流完后，用樣品燒瓶替換廢液缸，并把柱子反過來，加入30mL甲苯，并用樣品燒瓶收集第二凈化液；
(3)濃縮：加入10mL二氯甲烷沖洗樣品燒瓶，將步驟(2)所得的第二凈化液轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，氮吹至干，再加入1mL二氯甲烷，并轉(zhuǎn)移至1.5mL的樣品瓶中，放置一個晚上左右的時間，待二氯甲烷揮發(fā)完后，用20μL的內(nèi)標(biāo)定容，制得儀器分析用的凈化試樣；
(4)測定：取步驟(3)所得的凈化試樣，采用同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀對所述凈化試樣進(jìn)行儀器分析測定，得出液態(tài)奶中二噁英含量的測定結(jié)果；其中，所述同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀的測定參數(shù)如下：
氣相色譜條件為：進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣1μL，進(jìn)樣口溫度為280℃，載氣流量為1.0mL/min，色質(zhì)接口溫度為280℃，色譜柱為DB-5ms(60m×0.25mm×0.1μm)；初始溫度90℃，保持2min后以18℃/min的速度升溫至220℃，再以1.4℃/min升溫至260℃，停留4min；再以4℃/min升溫至305℃，停留4min；
質(zhì)譜條件為：色質(zhì)接口溫度為300℃，離子源溫度為280℃，EI源碰撞能量為70eV，采用選擇離子(SIM)方式對[M]+、[M+2]+和[M+4]+特征離子進(jìn)行監(jiān)測。
本發(fā)明實施例1的測定方法應(yīng)用在牛奶樣品中的檢測結(jié)果如表1所示。采用本發(fā)明預(yù)處理方法，二噁英同位素內(nèi)標(biāo)的回收率在沉積物78％～94％之間。
表1樣品中二噁英含量的檢測結(jié)果
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)，在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，對以上實施例所作的任何簡單的修改、等同替換與改進(jìn)等，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍之內(nèi)。