相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本專利申請(qǐng)要求2012年2月23日向美國(guó)專利商標(biāo)局提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)61/602,150“細(xì)胞和其他復(fù)雜生物材料的色譜分離”的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，所述申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容并入本文用于全部目的。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及靶細(xì)胞或不同(復(fù)雜的)生物材料的色譜分離，特別是通過(guò)柱色譜法如親和色譜法或凝膠滲透色譜法。本發(fā)明采用結(jié)合到位于靶細(xì)胞表面上的受體分子的受體結(jié)合試劑。本文公開的方法也可以被描述為(無(wú)痕)細(xì)胞親和色譜技術(shù)(catch)?？傊?，本發(fā)明為生物材料的無(wú)痕分離提供了新方法，所述生物材料如細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等。本發(fā)明還涉及一種用于分離細(xì)胞和其他復(fù)雜生物材料的設(shè)備(apparatus)。

發(fā)明背景

所需細(xì)胞類型的純的和功能性細(xì)胞群的分離是各種治療、診斷和生物技術(shù)應(yīng)用的前提。

bonnafous等人,j.immunol.methods.1983mar11；58(1-2):93-107描述了具有通過(guò)可切割的汞-硫鍵固定的配體細(xì)胞親和色譜，這意味著經(jīng)由共價(jià)鍵固定配體。在這種方法中，bonnafous等人將有機(jī)汞mersalyl綴合到攜帶伯胺基團(tuán)的trisacryl珠子。根據(jù)bonnafous等人，硫醇化配體可以通過(guò)可切割hg-s鍵共價(jià)固定在這個(gè)基質(zhì)上。bonnafous等人報(bào)道了細(xì)胞分離的兩個(gè)模型研究：(i)伴刀豆球蛋白a用n-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫代)-丙酸酯硫醇化且固定到mersalyl-trisacryl；結(jié)合到伴刀豆球蛋白a-mersalyl-trisacryl的小鼠胸腺細(xì)胞通過(guò)短硫醇處理從支持物上洗脫，其保存細(xì)胞生存力；(ii)抗-二硝基苯基抗體用s-乙?；?巰基琥珀酸酐修飾，且固定到mersalyl-trisacryl上；之前用三硝基苯磺酸標(biāo)記的綿羊紅細(xì)胞結(jié)合到這種支持物且通過(guò)硫醇處理回收而沒(méi)有溶血。

關(guān)于這點(diǎn)請(qǐng)注意，色譜法是一種用于分離低分子量和高分子量分子包括蛋白質(zhì)的得到確認(rèn)的技術(shù)。這種技術(shù)也被應(yīng)用于細(xì)胞分離，特別是以親和色譜法的形式使用特異于所需細(xì)胞類型如免疫配體的固定化配體。例如，不同的t細(xì)胞亞群如下分離：用單克隆免疫球蛋白標(biāo)記和負(fù)載到具有聚丙烯酰胺珠子的柱子上，兔抗-小鼠lgg共價(jià)結(jié)合到珠子上(braun,r.,等人,journalofimmunologicalmethods(1982)54,251-258)。進(jìn)一步例如，使用共價(jià)綴合到雙花扁豆凝集素的sepharose6mb的凝集素-親和柱層析法已被用于從健康白細(xì)胞中分離白血病細(xì)胞(ohba,h.,等人,cancerletters(2002)184,207-214)。

由于細(xì)胞尺寸通常大于蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)相比，它們很難進(jìn)入常規(guī)色譜吸附劑的珠孔。由于擴(kuò)散限制，使用大孔的吸著劑不能明顯克服這種分離現(xiàn)象。另一方面，只有蛋白質(zhì)可進(jìn)入的孔內(nèi)的表面積通常很大程度上超過(guò)蛋白質(zhì)和細(xì)胞都可進(jìn)入的表面積。因此，使用用于固定蛋白質(zhì)性或其他受體結(jié)合配體的常規(guī)色譜吸附劑來(lái)產(chǎn)生用于細(xì)胞的親和基質(zhì)通常需要使用大量過(guò)剩浪費(fèi)的受體結(jié)合配體，由于它們中的大部分都被固定在細(xì)胞不能進(jìn)入的孔或腔中。特異受體結(jié)合試劑通常是昂貴的且很難在所需規(guī)模產(chǎn)生，由此需要認(rèn)真考慮這方面。冷凍凝膠劑形式的整體吸附劑的使用因此被認(rèn)為是一種細(xì)胞親和色譜法的替代技術(shù)(參見例如dainiak,m.b.,等人,adv.biochem.engin./biotechnol.(2007),106,101-127)。然而，整體吸附劑缺乏，以致所需的吸附劑可能無(wú)法在市場(chǎng)上以整體柱形式獲得。此外，在親和色譜法的情況下，通常仍需要移除用于從這些細(xì)胞中洗脫所需細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)化合物。整體吸附劑在細(xì)胞生存力方面的潛在優(yōu)勢(shì)可能因此被移除用于從親和色譜柱中洗脫細(xì)胞的化合物所需的另外的程序逆轉(zhuǎn)。

目前使用的最重要的細(xì)胞分離方法是磁體-輔助細(xì)胞分選(macs)和熒光-輔助細(xì)胞分選(facs^tm)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞分選個(gè)別地分析細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)中通常熒光團(tuán)耦合到抗體，用于標(biāo)記細(xì)胞。細(xì)胞在極高速高壓下使用細(xì)胞分選器分離。facs^tm技術(shù)能夠在一個(gè)步驟中通過(guò)應(yīng)用具有不同熒光團(tuán)的一組抗體分離由一組對(duì)應(yīng)標(biāo)記物定義的細(xì)胞。因此，此方法是可靠的，但是時(shí)間和成本強(qiáng)度大且費(fèi)勁。特別是對(duì)于非常大且多樣的細(xì)胞群的篩選，如含有1×10¹⁰個(gè)細(xì)胞的血漿分離置換法產(chǎn)物，流式細(xì)胞分析儀的極長(zhǎng)分選時(shí)間對(duì)于一個(gè)適當(dāng)?shù)倪x擇過(guò)程是不可接受的。facs^tm的另一個(gè)缺點(diǎn)是復(fù)雜且易于干擾的流式細(xì)胞分析儀很難適應(yīng)分離治療性細(xì)胞產(chǎn)品必需的gmp環(huán)境。此外，在細(xì)胞選擇過(guò)程中應(yīng)用的壓力可能會(huì)損害細(xì)胞效應(yīng)子功能。

磁體-輔助的細(xì)胞分離是一種廣泛使用的用于研究和治療應(yīng)用的系統(tǒng)。盡管與facs^tm技術(shù)相比，所分離細(xì)胞的產(chǎn)量和純度是中等的，但選擇過(guò)程是健壯的，不需要復(fù)雜的自動(dòng)化。磁體-輔助分離的主要缺點(diǎn)是所分離細(xì)胞上剩下的包括磁珠的染色試劑，其可能會(huì)損害所分離細(xì)胞群的效應(yīng)子功能。此外，非連續(xù)陽(yáng)性選擇過(guò)程可能歸結(jié)于所分離細(xì)胞上的這些剩余磁性試劑。連續(xù)陽(yáng)性選擇程序是選擇由一組標(biāo)記物定義的細(xì)胞群強(qiáng)制性的。同時(shí)仍然利用磁性或熒光標(biāo)記，分離細(xì)胞的一個(gè)顯著進(jìn)步是“技術(shù)”，其是例如國(guó)際專利申請(qǐng)wo02/054065和美國(guó)專利7,776,562中所描述的，其中對(duì)位于細(xì)胞表面上的受體表現(xiàn)出低親和結(jié)合的受體結(jié)合試劑用于可逆細(xì)胞染色和分離。與目前使用的單一陽(yáng)性選擇結(jié)合磁性陰性選擇(目的是除了一個(gè)感興趣的，移除所有細(xì)胞群)相比，在每次選擇后移除低親和受體結(jié)合試劑的使用技術(shù)的連續(xù)陽(yáng)性選擇生成極高純度和產(chǎn)量的細(xì)胞群。

本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供一種方法和一種設(shè)備，其克服了已知細(xì)胞分離技術(shù)的缺點(diǎn)，例如所描述的facs^tm和macs技術(shù)。例如，本發(fā)明旨在提供一個(gè)快速、高效和溫和的細(xì)胞選擇程序，尤其是使得連續(xù)陽(yáng)性細(xì)胞選擇能夠分離復(fù)雜細(xì)胞群，如用于研究、診斷、特別是治療目的的調(diào)控t細(xì)胞或中央記憶t細(xì)胞。理想情況下，這個(gè)新方法和設(shè)備也應(yīng)適用于分離細(xì)胞外的其他復(fù)雜生物材料。

這個(gè)目的被獨(dú)立權(quán)利要求的主題解決，此外是如獨(dú)立權(quán)利要求中所述的方法、用途和裝置(arrangement)。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供用于分離其在表面上具有已知受體分子的所需細(xì)胞、包括從其他在其表面缺乏這個(gè)受體的細(xì)胞中分離這種細(xì)胞的方法、套件、設(shè)置、試劑的組合和使用色譜固定相的用途。

根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種分離靶細(xì)胞的方法，其中所述靶細(xì)胞在所述靶細(xì)胞表面上具有受體分子，該方法包括：

-提供樣品，所述樣本包含所述靶細(xì)胞，

-提供受體結(jié)合試劑，所述受體結(jié)合試劑包含結(jié)合位點(diǎn)b和結(jié)合配偶體c，

其中，包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合位點(diǎn)b能夠特異性結(jié)合到所述靶細(xì)胞表面上的受體分子，其中，經(jīng)由所述結(jié)合位點(diǎn)b的受體結(jié)合試劑和受體分子之間的結(jié)合的離解常數(shù)(kd)具有低親和性，或其中經(jīng)由所述結(jié)合位點(diǎn)b的受體結(jié)合試劑和受體分子之間的結(jié)合的離解速率常數(shù)(koff)具有約3×10^-5sec^-1或更大的值，其中包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c能夠可逆地結(jié)合到親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z，和

-使所述樣品在合適的固定相上進(jìn)行色譜，所述固定相具有固定于其上的所述親和試劑，

其中所述親和試劑包含結(jié)合位點(diǎn)z，其中所述結(jié)合位點(diǎn)z與包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c形成可逆的鍵，且其中所述受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)b結(jié)合到所述靶細(xì)胞表面上的受體分子，由此使所述靶細(xì)胞可逆地固定在所述固定相上。

根據(jù)第二方面，本發(fā)明提供了一種分離靶細(xì)胞的方法，其中所述靶細(xì)胞在所述靶細(xì)胞表面上具有受體分子，所述方法包括：

-提供樣品，所述樣品包含所述靶細(xì)胞和受體結(jié)合試劑，所述受體結(jié)合試劑包含結(jié)合位點(diǎn)b和結(jié)合配偶體c，其中，包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合位點(diǎn)b能夠特異性結(jié)合到所述受體分子，且

-使所述樣品在合適的固定相上進(jìn)行色譜，所述固定相為凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和色譜基質(zhì)，其中所述凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和色譜基質(zhì)包含親和試劑，其中所述親和試劑包含特異性結(jié)合到包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c的結(jié)合位點(diǎn)z，由此分離所述靶細(xì)胞。。

根據(jù)第三方面，本發(fā)明提供了一種從樣品中色譜分離靶細(xì)胞的方法，其中所述靶細(xì)胞在所述靶細(xì)胞表面上具有受體分子，所述方法包括：

-提供樣品，所述樣品包含所述靶細(xì)胞，

-提供受體結(jié)合試劑，所述受體結(jié)合試劑包含結(jié)合位點(diǎn)b和結(jié)合配偶體c，

-其中，包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合位點(diǎn)b能夠特異性結(jié)合到所述靶細(xì)胞表面上的受體分子，

-其中，包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體能夠可逆地結(jié)合到親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z，且

-使所述樣品在合適的固定相上進(jìn)行色譜，所述固定相具有固定于其上的親和試劑。

-其中所述親和試劑包含結(jié)合位點(diǎn)z，其中所述含結(jié)合位點(diǎn)z與包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c形成可逆的鍵，且其中所述受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)b結(jié)合到所述靶細(xì)胞表面上的受體分子，由此使所述靶細(xì)胞可逆地固定在所述固定相上，

-提供競(jìng)爭(zhēng)試劑，所述競(jìng)爭(zhēng)試劑包含結(jié)合位點(diǎn)，從而特異性結(jié)合到所述親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z；

-將所述競(jìng)爭(zhēng)試劑負(fù)載到第一固定相上，

由此允許破壞在(多個(gè))所述受體結(jié)合試劑、所述受體分子和所述親和試劑之間形成的非共價(jià)可逆復(fù)合物；

-從所述第一固定相的洗脫液回收洗脫樣品，其中所述洗脫樣品包含所述靶細(xì)胞；

-使所述洗脫樣品在第二合適的固定相上進(jìn)行色譜，所述第二固定相為凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和色譜基質(zhì)，其中所述凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和色譜基質(zhì)包含親和試劑，所述親和試劑具有特異性結(jié)合到包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c的結(jié)合位點(diǎn)z，且

-使所述洗脫樣品通過(guò)所述第二色譜柱。

根據(jù)第四方面，本發(fā)明提供了受體結(jié)合試劑和/或親和試劑用于使用固定相經(jīng)由色譜分離靶細(xì)胞的用途，其中所述靶細(xì)胞在所述靶細(xì)胞表面上具有受體分子，其中所述受體結(jié)合試劑包含結(jié)合位點(diǎn)b和結(jié)合配偶體c，所述受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)能夠特異性結(jié)合到所述靶細(xì)胞的受體分子，其中經(jīng)由所述結(jié)合位點(diǎn)b的受體結(jié)合試劑和受體分子之間的結(jié)合的離解常數(shù)(kd)具有低親和性，或其中經(jīng)由所述結(jié)合位點(diǎn)b的受體結(jié)合試劑和受體分子之間的結(jié)合的離解速率常數(shù)(koff)具有約3×10^-5sec^-1或更大的值，且其中包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c能夠可逆地結(jié)合到所述親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z。

根據(jù)第五方面，本發(fā)明提供鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白(類似物)、抗生物素蛋白和抗生物素蛋白類似物中的一個(gè)用于經(jīng)由色譜分離靶細(xì)胞的用途，其中所述色譜是凝膠過(guò)濾色譜。

根據(jù)第六方面，本發(fā)明提供纖維素膜、塑料膜、多糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、多糖接枝二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮接枝二氧化硅、聚氧化乙烯接枝二氧化硅、聚(2-羥基乙基天冬酰胺)二氧化硅、聚(n-異丙基丙烯酰胺)接枝二氧化硅、苯乙烯-二乙烯基苯凝膠、丙烯酸酯或丙烯酰胺和二醇的共聚物、多糖和n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺的共聚物中的一個(gè)和其任何兩個(gè)或更多個(gè)的組合的色譜基質(zhì)的用于分離細(xì)胞的用途，所述細(xì)胞包含細(xì)胞核。

根據(jù)第七方面，本發(fā)明提供用于色譜的第一固定相和第二固定相的裝置，

其中所述第一固定相適用于細(xì)胞分離，所述第一固定相由親和色譜基質(zhì)限定，其中所述親和色譜基質(zhì)具有固定于其上的親和試劑，其中所述親和試劑具有至少一個(gè)能夠可逆地結(jié)合到包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c的結(jié)合位點(diǎn)z，

其中所述第二固定相適用于從其他組分中分離靶細(xì)胞，所述第二固定相為凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和色譜基質(zhì)，其中所述親和色譜基質(zhì)、或凝膠過(guò)濾和親和色譜基質(zhì)包含親和試劑，所述親和試劑具有特異性結(jié)合到包含在所述受體結(jié)合試劑中的所述結(jié)合配偶體c的結(jié)合位點(diǎn)z。在一些實(shí)施方案中，包含在所述第一固定相和第二固定相中/固定于所述第一固定相和第二固定相上的親和試劑是相同的。在一些實(shí)施方案中，包含在所述第一固定相和第二固定相中/固定于所述第一固定相和第二固定相中的親和試劑是鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突變蛋白。

根據(jù)第八方面，本發(fā)明提供一種用于分離靶細(xì)胞的套件，其中所述靶細(xì)胞在所述靶細(xì)胞表面上具有受體分子，所述套件包含：

(a)受體結(jié)合試劑，所述受體結(jié)合試劑包含結(jié)合位點(diǎn)b和結(jié)合配偶體c，其中包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合位點(diǎn)b能夠特異性結(jié)合到所述靶細(xì)胞表面的受體分子，且其中包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c能夠可逆地結(jié)合到多聚化試劑上的結(jié)合位點(diǎn)z；和

(b)適用于細(xì)胞分離的固定相，所述固定相由凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和色譜基質(zhì)限定，其中所述親和色譜基質(zhì)、或所述凝膠過(guò)濾和親和色譜基質(zhì)包含親和試劑，所述親和試劑具有能夠可逆地結(jié)合到包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c的結(jié)合位點(diǎn)z。

根據(jù)第九方面，本發(fā)明提供一種分離靶細(xì)胞的方法，其中所述靶細(xì)胞在所述靶細(xì)胞表面上具有受體分子，所述方法包括：

-提供樣品，所述樣品包含所述靶細(xì)胞，

-提供受體結(jié)合試劑，所述受體結(jié)合試劑包含單價(jià)結(jié)合位點(diǎn)b和結(jié)合配偶體c，其中所述受體結(jié)合試劑選自單價(jià)抗體片段、具有免疫球蛋白樣功能的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子、適體和mhc分子，

其中包含在所述受體結(jié)合試劑中的單價(jià)結(jié)合位點(diǎn)b能夠特異性結(jié)合到所述靶細(xì)胞表面上的受體分子，其中包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c能夠可逆地結(jié)合到親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z，和

使所述樣品在合適的固定相上進(jìn)行色譜，所述固定相具有固定于其上的所述親和試劑，其中所述親和試劑包含結(jié)合位點(diǎn)z，其中所述結(jié)合位點(diǎn)z與包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c形成可逆的鍵，且其中所述受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)b結(jié)合到所述靶細(xì)胞表面上的受體分子，由此使所述靶細(xì)胞可逆地固定在所述固定相上。

根據(jù)第十方面，本發(fā)明提供一種用于純化靶細(xì)胞的設(shè)備，所述設(shè)備包括用于色譜的第一固定相和第二固定相的至少一個(gè)裝置。這個(gè)裝置的第一固定相適用于細(xì)胞分離,其中所述第一固定相是親和色譜基質(zhì)，其中所述親和色譜基質(zhì)有固定于其上的親和試劑，其中所述親和試劑具有至少一個(gè)能夠可逆地結(jié)合到包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c的結(jié)合位點(diǎn)z。所述第二固定相適用于細(xì)胞分離，其中所述第二固定相是凝膠過(guò)濾基質(zhì)和/或親和色譜基質(zhì)。親和色譜基質(zhì)或凝膠過(guò)濾和親和色譜基質(zhì)包含親和試劑，所述親和試劑具有特異性結(jié)合到包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c的結(jié)合位點(diǎn)z。

根據(jù)第十一方面，本發(fā)明提供一種就靶細(xì)胞表面上的所需受體分子的重組表達(dá)篩選所述靶細(xì)胞的方法，其中所述所需受體分子要在所述靶細(xì)胞表面上表達(dá)，所述方法包括：

-提供樣品，所述樣品包含疑似重組表達(dá)所述所需靶受體的靶細(xì)胞，

-提供受體結(jié)合試劑，所述受體結(jié)合試劑包含結(jié)合位點(diǎn)b和結(jié)合配偶體c，

其中包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合位點(diǎn)b能夠特異性結(jié)合到所述靶細(xì)胞表面上的所需受體分子，

其中包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c能夠可逆地結(jié)合到親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z，和

-使所述樣品在合適的固定相上進(jìn)行色譜，所述固定相具有固定于其上的所述親和試劑，

其中所述親和試劑包含結(jié)合位點(diǎn)z，其中所述結(jié)合位點(diǎn)z與包含在所述受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c形成可逆的鍵，且其中所述受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)b結(jié)合到所述靶細(xì)胞表面上的受體分子，由此使所述靶細(xì)胞可逆地固定在所述固定相上。

附圖簡(jiǎn)述

參照詳述并當(dāng)結(jié)合非限制實(shí)施例和附圖考慮時(shí)，本發(fā)明將被更好的理解。這些圖說(shuō)明本發(fā)明方法的實(shí)施方案。不受理論約束，附圖包含關(guān)于潛在的分離機(jī)制的結(jié)論。給出的結(jié)論僅為說(shuō)明之用，僅僅服務(wù)于允許可視化令人驚訝的可實(shí)現(xiàn)分離如何在分子水平上設(shè)想。

圖1描述一個(gè)分離靶細(xì)胞(2)的方法的實(shí)施方案，靶細(xì)胞(2)在靶細(xì)胞表面上具有受體分子(4)(即靶細(xì)胞由存在至少一個(gè)常見特異性受體分子(4)所定義)。包含靶細(xì)胞的樣品也可包含其他細(xì)胞(22)，其缺乏受體分子(4)，而是在其表面上具有不同的受體分子(44)。例如，例如在包含靶細(xì)胞的樣品中提供受體結(jié)合試劑(1)。受體結(jié)合試劑(1)具有結(jié)合位點(diǎn)b(3)，其特異性結(jié)合到受體分子(4)。受體結(jié)合試劑(1)還包含結(jié)合配偶體c(5)，其可特異性且可逆地結(jié)合道親和試劑(8)的結(jié)合位點(diǎn)z(6)。在一些實(shí)施方案中，受體結(jié)合試劑可具有單價(jià)結(jié)合位點(diǎn)b，且可以是單價(jià)抗體片段(例如，fab片段、單鏈fv片段或fv片段)或具有免疫球蛋白樣功能的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子、適體或mhc分子。在這種背景下，注意本發(fā)明所用親和試劑也可以具有兩個(gè)或更多個(gè)可以由結(jié)合配偶體c結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)z，由此提供受體結(jié)合試劑的多聚化。因此，本文使用的該親和試劑也可以是多聚化試劑。例如，親和試劑可以是鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突變蛋白或其混合物。此外，耦合到不同親和試劑的不同色譜基質(zhì)可以在柱中分層，從而形成用于分離的多組分系統(tǒng)。使包含受體結(jié)合試劑(1)和靶細(xì)胞(2)的樣品與色譜基質(zhì)(19)接觸，親和試劑(8)固定在色譜基質(zhì)(19)上。親和試劑(8)具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)z(6)，其特異性結(jié)合到結(jié)合配偶體c(5)，結(jié)合配偶體c(5)被包含在受體結(jié)合試劑(1)中。受體結(jié)合試劑(1)經(jīng)由結(jié)合配偶體c結(jié)合到親和試劑(8)上的結(jié)合位點(diǎn)z(6)，由此經(jīng)由復(fù)合物固定靶細(xì)胞(2)，所述復(fù)合物由親和試劑一個(gè)或多個(gè)的結(jié)合位點(diǎn)z和色譜基質(zhì)(19)上的受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)z形成。由此樣品中靶細(xì)胞(2)減少，因此靶細(xì)胞(2)被從包括受體結(jié)合試劑(1)的樣品的其他組分中分離。在這種背景下，注意受體結(jié)合試劑(1)可以包含在包含要被分離的靶細(xì)胞的樣品中，或在加入包含靶細(xì)胞的樣品中之前，將受體結(jié)合試劑(1)加入到色譜基質(zhì)(19)中以結(jié)合到固定于其上的多聚化試劑(8)(此方面還參見實(shí)驗(yàn)部分)。當(dāng)濾筒(cartridge)填充這樣的親和色譜基質(zhì)(19)并用于靶細(xì)胞的分離時(shí)，通過(guò)親和色譜法的方式，這樣的濾筒本文也稱為“選擇筒”。在這方面注意，這種色譜法可以作為柱層析法或平面色譜法實(shí)施。

圖2描述一個(gè)分離在靶細(xì)胞表面上具有受體分子(4)的靶細(xì)胞(2)的方法的另一個(gè)實(shí)施方案。圖2所示的方法可以獨(dú)立實(shí)施或與圖1所描述的方法結(jié)合實(shí)施(后一種情況下，圖1所示方法實(shí)施之后，實(shí)施圖2的方法)。圖2方法中使用的樣品包含靶細(xì)胞(2)、受體結(jié)合試劑(1)和競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)。受體結(jié)合試劑(1)具有結(jié)合位點(diǎn)b(3)，其能夠特異性結(jié)合到受體分子(4)。受體結(jié)合試劑(1)還包括結(jié)合配偶體c(5)，其能夠特異性結(jié)合到親和試劑(8)上的結(jié)合位點(diǎn)z(6)(親和試劑(8)可以與圖1所示親和/多聚化試劑(8)相同)。親和試劑(8)具有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)z(6)，它能夠特異性結(jié)合到包含在受體結(jié)合試劑(1)中的結(jié)合配偶體c(5)。競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)也具有能夠結(jié)合到親和試劑(8)上的結(jié)合位點(diǎn)(6)的結(jié)合位點(diǎn)(9)。也可以是全部競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)形成結(jié)合位點(diǎn)(9)的情況。例如對(duì)于全部競(jìng)爭(zhēng)試劑形成結(jié)合位點(diǎn)(9)的情況，競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)可以是具有鏈霉親和素或鏈霉親和素突變蛋白的親和力的生物素或生物素衍生物，而受體結(jié)合試劑(1)中的結(jié)合配偶體c(5)可以是融合到受體結(jié)合試劑(1)的鏈霉親和素結(jié)合肽。競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)和受體結(jié)合試劑(1)均結(jié)合到多個(gè)包含在親和試劑(8)中的結(jié)合位點(diǎn)z(6)的結(jié)合位點(diǎn)(6)。因此，競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)和受體結(jié)合試劑(1)被固定在色譜基質(zhì)(19)上。結(jié)果，包含樣品細(xì)胞的樣品中競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)和受體結(jié)合試劑(1)減少。由于競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)和受體結(jié)合試劑(1)均結(jié)合到包含在色譜基質(zhì)(19)中的親和試劑，靶細(xì)胞(2)沒(méi)有結(jié)合到色譜基質(zhì)，并將例如通過(guò)其中色譜基質(zhì)用作固定相的柱子。當(dāng)濾筒填充這種色譜基質(zhì)(19)并用于消耗/去除包含靶細(xì)胞(群)的樣品的反應(yīng)物時(shí)，這種濾筒也稱為“去除濾筒”。在這方面注意，這種色譜法可以作為柱層析法或平面色譜法實(shí)施。

圖3顯示一個(gè)分離/隔離含有核(2)的靶細(xì)胞的方法的實(shí)施方案。提供包含靶細(xì)胞(2)的樣品，和例如可選地，受體結(jié)合試劑(1)和競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)。將樣品負(fù)載到層析柱上，所述層析柱包含凝膠過(guò)濾介質(zhì)(19)，所述凝膠過(guò)濾介質(zhì)(19)選自使用選自下述的色譜基質(zhì)的基質(zhì)：多糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、多糖接枝二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮接枝二氧化硅、聚氧化乙烯接枝二氧化硅、聚(2-羥基乙基天冬酰胺)二氧化硅、聚(n-異丙基丙烯酰胺)接枝二氧化硅、苯乙烯-二乙烯基苯凝膠、丙烯酸酯或丙烯酰胺和二醇的共聚物、多糖和n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺的共聚物的一個(gè)和其任何兩個(gè)或更多個(gè)的組合。由于樣品允許通過(guò)凝膠過(guò)濾基質(zhì)(19)，受體結(jié)合試劑(1)和競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)在柱子上保持更長(zhǎng)時(shí)間。例如，這些試劑可以進(jìn)入凝膠過(guò)濾基質(zhì)的孔，而靶細(xì)胞較早從色譜柱(2)洗脫，并可被收集進(jìn)一步使用。

圖4描述一個(gè)分離靶細(xì)胞(2)的方法的另一個(gè)實(shí)施方案，所述靶細(xì)胞由靶細(xì)胞表面上存在至少一個(gè)常見特異性受體分子(4)所定義。在這種方法中，使用第一色譜柱(選擇濾筒)和第二色譜柱(去除濾筒)。提供的樣品尤其包含具有受體分子(4)的靶細(xì)胞(2)和在其表面上具有不同受體分子(44)的其他細(xì)胞(22)。樣品還包括受體結(jié)合試劑(1)，其具有特異性結(jié)合到受體分子(4)的結(jié)合位點(diǎn)b(3)。受體結(jié)合試劑(1)還包括結(jié)合配偶體c(5)，其特異性結(jié)合到親和試劑(8)的結(jié)合位點(diǎn)z(6)。將樣品負(fù)載到第一色譜柱上，所述第一色譜柱具有合適的親和色譜基質(zhì)(29)形式的固定相，其中親和色譜基質(zhì)(29)具有固定于其上的親和試劑(8)。在多個(gè)受體結(jié)合試劑(1)、親和(多聚化)試劑(8)和靶細(xì)胞(2)(而非其他細(xì)胞(22))之間形成非共價(jià)可逆復(fù)合物。其他細(xì)胞將自發(fā)或洗滌色譜柱之后通過(guò)第一色譜柱(可選的洗滌步驟未示于圖4)。競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)然后負(fù)載到色譜柱上。競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)具有結(jié)合位點(diǎn)(9)(或構(gòu)成結(jié)合位點(diǎn))，其能夠結(jié)合到親和試劑(8)的結(jié)合位點(diǎn)z(6)。多個(gè)競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)存在且其部分與親和試劑(8)形成復(fù)合物，并由此固定在色譜基質(zhì)(29)上。由于這種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，結(jié)合配偶體c(5)(其包含在受體結(jié)合試劑(1)中)與結(jié)合位點(diǎn)z的結(jié)合被破壞。通過(guò)這樣做，受體結(jié)合試劑從色譜基質(zhì)(29)釋放，因此受體結(jié)合試劑(1)、親和試劑(8)和靶細(xì)胞(2)之間形成的非共價(jià)可逆復(fù)合物也離解。收集來(lái)自第一色譜柱的洗脫液的洗脫樣品，其包含靶細(xì)胞(2)、競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)和受體結(jié)合試劑(1)。洗脫樣品被負(fù)載到第二色譜柱，其具有合適的固定相，這個(gè)固定相既是親和色譜基質(zhì)(19)，同時(shí)也可以作為凝膠滲透基質(zhì)。親和色譜基質(zhì)(19)具有固定于其上的親和試劑(8)。例如，親和試劑(8)可以是鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突變蛋白或其混合物。受體結(jié)合試劑(1)和競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)結(jié)合到親和試劑(8)上的結(jié)合位點(diǎn)z(6)，由此被固定在色譜基質(zhì)(19)上。因此，包含所分離靶細(xì)胞的洗脫樣品中受體結(jié)合試劑(1)和競(jìng)爭(zhēng)試劑(7)減少。不含任何反應(yīng)物的靶細(xì)胞現(xiàn)在處于用于一步使用的狀態(tài)，例如，用于診斷應(yīng)用(例如，進(jìn)一步facs^tm分選)或用于基于任何細(xì)胞的治療應(yīng)用。

圖5顯示從外周血單核細(xì)胞(pbmc)中富集cd8+細(xì)胞的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。這個(gè)實(shí)驗(yàn)在兩個(gè)柱子上進(jìn)行的，這兩個(gè)柱子都包含sephadex-50樹脂耦合作為親和試劑和使用cd8結(jié)合fab片段作為單價(jià)受體結(jié)合試劑，攜帶鏈霉親和素結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體c。圖b-d圖顯示一個(gè)根據(jù)本發(fā)明的方法的分離的結(jié)果，而圖e-g顯示陰性對(duì)照的結(jié)果。

圖6a和圖6b都是本發(fā)明用于分離細(xì)胞的設(shè)備的實(shí)施方案的示意圖，所述設(shè)備使用選擇濾筒和去除濾筒的至少一個(gè)順序裝置。圖6a的設(shè)備10包括蠕動(dòng)泵102和各種控制用于色譜分離靶細(xì)胞的液體相(樣品緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫液)的流動(dòng)的閥門(例如，磁性閥)。蠕動(dòng)泵和閥門由微處理器(未顯示)控制。設(shè)備10的各個(gè)儲(chǔ)器和濾筒經(jīng)由管400彼此流體連接。設(shè)備10包括緩沖液儲(chǔ)器114，其經(jīng)由樣品入口如管400流體連接至包含樣品(例如血液或其它身體細(xì)胞)的樣品儲(chǔ)器116，所述樣品包括將被純化的靶細(xì)胞。包含在合適的緩沖液中的細(xì)胞樣品接下來(lái)被應(yīng)用到第一選擇濾筒104，其包含合適的固定相，如圖3所示具有固定于其上的親和試劑的親和色譜基質(zhì)形式。在選擇濾筒中，攜帶第一類特異性常見受體分子的靶細(xì)胞通過(guò)特異性結(jié)合到第一類受體分子的受體結(jié)合試劑的方式固定。不攜帶第一類受體分子的細(xì)胞流動(dòng)通過(guò)柱子且經(jīng)由廢物儲(chǔ)器112被丟棄。存儲(chǔ)在洗脫緩沖液儲(chǔ)器110中的洗脫液(如這里所示的競(jìng)爭(zhēng)試劑)接下來(lái)被應(yīng)用到柱子中，從而導(dǎo)致破壞親和試劑和受體結(jié)合試劑之間形成的可逆的鍵，因此也洗脫靶細(xì)胞。然后將包含靶細(xì)胞的洗脫液應(yīng)用于去除濾筒106，其如圖3所示包含親和試劑存在于其上的第二固定相。在親和試劑捕獲/固定受體結(jié)合試劑和競(jìng)爭(zhēng)試劑的同時(shí)，純化的靶細(xì)胞通過(guò)這個(gè)柱子，并被導(dǎo)向選擇濾筒204和去除濾筒206的第二裝置。靶細(xì)胞在這第二裝置中經(jīng)由如上所述其表面上第二類常見特異性受體分子純化，其表面不攜帶第二類受體分子的細(xì)胞流動(dòng)經(jīng)過(guò)選擇濾筒且經(jīng)由廢料儲(chǔ)器212被丟棄。圖6a中流體連接到選擇濾筒和去除濾筒的第二順序裝置的選擇濾筒204的洗脫緩沖儲(chǔ)器110被描述為連接到選擇濾筒104的另外的儲(chǔ)器。然而，在使用相同的競(jìng)爭(zhēng)試劑的情況下，裝置10可以僅包括一個(gè)洗脫緩沖液儲(chǔ)器，其流體連接到多個(gè)“濾筒裝置”的每個(gè)的選擇濾筒。最后，去除濾筒206流體連接到樣品出口214以收集所分離靶細(xì)胞。圖6b的設(shè)備具有類似的設(shè)計(jì)，其有三個(gè)順序連接的“濾筒裝置”，每個(gè)由選擇濾筒和去除濾筒組成。圖6b的設(shè)備還包括溫度控制元件以保持恒溫，例如4℃、15℃或25℃。

圖7a至7c顯示從外周血單核細(xì)胞(pbmc)cd8+細(xì)胞中富集人cd8+細(xì)胞的另一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，圖7a顯示pbmc的起始樣品，圖7b顯示cd8+細(xì)胞陰性洗滌級(jí)分，圖7c顯示cd8+陽(yáng)性洗脫液級(jí)分。

圖8a至8c顯示從全血中富集人cd8+細(xì)胞的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，圖8a顯示起始全血樣品，圖8b顯示cd8+細(xì)胞陰性洗滌級(jí)分，圖8c顯示cd8+陽(yáng)性洗脫液級(jí)分。

圖9a至9c顯示從脾細(xì)胞中富集鼠cd4+細(xì)胞的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，圖9a顯示起始脾細(xì)胞樣品，圖9b顯示cd4+細(xì)胞陰性洗滌級(jí)分，圖9c顯示cd4+陽(yáng)性洗脫液級(jí)分。

圖10a至10c顯示從外周血單核細(xì)胞(pbmc)中富集人cd4+細(xì)胞的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，圖10a顯示pbmc的起始樣品，圖10b顯示cd4+細(xì)胞陰性洗滌級(jí)分，圖10c顯示cd4+陽(yáng)性洗脫液級(jí)分。

圖11a至11c顯示從全血中富集人cd4+細(xì)胞的一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，圖11a顯示起始全血樣品，圖11b顯示cd4+細(xì)胞陰性洗滌級(jí)分，圖11c顯示cd4+陽(yáng)性洗脫液級(jí)分。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供執(zhí)行細(xì)胞和其他生物實(shí)體如細(xì)胞器、病毒、脂質(zhì)體等的液體色譜分離的方法和設(shè)備(下文提及靶細(xì)胞時(shí)還包括提及所有其他生物實(shí)體)。靶細(xì)胞或靶細(xì)胞群從樣品中分離，所述樣品例如可包含各種不同的細(xì)胞或細(xì)胞群。在其表面上具有至少一個(gè)常見受體分子的幾乎任何所述靶細(xì)胞均可以從包含在樣品中的其他組分中分離。為了使本文描述的親和色譜法達(dá)到如下所述的親合效果，受體分子通常以兩個(gè)或更多個(gè)拷貝存在于靶細(xì)胞表面上。本文使用的術(shù)語(yǔ)“(靶)細(xì)胞”涵蓋所有生物實(shí)體/囊泡，其中膜(也可以是脂質(zhì)雙層)將內(nèi)部與外部環(huán)境(環(huán)境)分離，并且在生物實(shí)體/囊泡的表面上包含一種或多種類型的特異性受體分子。這意味著靶細(xì)胞/生物實(shí)體/囊泡或靶細(xì)胞群被在表面上存在至少一個(gè)常見表面特異性受體分子定義。本文使用的“分離”意味著，與用于靶細(xì)胞分離的樣品的含量(濃度)相比，靶細(xì)胞在實(shí)施本發(fā)明方法獲得的樣品中富集。這意味著靶細(xì)胞可以在樣品中富集，例如，從樣品中細(xì)胞總量的約0.1％的含量富集至從本發(fā)明方法收集的樣品中約10％或更多、或20％或更多、30％或更多、40％或更多?！胺蛛x”也意味著獲得的樣品包含靶細(xì)胞作為基本上唯一類型的細(xì)胞(細(xì)胞群)，例如，靶細(xì)胞代表樣品中存在的細(xì)胞的超過(guò)75％、或超過(guò)80％、或超過(guò)85％、或超過(guò)90％、或超過(guò)95％或超過(guò)97％或超過(guò)99％?！胺蛛x的”還包括已經(jīng)歷本發(fā)明的分離/純化方法之后，含有靶細(xì)胞的樣品沒(méi)有反應(yīng)物(例如，本文所定義的受體結(jié)合試劑或競(jìng)爭(zhēng)試劑)。術(shù)語(yǔ)“分離”還包括檢測(cè)樣品中靶細(xì)胞的存在或不存在。因此，靶細(xì)胞分離可用于分析或制備目的(例如，用于檢測(cè)靶細(xì)胞群的存在，也用于量化存在于樣品中的細(xì)胞，或用于大規(guī)模分離細(xì)胞以用于基于細(xì)胞的療法)。分析目的包括例如診斷應(yīng)用以及基礎(chǔ)研究應(yīng)用，其中例如本發(fā)明的分離方法用于篩選目的，例如一個(gè)特定受體分子例如g-蛋白耦合受體(gpcr)或任何其他生理相關(guān)受體(如胰島素受體)是否在選定的宿主細(xì)胞重組表達(dá)(同樣見下文)。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中細(xì)胞可以是古菌。在一些實(shí)施方案中細(xì)胞可以是病毒或細(xì)胞器，如線粒體、葉綠體、微粒體、溶酶體、高爾基體或細(xì)胞核。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、原生動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中靶細(xì)胞包括細(xì)胞核。在一些實(shí)施方案中，靶細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括嚙齒類動(dòng)物物種的細(xì)胞，或兩棲動(dòng)物細(xì)胞，如滑體亞綱包含如青蛙、蟾蜍、火蜥蜴或蠑螈的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞的例子包含但不限于血液細(xì)胞、精子細(xì)胞或組織細(xì)胞，如肝細(xì)胞或干細(xì)胞，如源于合適來(lái)源的cd34-陽(yáng)性外周血干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞關(guān)鍵蛋白(nanog)或oct-4表達(dá)干細(xì)胞。血液細(xì)胞可以如白細(xì)胞或紅細(xì)胞。白細(xì)胞可以如嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突細(xì)胞。個(gè)別淋巴細(xì)胞可以如t細(xì)胞—包括cmv-特異cd8+t-淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性t-細(xì)胞、記憶t-細(xì)胞(記憶t細(xì)胞的示例性例子是cd62l⁺cd8⁺t特異性中央記憶t細(xì)胞)或調(diào)節(jié)性t細(xì)胞(treg的示例性例子是cd4⁺cd25⁺cd45ra+treg細(xì)胞)、t-輔助細(xì)胞如cd4⁺t-輔助細(xì)胞、b細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞，提到的只是一些示例性例子。

靶細(xì)胞群或如上提到的任何其他生物實(shí)體群，其膜(也可以是脂質(zhì)雙層)將內(nèi)部與外部環(huán)境(環(huán)境)分離并且進(jìn)一步特點(diǎn)是表面上包含常件特異性受體分子，可以通過(guò)本發(fā)明的方法在任何使用的純化試劑(受體結(jié)合試劑、競(jìng)爭(zhēng)試劑、親和/多聚化試劑)的順序去除下進(jìn)行純化，除了如果靶是細(xì)胞或細(xì)胞器則生理狀態(tài)并不改變的優(yōu)勢(shì)之外，這一事實(shí)提供了調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)，即在使用這些純化的生物實(shí)體作為藥物時(shí)，純化試劑沒(méi)有施用給患者。在這種情況下，相比于純化試劑與藥劑(為細(xì)胞或脂質(zhì)體)一起施用的情況，監(jiān)管當(dāng)局如fda(美國(guó))或emea(歐洲)對(duì)所述純化試劑的生產(chǎn)過(guò)程要求較少的昂貴的約束。因此，關(guān)于本發(fā)明的方法還存在一個(gè)明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，對(duì)于實(shí)體純化，其生理狀態(tài)可以不像對(duì)例如脂質(zhì)體一樣操縱，如果這種脂質(zhì)體必須純化且用作藥物的話。

哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、松鼠、倉(cāng)鼠、刺猬、貓、鴨嘴獸、美洲鼠兔、犰狳、狗、狐猴、山羊、豬、負(fù)鼠、馬、大象、蝙蝠、土撥鼠、猩猩(orang-utan)、獼猴(rhesusmonkey)、絨毛猴(woollymonkey)、獼猴(macaque)、黑猩猩、絹毛猴(saguinusoedipus)、絨猴和人。例如，細(xì)胞可以使組織如器官或其部分的細(xì)胞。各個(gè)器官的實(shí)例包括但不限于腎上腺組織、骨骼、血液、膀胱、腦、軟骨、結(jié)腸、眼、心、腎、肝、肺、肌肉、神經(jīng)、卵巢、胰腺、前列腺、皮膚、小腸、脾、胃、睪丸、胸腺、腫瘤、血管或子宮組織、或結(jié)締組織。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞是干細(xì)胞。

靶細(xì)胞將由其分離的樣品可以是任何來(lái)源。其例如但不限于源自人、動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌或原生動(dòng)物。因此，任何以下樣品選自但不限于土壤樣品、空氣樣品、環(huán)境樣品、細(xì)胞培養(yǎng)樣品、骨髓樣品、降雨樣本、原子塵樣本、污水樣本、地下水樣本、磨損樣品、考古樣品、食物樣品、血液樣品(包括全血)、血清樣品、血漿樣品、尿樣品、糞便樣品、精液樣品、淋巴液樣品、腦脊液樣品、洗鼻咽樣品、痰液樣品、口腔拭子樣品、咽喉拭子樣品本、鼻拭子樣品、支氣管肺泡灌洗樣品、支氣管分泌物樣品、牛奶樣品、羊水樣品、活檢樣品、癌癥樣品、腫瘤樣品、組織樣品、細(xì)胞樣品、細(xì)胞培養(yǎng)樣品、細(xì)胞溶解產(chǎn)物樣品、病毒培養(yǎng)樣品、指甲樣品、頭發(fā)樣品、皮膚樣品、法醫(yī)樣品、感染樣品、院內(nèi)感染樣品、空間樣品或其任何組合。當(dāng)需要時(shí)，相應(yīng)的樣品將被預(yù)處理到任何程度。作為一個(gè)示例性實(shí)例，在用于根據(jù)本發(fā)明的方法之前，組織樣品可能被消化、均質(zhì)或離心。在另一個(gè)示例性實(shí)例中，體液如血液的樣品可以通過(guò)血液細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)分離獲得。如果本文描述的分離方法用于基礎(chǔ)研究，樣品可以是體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞。樣品通常會(huì)準(zhǔn)備成液體的形式，如溶液或分散體。

通常，根據(jù)本發(fā)明的色譜方法是流體色譜法，通常是液相色譜法。色譜法可以以流動(dòng)經(jīng)過(guò)模式進(jìn)行，其中應(yīng)用包含要被分離的細(xì)胞的流體樣品，例如，通過(guò)重力流或泵在包含色譜基質(zhì)的柱子的一端，且其中流體樣品存在柱子另一端的柱子上(這一點(diǎn)也參見實(shí)施例1-7)。此外，色譜法可以以“上下”模式進(jìn)行，其中應(yīng)用包含要被分離的細(xì)胞的流體樣品，例如，通過(guò)在包含色譜基質(zhì)的柱子的一端上的裝有移液器頭的移液器，且其中流體樣品在柱子的另一端進(jìn)入和離開色譜基質(zhì)/移液器頭(這一點(diǎn)參見實(shí)施例8至10)?；蛘?，色譜法還可以以批處理模式應(yīng)用，其中色譜材料(固定相)與包含細(xì)胞的樣品一起孵育，例如，通過(guò)搖晃、旋轉(zhuǎn)或重復(fù)接觸和去除流體樣品，如通過(guò)移液器。任何材料都可以作為本發(fā)明中的色譜基質(zhì)，只要材料適用于色譜分離細(xì)胞。一個(gè)合適的色譜材料至少本質(zhì)上是無(wú)害的，即當(dāng)用于填充的色譜柱中在預(yù)期條件下細(xì)胞隔離(cellisolation)和/或細(xì)胞分離(cellseparation)時(shí)不損害細(xì)胞生存力(或生物實(shí)體的生存力或穩(wěn)定性)。本發(fā)明所使用的色譜基質(zhì)保留于預(yù)定位置，通常為在預(yù)定位點(diǎn)，而要分離的樣品及其內(nèi)包含的組分的位置是變化的。因此，色譜基質(zhì)是符合本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的“固定相”，該固定相是色譜系統(tǒng)的一部分，流動(dòng)相流動(dòng)(或通過(guò)流經(jīng)或以批處理模式)通過(guò)固定相且包含在液相中的組分在相之間的分布(溶解或分散)發(fā)生。因此，術(shù)語(yǔ)“色譜基質(zhì)”和“固定相”本文可互換使用。在這方面，注意加入到液體樣品中、與樣品混合、然后從樣品中去除(如通過(guò)棄除上清(液體)，同時(shí)將珠子暫時(shí)放在適當(dāng)位置(例如，通過(guò)外部磁場(chǎng)或通過(guò)離心)的顆粒如可自由活動(dòng)的磁珠并不是本文使用的固定相。因此，下述方法不是本發(fā)明的方法：在所述方法中，將這些(磁)珠加入到含有靶細(xì)胞的樣品中以在這些珠子上固定靶細(xì)胞(經(jīng)由在靶細(xì)胞、受體結(jié)合試劑和親和/多聚化試劑之間形成復(fù)合體)，然后將珠子與樣品，例如通過(guò)暫時(shí)將珠子放在適當(dāng)位置，同時(shí)丟棄上清液。

通常，各個(gè)色譜基質(zhì)具有固相或半固相的形式，而包含要被分離(isolated/separated)的靶細(xì)胞的樣品是液相。用于實(shí)現(xiàn)色譜分離的流動(dòng)相同樣是液相。色譜法基質(zhì)可以是顆粒物質(zhì)(具有任何合適的尺寸和形狀)或整體色譜材料，包括紙基材或膜(參見實(shí)施例部分)。因此，色譜法既可以是柱層析法也可以是平面色譜法。除了標(biāo)準(zhǔn)色譜柱，允許雙向流動(dòng)的柱子如購(gòu)自phynexus,inc.sanjose,ca,u.s.a.的柱子或離心管可以用于基于柱子/基于流經(jīng)模式的本文描述的細(xì)胞色譜分離。因此，允許雙向流動(dòng)的移液器頭或柱子也被本文使用的術(shù)語(yǔ)“色譜柱”涵蓋。如果使用顆?；|(zhì)材料，顆粒基質(zhì)材料可以例如具有約5μm至約200μm、或從約5μm至400μm、或從約5μm至約600μm的平均粒徑。如下詳述，色譜基質(zhì)可以是或包含如聚合物樹脂或金屬氧化物或類金屬氧化物。如果使用平面色譜，基質(zhì)材料可以是任何適合平面色譜的材料，如傳統(tǒng)的基于纖維素的或基于有機(jī)聚合物的膜(例如，紙膜、硝化纖維素膜或聚偏二氟乙烯(pvdf)膜)或二氧化硅涂覆的玻璃板。在一個(gè)實(shí)施方案中，色譜基質(zhì)/固定相是一種非磁性材料或非可磁化材料。

也適用于本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)所使用的非磁性材料或非可磁化色譜固定相,包括衍生化的二氧化硅或交聯(lián)凝膠。交聯(lián)凝膠(通常生產(chǎn)成珠子形式)可以基于天然聚合物，即在天然形成的聚合物類上。例如，色譜固定相基于其的天然聚合物是多糖。相應(yīng)的多糖通常是交聯(lián)的。多糖基質(zhì)的實(shí)例是瓊脂糖凝膠(例如，superflow^tm瓊脂糖或材料，如市場(chǎng)上可購(gòu)買的不同珠子和孔尺寸的superflow^tm)或交聯(lián)葡聚糖凝膠。另一個(gè)示例性實(shí)例是葡聚糖共價(jià)結(jié)合的微粒交聯(lián)瓊脂糖基質(zhì)，這是市場(chǎng)上可以買到的(以各種珠子大小和不同孔尺寸)如或都可以從gehealthcare獲得。這種色譜材料的另一個(gè)示例性實(shí)例是其也以不同的珠子和孔尺寸從gehealthcare獲得。

交聯(lián)凝膠也可以基于合成聚合物，即基于天然不存在的聚合物類。通常用于細(xì)胞分離的色譜固定相基于其的合成聚合物基于具有極性單體單元且因此本身具有極性的聚合物。這樣的極性聚合物是親水的。親水(“愛(ài)水的”)分子，也稱為疏脂的(“厭脂肪的”)，包含可以與水分子形成偶極-偶極相互作用的部分。疏水(“厭水的”)分子，也稱為親脂的，具有與水分離的傾向。

合適的合成聚合物的示例性實(shí)例是聚丙烯酰胺、苯乙烯-二乙烯基苯凝膠以及丙烯酸酯和二醇或丙烯酰胺和二醇的共聚物。一個(gè)示例性實(shí)例是聚甲基丙烯酸酯凝膠，可以以商購(gòu)獲得。另一個(gè)實(shí)例是乙二醇和甲基丙烯酸酯的共聚物，可以以商購(gòu)獲得。在一些實(shí)施方案中，色譜固定相可以也包括天然和合成的聚合物組分，如復(fù)合基質(zhì)或復(fù)合物或多糖和瓊脂糖的共聚物，如聚丙烯酰胺/瓊脂糖復(fù)合物，或多糖和n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺的復(fù)合物。葡聚糖和n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺的共聚物一個(gè)示例性實(shí)例是上述系列材料。衍生化二氧化硅可以包括耦合到天然或合成聚合物的二氧化硅顆粒。這種實(shí)施方案的實(shí)例包括但不限于多糖接枝二氧化硅、聚乙烯吡咯烷酮接枝二氧化硅、聚氧化乙烯接枝二氧化硅、聚(2-羥基乙基天冬酰胺)二氧化硅和聚(n-異丙基丙烯酰胺)接枝二氧化硅。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明中采用的色譜基質(zhì)是凝膠過(guò)濾(也稱為尺寸排阻)基質(zhì)，例如當(dāng)用于本文描述的去除濾筒時(shí)。凝膠過(guò)濾可以具有這樣的性質(zhì)，這個(gè)性質(zhì)設(shè)計(jì)為至少基本上不經(jīng)歷與要被分離的細(xì)胞的相互作用。因此，凝膠過(guò)濾基質(zhì)允許主要基于其尺寸分離本文定義的細(xì)胞或其它生物實(shí)體。相應(yīng)的色譜基質(zhì)通常是如上所述的顆粒多孔材料。色譜基質(zhì)可以具有某個(gè)排阻限值，通常這根據(jù)分子量定義，高于該分子量則分子完全排除進(jìn)入孔中。定義尺寸排阻限值的相應(yīng)分子量可以選擇為對(duì)應(yīng)于要被分離的靶細(xì)胞(或生物實(shí)體)的分子量的分子量以下。在這樣的實(shí)施方案中，靶細(xì)胞被阻止進(jìn)入尺寸排阻色譜基質(zhì)的孔中。同樣，是親和色譜基質(zhì)的固定相可以具有小于選定靶細(xì)胞尺寸的尺寸的孔。在示例性實(shí)施方案中，親和色譜基質(zhì)和/或凝膠過(guò)濾基質(zhì)的平均孔尺寸為0至約500nm。

存在于樣品中的其他組分如受體結(jié)合分子或競(jìng)爭(zhēng)試劑可以具有低于孔的排阻限值的尺寸，且其能夠進(jìn)入尺寸排阻色譜基質(zhì)的孔中。在這些能夠部分或全部進(jìn)入孔體積的組分中，不易進(jìn)入孔體積的較大分子通常會(huì)首先洗脫，而最小的分子最后洗脫。在一些實(shí)施方案中，尺寸排阻色譜基質(zhì)的排阻限值選擇為靶細(xì)胞的最大寬度以下。因此，可進(jìn)入孔體積的組分通常比靶細(xì)胞在尺寸排阻色譜基質(zhì)中保留更久/保留在尺寸排阻色譜基質(zhì)上。因此，可以在與樣品的其他物質(zhì)/組分不同的色譜柱洗脫液中收集靶細(xì)胞。因此如受體結(jié)合試劑或當(dāng)可應(yīng)用時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)試劑的組分在比靶細(xì)胞稍后的時(shí)間點(diǎn)從凝膠滲透基質(zhì)中洗脫。如果凝膠滲透基質(zhì)包含具有結(jié)合位點(diǎn)的親和試劑(通常共價(jià)結(jié)合于其上)，例如能夠結(jié)合樣品中的試劑如受體結(jié)合試劑和/或競(jìng)爭(zhēng)試劑的結(jié)合位點(diǎn)z，這種分離效果將進(jìn)一步增強(qiáng)。受體結(jié)合試劑和/或競(jìng)爭(zhēng)試劑將被親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z結(jié)合，由此固定在凝膠滲透基質(zhì)上。這種方法通常在如本發(fā)明中所用的去除濾筒中進(jìn)行，且在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的方法、組合和套件包括和/或采用這樣的凝膠過(guò)濾基質(zhì)。在相應(yīng)方法中，細(xì)胞被相應(yīng)基于尺寸分離。

本發(fā)明中所用的色譜基質(zhì)還可以包括可被磁吸引的物質(zhì)，如一個(gè)或多個(gè)可被磁吸引的顆?；蜩F磁流體。相應(yīng)的可被磁吸引的顆粒可以包含多聚化試劑或具有能夠結(jié)合靶細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)的親和試劑?？杀淮盼念w?？梢院锌勾判浴㈣F磁性、順磁性或超順磁材料。超順磁材料響應(yīng)磁場(chǎng)，這個(gè)磁場(chǎng)具有不產(chǎn)生永久磁化的感應(yīng)磁場(chǎng)?；谘趸F的磁性顆粒如可從dynalbiotech商購(gòu)購(gòu)得的從miltenyibiotec商購(gòu)購(gòu)得的磁性microbeads，從cpginc.商購(gòu)購(gòu)得的磁性多孔玻璃珠，以及從各自其他來(lái)源的，如rocheappliedscience、bioclon、biosourceinternationalinc.、micromod、ambion、merck、bangslaboratories、polysciences或novageninc.，這里只列出一些。例如，hutten,a.等人已經(jīng)描述了基于超順磁co和feco的磁性納米顆粒，以及鐵磁co納米晶體(j.biotech.(2004),112,47-63)。然而，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明中所用色譜基質(zhì)沒(méi)有任何可被磁吸引的材料。

在分離靶細(xì)胞的方法的一些實(shí)施方案中，采用色譜基質(zhì)作為親和色譜基質(zhì)。親和色譜基質(zhì)本身包括永久結(jié)合(通常是共價(jià)結(jié)合)的部分，其能夠特異結(jié)合選定的靶。例如，常規(guī)親和色譜基質(zhì)可以包括結(jié)合特定給定靶的抗體?；蛘撸糜诠潭ń饘?螯合親和色譜(imac)的色譜基質(zhì)用例如三齒亞氨基二乙酸的螯合配體試劑或低聚組氨酸標(biāo)簽修飾，所述三齒亞氨基二乙酸能夠在金屬離子和蛋白質(zhì)的某些裸露側(cè)鏈之間形成配位鍵。因此，在本領(lǐng)域，親和色譜基質(zhì)通常設(shè)計(jì)成使得其本身能夠特異性結(jié)合分析物或要被分離的靶細(xì)胞。在其中使用色譜基質(zhì)的本發(fā)明中，例如在如下詳述的“選擇濾筒”中，親的和色譜基質(zhì)本身不是設(shè)計(jì)成能夠特異性結(jié)合要被分離的靶細(xì)胞。而是在這種實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的親和色譜基質(zhì)(固定相)包含親和試劑，所述親和試劑具有至少一個(gè)或多個(gè)能夠特異性結(jié)合到也用于本發(fā)明的受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)z。當(dāng)受體結(jié)合試劑與親和/多聚化試劑接觸時(shí)，經(jīng)由受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體c和親和/多聚化試劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)z形成可逆復(fù)合體。因此，這個(gè)復(fù)合體的形成依賴于配體及其各自的結(jié)合配偶體之間的非共價(jià)相互作用，因而從根本上不同于如上bonnafous等人所述的使用可切割的共價(jià)鍵。通常親和試劑包含一個(gè)能夠與結(jié)合配偶體c形成可逆的鍵的結(jié)合位點(diǎn)z就是足夠的，只要親和試劑以足夠高的表面密度存在/提供于親和色譜基質(zhì)上，從而當(dāng)受體結(jié)合試劑和親和試劑之間經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合配偶體c形成復(fù)合物時(shí)將導(dǎo)致親合效應(yīng)。然而，還可行的是親和試劑包含兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)z用于結(jié)合配偶體c。在然后形成的非共價(jià)結(jié)合復(fù)合物中，兩個(gè)或更多個(gè)受體結(jié)合試劑固定在親和色譜基質(zhì)上彼此緊密排布，使得如果具有(至少兩個(gè)拷貝的)受體分子的靶細(xì)胞存在于樣品中，并與具有一個(gè)或多個(gè)能夠結(jié)合特定受體分子的結(jié)合位點(diǎn)b的受體結(jié)合試劑接觸，發(fā)生親合效應(yīng)。因此，在這些實(shí)施方案中，類似于美國(guó)專利7,776,562、美國(guó)專利8,298,782或國(guó)際專利申請(qǐng)wo02/054065中之一描述的親合(多聚化)效應(yīng)可以發(fā)生，以允許靶細(xì)胞在親和色譜基質(zhì)上的可逆多聚化。由于通過(guò)加入競(jìng)爭(zhēng)試劑能夠破壞親和試劑(也可以充當(dāng)多聚化試劑)的結(jié)合位點(diǎn)z和受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體c之間的鍵，隨后可以在溫和條件下洗脫靶細(xì)胞，在這種條件下受體結(jié)合試劑完全從靶細(xì)胞中離解，由此避免受體結(jié)合試劑影響靶細(xì)胞的功能狀態(tài)。這種經(jīng)由此親和色譜法分離靶細(xì)胞因此并不僅具有允許靶細(xì)胞群(或本文描述的任何其他生物實(shí)體)的分離/純化的優(yōu)點(diǎn)，其不改變由常見特異性受體分子定義的靶細(xì)胞群的功能狀態(tài)。而且，這種方法還有額外的好處，它完全廢除使用磁珠純化細(xì)胞的需要，由此簡(jiǎn)化了對(duì)細(xì)胞的進(jìn)一步處理并打開了本文還描述的分離靶細(xì)胞的自動(dòng)化的途徑。

在根據(jù)本發(fā)明的方法的其他實(shí)施方案中，使用的色譜基質(zhì)具有固定于其上的親和試劑。親和試劑能夠結(jié)合包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c(見下文)。這樣的色譜基質(zhì)可以是親和色譜基質(zhì)。其也可以是凝膠過(guò)濾基質(zhì)，親和試劑耦合于其上。在一些實(shí)施方案中，色譜基質(zhì)包含在色譜柱中，例如裝填在其中。通過(guò)固定的親和試劑，色譜基質(zhì)可以消耗受體結(jié)合試劑的流動(dòng)相。接觸色譜基質(zhì)的樣品，例如負(fù)載到與其裝填的柱子上，同樣可以耗盡其中的受體結(jié)合試劑。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方法中，受體結(jié)合試劑包含在與相應(yīng)固定相即色譜基質(zhì)接觸的樣品中。

應(yīng)用含有靶細(xì)胞的樣品之后，隨后用流動(dòng)相洗滌色譜基質(zhì)(無(wú)論是用于親和色譜法還是用于凝膠滲透)，所述固定相例如水性介質(zhì)，如緩沖液，以變?nèi)コ龥](méi)有固定在色譜基質(zhì)上的任何物質(zhì)。然后，可以誘導(dǎo)上文描述的非共價(jià)復(fù)合物的離解，例如通過(guò)改變條件，該復(fù)合物的形成使靶細(xì)胞固定在親和色譜基質(zhì)上。這種條件的改變例如可以是水性流動(dòng)相離子強(qiáng)度的改變或溫度的改變。在一些實(shí)施方案中，采用競(jìng)爭(zhēng)試劑以便誘導(dǎo)受體、受體結(jié)合試劑和親和試劑之間的可逆非共價(jià)復(fù)合物的離解。通過(guò)占有或阻塞親和試劑對(duì)于包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體的結(jié)合位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)試劑能夠結(jié)合親和試劑。通過(guò)使用與親和試劑具有特別高親和力的競(jìng)爭(zhēng)試劑，或通過(guò)相對(duì)于靶細(xì)胞和受體結(jié)合試劑中的至少一個(gè)使用過(guò)量競(jìng)爭(zhēng)試劑(在這種情況下，相比于受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體c，競(jìng)爭(zhēng)試劑也可能對(duì)親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z具有較低親和力)，受體結(jié)合試劑和多聚化試劑之間的非共價(jià)鍵可以被破壞。允許靶細(xì)胞從色譜基質(zhì)中洗脫，如從色譜基質(zhì)裝填于其中的柱子洗脫。收集洗脫液，由此收集靶細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，使用的源樣品，其包含或疑似包含靶細(xì)胞，且將受體結(jié)合試劑加入到源樣品中，以便允許形成上述包含靶細(xì)胞和在親和色譜基質(zhì)上的親和試劑的非共價(jià)復(fù)合物。作為示例性實(shí)例，血液樣品(例如全血樣品)或淋巴樣品可以定義這樣的源樣品(參見實(shí)施例部分)?？梢赃x擇具有所需靶細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)的受體結(jié)合試劑，其分別存在于血液或淋巴中。受體結(jié)合試劑，任選的某個(gè)緩沖液，可以加入到血液樣品或淋巴樣品中。所用緩沖液與用于平衡色譜基質(zhì)和用于后續(xù)洗滌的洗脫液至少基本上相同。隨后，樣品可以負(fù)載到色譜柱上。該色譜柱可以具有固定于其基質(zhì)上的親和試劑，所述親和試劑可以結(jié)合受體結(jié)合試劑。另外，在靶細(xì)胞的樣品應(yīng)用于親和色譜基質(zhì)之前，受體結(jié)合試劑可以已經(jīng)固定在親和色譜基質(zhì)上。在樣本如血液或淋巴樣品任選地與受體結(jié)合試劑已經(jīng)被完全負(fù)載到色譜柱上之后，可以用流動(dòng)相洗滌色譜基質(zhì)?？梢园谟糜谙礈焐V基質(zhì)的緩沖液中的競(jìng)爭(zhēng)試劑可以隨后被負(fù)載到色譜柱上。隨后，可以用流動(dòng)相洗滌色譜基質(zhì)。使用標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)，如光學(xué)檢測(cè)設(shè)備，可以監(jiān)測(cè)靶細(xì)胞的洗脫。然后可以收集靶細(xì)胞。因此，這樣的洗脫液可以包含受體結(jié)合試劑和/或競(jìng)爭(zhēng)試劑。

為了能夠進(jìn)一步純化靶細(xì)胞的洗脫液，色譜基質(zhì)(例如尺寸排阻色譜基質(zhì))可以包含親和試劑，其如固定在色譜基質(zhì)上的分子，具有能夠特異性結(jié)合到包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體b和/或結(jié)合到競(jìng)爭(zhēng)試劑的結(jié)合位點(diǎn)z。

因此，與上述一致，本文使用的尺寸排阻色譜基質(zhì)可以具有固定于其上的親和試劑。因?yàn)楦髯陨V基質(zhì)也能夠根據(jù)尺寸和/或形狀分離物質(zhì)，其也可以稱為混合模式色譜基質(zhì)。因此，在其中固定在這樣的尺寸排阻色譜基質(zhì)上的親和試劑不匹配受體結(jié)合試劑的實(shí)施方案中(原因是受體結(jié)合試劑具有結(jié)合位點(diǎn)，其不能與選擇的受體結(jié)合試劑形成復(fù)合物)，仍然可以采用混合模式色譜基質(zhì)作為尺寸排阻色譜基質(zhì)。在其中固定的親和試劑有結(jié)合位點(diǎn)且結(jié)合位點(diǎn)不具有與選擇的受體結(jié)合試劑形成復(fù)合物的能力的實(shí)施方案中，親和試劑可以用于使靶細(xì)胞可逆地固定在色譜基質(zhì)上。

用作色譜中流動(dòng)相的流體相可以是適用于保存靶細(xì)胞的生物活性的任何流體。通常，流體是液體。在一些實(shí)施方案中，相應(yīng)的液體是或包括水，例如以水性溶液的形式。其他組分可以包含在相應(yīng)的水性溶液中，例如溶解或懸浮于其中。作為示例性實(shí)例，水性溶液可以包含一個(gè)或多個(gè)緩沖化合物。多種緩沖化合物用于本領(lǐng)域，且可以用來(lái)執(zhí)行本文描述的各種方法。緩沖劑的實(shí)例包括但不限于磷酸鹽溶液如磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)、碳酸鹽、琥珀酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、甲酸鹽、巴比妥酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、馬來(lái)酸鹽、甲次砷酸鹽、硼酸鹽、n-(2-乙酰胺基)-2-氨基-乙磺酸酯(也稱為aces)、n-(2-羥乙基)-哌嗪-n’-2-乙磺酸(也稱為hepes)、4-(2-羥乙基)-1-哌嗪-丙磺酸(也稱為hepps)、哌嗪-1,4-二(2-乙磺酸酸)(也稱為pipes)、(2-[三(羥甲基)-甲氨基]-1-乙磺酸(也稱為tes)、2-環(huán)己胺-乙磺酸(也稱為ches)和n-(2-乙酰胺基)-亞氨基二乙酸鹽(也稱為ada)?？捎糜谶@些鹽的任何抗衡離子；銨、鈉和鉀可以作為示例性實(shí)例。緩沖劑的更多例子包括但不限于，三-乙醇胺、二乙醇胺、兩性離子緩沖劑如甜菜堿、乙胺、三乙胺、甘氨酸、雙甘氨肽、組氨酸、三(羥甲基)-氨基甲烷(也稱為tris)、二-(2-羥乙基)-亞氨基-三(羥甲基)-甲烷(也稱為bis-tris)和n-[三(羥甲基)-甲基]-甘氨酸(也稱為tricine)，這里只舉幾個(gè)例子。緩沖劑可以進(jìn)一步包括穩(wěn)定要被分離的靶細(xì)胞的組分，例如蛋白質(zhì)如(血清)白蛋白、生長(zhǎng)因子、微量元素等。選擇合適的流動(dòng)相在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)，且可以經(jīng)驗(yàn)性進(jìn)行。

與共同待審的國(guó)際專利申請(qǐng)pct/ep2012/063969(公開為wo2013/011011，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入用于所有目的)一致，受體結(jié)合試劑和靶細(xì)胞上的受體分子之間的結(jié)合強(qiáng)度對(duì)靶細(xì)胞與親和試劑經(jīng)由受體結(jié)合試劑的可逆結(jié)合可能不是必不可少的。相反，不考慮結(jié)合強(qiáng)度，意味著不論經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)b的受體結(jié)合試劑和受體分子之間的結(jié)合的離解常數(shù)(kd)具有低親和性，例如，kd的范圍是約10^-3至約10^-7m，或具有高親和性，例如，kd的范圍是約10^-7至約1×10^-10m，靶細(xì)胞均可以可逆地染色，只要經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)b的受體結(jié)合試劑和受體分子之間的結(jié)合的離解發(fā)生得足夠快。在這方面，經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)b的受體結(jié)合試劑和受體分子之間的離解速率常數(shù)(koff)可以具有約3×10^-5sec^-1或更高的值(這個(gè)離解速率常數(shù)是表征受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)b和靶細(xì)胞表面上的受體分子之間形成的復(fù)合物的離解反應(yīng)的常數(shù))。受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)b和靶細(xì)胞表面上的受體分子之間的離解反應(yīng)的離解速率常數(shù)(kon)可以具有任何值。為了確保受體分子和受體結(jié)合試劑之間的充分可逆結(jié)合，將結(jié)合平衡的koff值選擇為具有下述值是有益的：約3×10^-5sec^-1或更大，約5×10^-5sec^-1或更大，如約1×10^-4sec^-1或更大、約1.5×10^-4sec^-1或更大、約2.0×10^-4sec^-1或更大、約2.5×10^-4sec^-1或更大、約3×10^-4sec^-1或更大、約3.5×10^-4sec^-1或更大、約4×10^-4sec^-1或更大、約5×10^-4sec^-1或更大、約7.5×10^-4sec^-1或更大、約1×10^-3sec^-1或更大、約1.5×10^-3sec^-1或更大、約2×10^-3sec^-1或更大、約2.5×10^-3sec^-1或更大、約3×10^-3sec^-1或更大、約4×10^-3sec^-1、約5×10^-3sec^-1或更大、約7.5×10^-3sec^-1或更大、約1×10^-2sec^-1或更大、約5×10^-2sec^-1或更大、約1×10^-1sec^-1或更大或約5×10^-1sec^-1或更大。本文使用的關(guān)于koff速率、kon速率或kd(參見下述)的術(shù)語(yǔ)“約”意思是包含±20.0％的誤差范圍，包括±15.0％、±10.0％、±8.0％、±9.0％、±7.0％、±6.0％、±5.0％、±4.5％、±4.0.％、±3.5％、±3.0％、±2.8％、±2.6％、±2.4％、±2.2％、±2.0％、±1.8％、±1.6％、±1.4％、±1.2％、±1.0％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％或±0.01％。本文注意，本文使用的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)常數(shù)的值指大氣壓力條件，即1.013巴和室內(nèi)溫度，即25℃。

如果受體結(jié)合試劑用“a”表示，靶細(xì)胞表面上的受體用“b”表示，受體結(jié)合試劑和受體之間的復(fù)合物用“ab”表示，受體結(jié)合試劑和受體之間的雙分子相互作用可以由雙態(tài)過(guò)程描述，記為

該過(guò)程的相應(yīng)的離解kd常數(shù)定義為

在這些方程中，[a]、[b]和[ab]是在給定溫度和給定壓力下，受體、受體結(jié)合試劑(配體)和相應(yīng)復(fù)合物的平衡摩爾濃度。離解kd常數(shù)也可以表示為on-rate(kon)常數(shù)與off-rate(koff)常數(shù)之比，on-rate(kon)常數(shù)表示復(fù)合物的結(jié)合/形成的速度，也稱為結(jié)合速率常數(shù)，off-rate(koff)常數(shù)表示復(fù)合物的分離的速度，也稱為離解速率常數(shù)，其中

kd＝koff/kon

就這一點(diǎn)而言注意，離解常數(shù)kd定義一個(gè)已經(jīng)達(dá)到平衡的狀態(tài)。然而，在色譜分離的條件下，平衡不可能形成。在本發(fā)明中，這或許可以解釋為什么在一些實(shí)施方案中是off-rate(koff)常數(shù)而不是離解常數(shù)kd可以決定可逆結(jié)合可能等于或大于——以數(shù)量術(shù)語(yǔ)(sec^-1)為至少高達(dá)——3×10^-5sec^-1。

在一些實(shí)施方案中，受體結(jié)合試劑具有能夠特異性結(jié)合到受體分子的單一(單價(jià))結(jié)合位點(diǎn)b。在一些實(shí)施方案中，受體結(jié)合試劑具有能夠結(jié)合到受體分子的至少兩個(gè)(即多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)b，包括三個(gè)、四個(gè)或者五個(gè)相同的結(jié)合位點(diǎn)b)。在這些實(shí)施方案的任一個(gè)中，受體分子經(jīng)由(每個(gè))結(jié)合位點(diǎn)b的結(jié)合可以具有約3×10^-5sec^-1或更大的koff值。因此，受體結(jié)合試劑可以是單價(jià)的(例如單價(jià)抗體片段或單價(jià)人工合成結(jié)合分子(蛋白質(zhì)性的或其他)，如基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族多肽的突變蛋白(也稱為)，或是二價(jià)分子，如抗體或其中兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)均保留的片段，如f(ab')2片段。在一些實(shí)施方案中，受體分子可以是多價(jià)分子如五聚體ige分子，條件是koff速率為3×10^-5sec^-1或更大。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，它是在分子水平上(而不是經(jīng)由至少結(jié)合位點(diǎn)b的受體結(jié)合試劑和靶細(xì)胞上的受體分子的結(jié)合的koff速率(3×10-5sec^-1或更大))經(jīng)由本文描述的可逆細(xì)胞親和色譜技術(shù)提供(無(wú)痕)分離生物材料。而是并如美國(guó)專利7776562或國(guó)際專利申請(qǐng)wo02/054065所描述，受體分子和受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)b之間的低親和力與經(jīng)由固定化親和試劑介導(dǎo)的親合效應(yīng)一起允許靶細(xì)胞的可逆和無(wú)痕分離。在這些實(shí)施方案中，可以在親和試劑的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)z和至少兩個(gè)受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體c之間形成復(fù)合物，從而允許靶細(xì)胞的可逆固定化和隨后的從親和色譜基質(zhì)中洗脫靶細(xì)胞(經(jīng)由加入競(jìng)爭(zhēng)試劑，其將破壞形成于結(jié)合配偶體c和結(jié)合位點(diǎn)z之間的結(jié)合(復(fù)合)，進(jìn)而導(dǎo)致受體結(jié)合試劑從靶細(xì)胞離解)。如上所述，此低結(jié)合親和力可以由受體結(jié)合試劑經(jīng)由結(jié)合位點(diǎn)b和靶細(xì)胞表面上的受體分子的結(jié)合的離解常數(shù)(kd)表征，所述kd在約1.0×10^-3m至約1.0×10^-7m范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法可以用于消耗之前用于細(xì)胞分離的試劑樣品。例如，受體結(jié)合試劑和競(jìng)爭(zhēng)試劑可出現(xiàn)在如上所述親和色譜法的選擇濾筒的洗脫液中。使用根據(jù)本發(fā)明的方法，這種試劑可以至少基本上(包括完全)從樣品去除，例如從細(xì)胞群。作為示例性實(shí)例，如上定義的受體結(jié)合試劑可以從樣品中消耗至如facs或western印跡的檢測(cè)限值以下的水平?？梢允褂酶?jìng)爭(zhēng)試劑以便從親和純化基質(zhì)如親和色譜珠子中洗脫靶細(xì)胞。這種競(jìng)爭(zhēng)試劑具有能夠特異性結(jié)合到親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z的結(jié)合位點(diǎn)。在這樣的實(shí)施方案中，本發(fā)明各自的方法可以服務(wù)于消耗受體結(jié)合試劑和競(jìng)爭(zhēng)試劑，包括去除這些試劑。

在一些實(shí)施方案中，分離靶細(xì)胞的方法可以包括兩個(gè)純化步驟，其中只有第二步，即在“去除濾筒”中去除受體結(jié)合試劑和/或競(jìng)爭(zhēng)試劑，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行。第一步可以是美國(guó)專利7,776,562、美國(guó)專利8,298,782或國(guó)際專利申請(qǐng)wo02/054065中描述的分離靶細(xì)胞的方法。對(duì)于此樣品，然后可以進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的“去除方法”，以消耗靶細(xì)胞樣品中再其他細(xì)胞和受體結(jié)合試劑與競(jìng)爭(zhēng)試劑。同樣，根據(jù)美國(guó)專利7,776,562、美國(guó)專利8,298,782或國(guó)際專利申請(qǐng)wo02/054065在第一步中獲得的樣品也可以進(jìn)行如上所述的凝膠滲透色譜，其中使用沒(méi)有親和試劑固定于其上的沒(méi)有修飾的的色譜基質(zhì)。也可行的是，第一個(gè)分離步驟是任何其他用于分離細(xì)胞的已知現(xiàn)有技術(shù)，例如，美國(guó)專利6,022,951的實(shí)施例11中描述的方法，然后進(jìn)行在本發(fā)明的去除濾筒中實(shí)施的純化方法。

位于靶細(xì)胞表面(或生物實(shí)體的可及表面)上的受體分子可以是任何分子，只要其在根據(jù)本發(fā)明的方法中在色譜分離方法過(guò)程中保持共價(jià)或非共價(jià)鍵合到細(xì)胞表面即可。受體分子是受體結(jié)合試劑可以指向的分子。在一些實(shí)施方案中，受體是肽或蛋白質(zhì)，如膜受體蛋白。在一些實(shí)施方案中，受體是脂質(zhì)、多糖或核酸。作為蛋白的受體可以是外周膜蛋白或膜內(nèi)在蛋白。在某些實(shí)施方案中。它可以具有一個(gè)或多個(gè)跨膜的結(jié)構(gòu)域。作為一些示例性實(shí)例，具有跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白可以是g-蛋白耦合受體，如嗅覺(jué)受體、視紫紅質(zhì)受體、視紫紅質(zhì)信息素受體、肽激素受體、味覺(jué)受體、gaba受體、阿片類受體、5-羥色胺受體、ca²⁺受體、視黑素、神經(jīng)遞質(zhì)受體如配體門控的、電壓門控的或機(jī)械門控的受體，包括乙酰膽堿、煙堿、腎上腺素、去甲腎上腺素、兒茶酚胺、l-dopa-、多巴胺和5-羥色胺(生物胺、腦內(nèi)啡/腦啡肽)神經(jīng)肽受體、受體激酶如絲氨酸/蘇氨酸激酶、酪氨酸激酶、孔/通道蛋白如氯通道、鉀通道、鈉通道，omp蛋白、abc轉(zhuǎn)運(yùn)體(atp-結(jié)合盒-轉(zhuǎn)運(yùn)體)如氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、na-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體、na⁺/碘化物轉(zhuǎn)運(yùn)體，離子轉(zhuǎn)運(yùn)體如集光復(fù)合物、細(xì)胞色素c氧化酶、atp酶na/k、h/k、ca、細(xì)胞粘附受體如金屬蛋白酶、整合素或catherin。

在一些實(shí)施方案中，受體分子可以是定義所需的細(xì)胞群或亞群的抗原，例如血液細(xì)胞群或亞群，如淋巴細(xì)胞(如t細(xì)胞、t-輔助細(xì)胞如cd4⁺t-輔助細(xì)胞、b細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)、單核細(xì)胞或干細(xì)胞，如cd34-陽(yáng)性外周干細(xì)胞或nanog或oct-4表達(dá)干細(xì)胞。t-細(xì)胞的實(shí)例包括細(xì)胞如cmv-特異性cd8+t-淋巴細(xì)胞、細(xì)胞毒性t-細(xì)胞、記憶t-細(xì)胞和調(diào)節(jié)t-細(xì)胞(treg)。treg的示例性實(shí)例是cd4⁺cd25⁺cd45ratreg細(xì)胞，記憶t-細(xì)胞的示例性實(shí)例是cd62l⁺cd8+特異性中心記憶t-細(xì)胞。受體也可以是腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記物。

如上所示，受體結(jié)合試劑除了具有能夠結(jié)合受體分子的結(jié)合位點(diǎn)b之外，還具有結(jié)合配偶體c。這個(gè)結(jié)合配偶體c能夠結(jié)合到親和試劑的結(jié)合位z，其中多聚化試劑具有一個(gè)或多個(gè)用于結(jié)合配偶體c的結(jié)合位點(diǎn)。形成于包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c和親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z之間的非共價(jià)的鍵可以具有任何所需的強(qiáng)度和親和力，只要其在進(jìn)行本發(fā)明方法的條件下是可破壞的或可逆的即可。包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c和親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z之間的結(jié)合的離解常數(shù)(kd)可以具有約10^-2m至約10^-13m范圍內(nèi)的值。因此，這種可逆的鍵可以例如具有約10^-2m至約10^-13m、或從約10^-3m至約10^-12m或約10^-4m至約10^-11m、或約10^-5m至約10^-10m的kd值。這種鍵的k以及形成于受體結(jié)合試劑的結(jié)合位點(diǎn)b和受體分子之間的鍵的kd、koff和kon速率可以由任何合適的手段測(cè)定，例如，通過(guò)熒光滴定法、平衡透析或表面等離子體共振。受體分子結(jié)合試劑包括至少一個(gè)、包括兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)第二結(jié)合配偶體c，且親和試劑可包括至少兩個(gè)、如三、四、五、六、七、八個(gè)或更多個(gè)用于包含在受體分子結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體的結(jié)合位點(diǎn)。如美國(guó)專利7,776,562、美國(guó)專利8,298,782或國(guó)際專利申請(qǐng)wo2002/054065所述，可以選擇結(jié)合配偶體c和具有一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)z的親和試劑的任一組合，只要結(jié)合配偶體c和親和試劑的結(jié)合位點(diǎn)z能夠在(多價(jià))復(fù)合物中可逆地結(jié)合或多聚化從而產(chǎn)生親合效應(yīng)即可。

包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體可以是例如基于碳?xì)浠衔锏?包括聚合物)，且包括氮-、磷-、硫-、碳-、鹵素-或擬鹵素基團(tuán)。它可以是醇、有機(jī)酸、無(wú)機(jī)酸、胺、膦、硫醇、二硫化物、烷烴、氨基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖、低聚糖、或多聚糖。作為其它實(shí)例，它也可以是陽(yáng)離子、陰離子、聚陽(yáng)離子、聚陰離子、聚陽(yáng)離子、電解質(zhì)、聚電解質(zhì)、碳納米管或碳納米泡沫。通常，這種結(jié)合配偶體相比于其他物質(zhì)對(duì)多聚化試劑的結(jié)合位點(diǎn)具有更高的親和力。相應(yīng)結(jié)合配偶體的實(shí)例包括但不限于冠醚、免疫球蛋白、其片段和具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子。

在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c包含生物素，親和試劑包含一個(gè)鏈霉親和素類似物或與生物素可逆結(jié)合的抗生物素蛋白類似物。在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c包含一個(gè)與鏈霉親和素或抗生物素蛋白可逆結(jié)合的生物素類似物，親和試劑包含鏈霉親和素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素類似物或與相應(yīng)生物素類似物可逆結(jié)合的抗生物素蛋白類似物。在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c包含鏈霉親和素或抗生物素蛋白結(jié)合肽，親和試劑包含鏈霉親和素、抗生物素蛋白、鏈霉親和素類似物或與相應(yīng)鏈霉親和素或抗生物素蛋白結(jié)合肽可逆結(jié)合的抗生物素蛋白類似物。

在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體可以包含鏈霉親和素-結(jié)合肽trp-ser-his-pro-gln-phe-glu-lys，親和試劑可以包含鏈霉親和素突變蛋白(類似物)va144-thr45-ala46-arg47或鏈霉親和素突變蛋白(類似物)ile44-gly45-ala46-arg47，這兩個(gè)例如被描述在美國(guó)專利6,103,493中，且可以以商標(biāo)商購(gòu)獲得。鏈霉親和素結(jié)合肽可以例如是單一的肽如美國(guó)專利5,506,121中所描述的或是鏈霉親和素結(jié)合肽，如國(guó)際專利公開wo02/077018或美國(guó)專利7,981,632所描述，其具有兩個(gè)或更多個(gè)單獨(dú)的結(jié)合模塊的順序排布。

在一些實(shí)施方案中，受體結(jié)合試劑的結(jié)合配偶體c包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的部分作為親和標(biāo)簽。在這樣的實(shí)施方案中，親和試劑包含相應(yīng)的結(jié)合配偶體，例如已知結(jié)合到親和標(biāo)簽的抗體或抗體片段。作為已知親和標(biāo)簽的一些示例性實(shí)例，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體可以包含二硝基酚或異羥基洋地黃毒苷、寡組氨酸、多組氨酸、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、麥芽糖-結(jié)合蛋白、谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(cbp)或硫氧還蛋白、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(cbp)、flag’-肽、ha-標(biāo)簽(序列：tyr-pro-tyr-asp-val-pro-asp-tyr-ala)、vsv-g-標(biāo)簽(序列：tyr-thr-asp-ile-glu-met-asn-arg-leu-gly-lys)、hsv-標(biāo)簽(序列：gln-pro-glu-leu-ala-pro-glu-asp-pro-glu-asp)、t7表位(ala-ser-met-thr-gly-gly-gln-gln-met-gly)、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)、單純皰疹病毒糖蛋白d的序列g(shù)ln-pro-glu-leu-ala-pro-glu-asp-pro-glu-asp的hsv表位、序列g(shù)lu-gln-lys-leu-ile-ser-glu-glu-asp-leu的轉(zhuǎn)錄因子c-myc的“myc”表位、v5-標(biāo)簽(序列：gly-lys-pro-ile-pro-asn-pro-leu-leu-gly-leu-asp-ser-thr)、或谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)。在這樣的實(shí)施方案中，形成于親和試劑(在這種情況下為抗體或抗體片段)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和抗原之間的復(fù)合物可以通過(guò)加入游離抗原而被競(jìng)爭(zhēng)性地破壞，所述游離抗原即游離肽(表位標(biāo)簽)或游離抗原蛋白質(zhì)(如mbp或cbp)。親和標(biāo)簽也可以是寡核苷酸標(biāo)簽。例如，這樣的寡核苷酸標(biāo)記可以用于與具有互補(bǔ)序列的寡核苷酸雜交，所述寡核苷酸連接到或包含在親和試劑中。

合適的結(jié)合配偶體的其他實(shí)例包括但不限于凝集素、蛋白質(zhì)a、蛋白質(zhì)g、金屬、金屬離子、次氮基三乙酸衍生物(nta)、rgd-基序、右旋糖苷、聚乙烯亞胺(pei)、氧化還原聚合物、糖蛋白、適體、染料、直鏈淀粉、麥芽糖、纖維素、幾丁質(zhì)、谷胱甘肽、鈣調(diào)蛋白、明膠、多粘菌素、肝素、nad、nadp、賴氨酸、精氨酸、苯甲脒、多聚u或寡-dt。凝集素如伴刀豆球蛋白a已知結(jié)合到多糖和糖基化蛋白。染料的示例性實(shí)例是三嗪染料如活性藍(lán)f3g-a(cb)或紅色he-3b，其特異性結(jié)合nadh-依賴酶。greena結(jié)合到輔酶a蛋白、人血清白蛋白和脫氫酶。染料7-氨基放線菌素d和4',6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚結(jié)合到dna。金屬陽(yáng)離子如ni、cd、zn、co或cu通常用于結(jié)合親和標(biāo)簽如包含的寡組氨酸序列，包括六組氨酸或his-asn-his-arg-his-lys-his-gly-gly-gly-cys標(biāo)簽(mat標(biāo)簽)和n-甲基丙烯酰-(l)-半胱氨酸甲酯。

在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c和親和試劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間的結(jié)合以存在二階、三價(jià)或四價(jià)陽(yáng)離子產(chǎn)生。在這方面，在一些實(shí)施方案中，親和/多聚化試劑包括二階、三價(jià)或四價(jià)陽(yáng)離子，通常通過(guò)合適的螯合劑保持，例如復(fù)合。在這樣的實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體可以包括包含(例如復(fù)合)二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)陽(yáng)離子的部分。相應(yīng)的金屬螯合劑的實(shí)例包含但不限于乙二胺、乙二胺四乙酸(edta)、乙二醇四乙酸(egta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、n,n-二(羧甲基)甘氨酸(也稱為次氮基三乙酸，nta)、1,2-二(鄰氨基苯氧基)-乙烷-n,n,n',n'–三乙酸(bapta)、2,3-二巰基-1-丙醇(二巰基丙醇)、卟啉和血紅素。作為一個(gè)實(shí)例，edta與大多數(shù)單價(jià)、二價(jià)、三價(jià)和四價(jià)金屬離子形成復(fù)合物，如銀(ag⁺)、鈣(ca²⁺)、錳(mn²⁺)、銅(cu²⁺)、鐵(fe²⁺)、鈷(co³⁺)和鋯(zr⁴⁺)，而bapta對(duì)于ca²⁺是特異性的。作為示例性實(shí)例，本領(lǐng)域使用的標(biāo)準(zhǔn)方法是在掛組氨酸標(biāo)簽和銅(cu²⁺)、鎳(ni²⁺)、鈷(co²⁺)或鋅(zn²⁺)離子之間形成復(fù)合物，其通過(guò)螯合劑次氮基三乙酸(nta)的方式呈現(xiàn)。

在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c包含鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，親和試劑包含如在美國(guó)專利5,985,658中所描述的多聚體鈣調(diào)蛋白。在一些實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c包含flag肽，親和試劑包含與flag肽結(jié)合的抗體，如與美國(guó)專利4,851,341所描述的單克隆抗體4e11結(jié)合的flag肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c包含寡組氨酸標(biāo)簽，親和試劑包含結(jié)合寡組氨酸標(biāo)簽的抗體或過(guò)渡金屬離子。所有這些結(jié)合復(fù)合物的破壞可以通過(guò)金屬離子螯合如鈣螯合完成，例如通過(guò)加入edta或egta(上述)。鈣調(diào)蛋白，抗體如4e11或螯合金屬離子或游離螯合劑可以通過(guò)常規(guī)方法多聚體化，如通過(guò)與鏈霉親和素或抗生物素蛋白或其多聚體的生物素化和絡(luò)合，或在第一步中通過(guò)引入羧基殘基到如葡聚糖的多糖，基本上如noguchi,a等人bioconjugatechemistry(1992)3,132-137中所述，且在第二步中，使用常規(guī)碳二亞胺化學(xué)經(jīng)由伯胺基團(tuán)連接鈣調(diào)蛋白或抗體或螯合金屬離子或游離螯合劑到多糖如葡聚糖骨架中的羧基。在這樣的實(shí)施方案中，包含在受體結(jié)合試劑中的結(jié)合配偶體c和多聚化試劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)z之間的結(jié)合可以被金屬離子螯合破壞。例如，金屬螯合可以通過(guò)加入egta或edta完成。

在一些實(shí)施方案中，親和試劑是鏈霉親和素或抗生物素蛋白或鏈霉親和素或抗生物素蛋白的任何類似物的低聚物或聚合物。結(jié)合位點(diǎn)z是鏈霉親和素或抗生物素蛋白的天然的抗生物素結(jié)合。相應(yīng)的低聚物或聚合物可以被多糖交聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一步中，鏈霉親和素或抗生物素蛋白或鏈霉親和素或抗生物素蛋白的類似物的低聚物或聚合物，通過(guò)將羧基殘基引入到多糖如葡聚糖中來(lái)制備，基本上如noguchi,a等人bioconjugatechemistry(1992)3,132-137中所述。然后在第二步中，使用常規(guī)碳二亞胺化學(xué)，鏈霉親和素或抗生物素蛋白或其類似物可以經(jīng)由內(nèi)部賴氨酸殘基的伯胺基團(tuán)和/或游離n-端連接到葡聚糖骨架中的羧基。然而，鏈霉親和素或抗生物素蛋白或鏈霉親和素或抗生物素蛋白的任何類似物的交聯(lián)低聚物或聚合物也可以通過(guò)經(jīng)由用作連接子的雙功能分子(如戊二醛)交聯(lián)或通過(guò)本領(lǐng)域描述的其他方法獲得。

在本發(fā)明的方法中，特異性結(jié)合到受體分子的受體分子結(jié)合試劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可以例如是抗體、其片段和具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子。(重組)抗體片段的實(shí)例是fab片段、fv片段、單鏈fv片段(scfv)、二價(jià)抗體片段如(fab)2’-片段、雙體、三體(iliades,p.,等人,febslett(1997)409,437-441)、十體(stone,e.,等人,journalofimmunologicalmethods(2007)318,88–94)和其他結(jié)構(gòu)域抗體(holt,l.j.,等人,trendsbiotechnol.(2003),21,11,484-490)。在一些實(shí)施方案中，受體分子結(jié)合試劑的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)可以是二價(jià)蛋白質(zhì)性人工結(jié)合分子如二聚體脂質(zhì)運(yùn)載蛋白突變蛋白，其也被稱為“duocalin”。在一些實(shí)施方案中，受體結(jié)合試劑可以具有單一第二結(jié)合位點(diǎn)，即它可以是單價(jià)的。單價(jià)受體結(jié)合試劑的實(shí)例包含但不限于單價(jià)抗體片段、具有抗體樣結(jié)合特性的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子或mhc分子。單價(jià)抗體片段的實(shí)例包含但不限于fab片段、fv片段、和單鏈fv片段(scfv)，包括二階單鏈fv片段。

如上所述，具有抗體樣功能的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子的實(shí)例是基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族多肽的突變蛋白(參見例如，wo03/029462，beste等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.(1999)96,1898-1903)。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，例如膽汁三烯結(jié)合蛋白、人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶-相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、人載脂蛋白d或人淚脂質(zhì)運(yùn)載蛋白，擁有可以被修飾的天然配體-結(jié)合位點(diǎn)，使得它們結(jié)合給定的靶。具有抗體樣結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)性結(jié)合分子的其他實(shí)例可以用作特異性結(jié)合到受體分子的受體結(jié)合試劑，所述實(shí)例包括但不限于所謂的glubody(參見如國(guó)際專利申請(qǐng)wo96/23879)，基于錨蛋白支架(mosavi,l.k.,等人,proteinscience(2004)13,6,1435-1448)或晶體支架(如國(guó)際專利申請(qǐng)wo01/04144)的蛋白，skerra,j.mol.recognit.(2000)13,167-187中所描述的蛋白質(zhì)，adnectin、tetranectin和avimer。avimer包括通過(guò)人受體結(jié)構(gòu)域家族的外顯子改組進(jìn)化的多價(jià)avimer蛋白質(zhì)，其含有作為多個(gè)結(jié)構(gòu)域串形式在若干細(xì)胞表面受體中出現(xiàn)的所謂的a-結(jié)構(gòu)域(silverman,j.,等人,naturebiotechnology(2005)23,1556-1561)。adnectin源自人纖連蛋白的結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)可以針對(duì)與靶的免疫球蛋白樣結(jié)合進(jìn)行改造的環(huán)(gill,d.s.&damle,n.k.,currentopinioninbiotechnology(2006)17,653-658)。tetranectin源于相應(yīng)人同源三聚體蛋白質(zhì)，同樣在可以針對(duì)所需結(jié)合進(jìn)行改造的c-型凝集素結(jié)構(gòu)域中包含環(huán)區(qū)(出處同上)。peptoid可以作為蛋白質(zhì)配體，是不同于肽的寡(n-烷基)甘氨酸，與肽的區(qū)別在于側(cè)鏈連接到酰胺氮而非α碳原子。peptoid通?？沟鞍酌负推渌揎椕福冶入木哂懈叩枚嗟募?xì)胞滲透性(參見例如kwon,y.-u.,和kodadek,t.,j.am.chem.soc.(2007)129,1508-1509)。

適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)性結(jié)合分子的其他實(shí)例是egf-樣結(jié)構(gòu)域、kringle-結(jié)構(gòu)域、纖連蛋白i型結(jié)構(gòu)域、纖連蛋白ii型結(jié)構(gòu)域、纖連蛋白iii型結(jié)構(gòu)域、pan結(jié)構(gòu)域、g1a結(jié)構(gòu)域、srcr結(jié)構(gòu)域、kunitz/bovine胰腺胰蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、淀粉酶抑制劑(tendamistat)、kazal-型絲氨酸蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、trefoil(p-型)結(jié)構(gòu)域、血管性血友病因子c型結(jié)構(gòu)域、過(guò)敏毒素樣結(jié)構(gòu)域、cub結(jié)構(gòu)域、甲狀腺球蛋白i型重復(fù)、ldl-受體a類結(jié)構(gòu)域、sushi結(jié)構(gòu)域、連接(link)結(jié)構(gòu)域、血小板反應(yīng)蛋白i型結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域或免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(例如，結(jié)構(gòu)域抗體或駱駝重鏈抗體)、c-型凝集素結(jié)構(gòu)域、mam結(jié)構(gòu)域、血管性血友病因子a型結(jié)構(gòu)域、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素b結(jié)構(gòu)域、wap-型四二硫化物核心結(jié)構(gòu)域、f5/8c型結(jié)構(gòu)域、血液結(jié)合素結(jié)構(gòu)域、sh2結(jié)構(gòu)域、sh3結(jié)構(gòu)域、層粘連蛋白-型egf-樣結(jié)構(gòu)域、c2結(jié)構(gòu)域、“kappabody”(參見ill.e等人，proteineng(1997)10,949-57)、所謂的“小體(minibody)”(martin等人,emboj(1994)13,5303-5309)、雙體(參見holliger等人，pnasusa(1993)90,6444-6448)、所謂的“janusis”(參見traunecker等人，emboj(1991)10,3655-3659或traunecker等人，intjcancer(1992)增刊7,51-52)、納米抗體、微體、affilin、affibody、knottin、泛素、鋅指蛋白、自體熒光蛋白或富含亮氨酸的重復(fù)序列蛋白。具有抗體樣功能的核酸分子的實(shí)例是適體。適體折疊成限定的三維基序并且顯示對(duì)于給定靶結(jié)構(gòu)的高親和性。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“核酸分子”是指任何可能結(jié)構(gòu)的核酸，如單鏈、雙鏈或其組合。核酸包括例如dna分子、rna分子、使用核苷酸類似物或使用核酸化學(xué)產(chǎn)生的dna或rna類似物、鎖核酸分子(lna)、pna分子(如上)和tecto-rna分子(例如liu,b.,等人，j.am.chem.soc.(2004)126,4076-4077)。pna分子是具有偽肽骨架的合成核酸類似物，其中例如dna或rna中存在的磷酸二酯骨架被短脂肪族部分重復(fù)單元替換，所述短脂肪族部分重復(fù)單元具有氨基端和羧基端，從而在低聚物或聚合物中形成酰胺鍵。lna分子具有修飾的在c4'和o2'之間具有亞甲基橋的rna骨架，所述亞甲基橋鎖定n型結(jié)構(gòu)的呋喃糖環(huán)，從而提供具有更高的雙重穩(wěn)定性和核酸酶抗性的相應(yīng)分子。不像pna分子，lna分子具有帶電骨架。dna或rna可以具是基因組的或合成起源，且可以是單鏈或雙鏈的。這種核酸可以是如mrna、crna、合成rna、基因組dna、cdna合成dna、dna和rna的共聚物、寡核苷酸等。相應(yīng)的核酸可以還包含非天然核苷酸類似物和/或被連接到親和標(biāo)簽或標(biāo)記。

根據(jù)本發(fā)明的方法可以在任何溫度下實(shí)施，在所述溫度下至少基本上不損害靶細(xì)胞的生存力。當(dāng)本文中提及至少基本上不是有害的、不是不利的或者至少基本上不影響生存力的條件時(shí)，是指在這種條件下可以回收的具有全部生存力的靶細(xì)胞的百分比是至少70％，包含至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法在約20℃或以下，例如約14℃或以下、約9℃或以下或約6℃或以下的溫度下實(shí)施。根據(jù)要被分離的靶細(xì)胞，合適的溫度范圍可以是例如約2℃至約45℃，包含約℃至約40℃、約3℃至約35℃，或約4℃至約30℃，如果水性基質(zhì)用來(lái)包含靶細(xì)胞的話。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法在恒溫值下實(shí)施，或者在選擇的溫度值±約5℃、±約4℃、±約3℃、±約2℃、±約1℃或±約0.5℃下實(shí)施。溫度可以例如選擇為具有約5℃、約10℃、約15℃、約20℃或約25℃的值。在一些實(shí)施方案中，在根據(jù)本發(fā)明的方法過(guò)程中改變溫度，即被增加、減少或通過(guò)其組合改變。例如溫度可以在以上定義的范圍內(nèi)改變，如造約2℃至約40℃范圍內(nèi)或約3℃至約35℃范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠憑借經(jīng)驗(yàn)確定合適的溫度，綜合考慮細(xì)胞的性質(zhì)和分離條件。例如，分離溫度不敏感細(xì)胞如癌細(xì)胞可在室溫或甚至升高的溫度如37℃下進(jìn)行。

所述方法也可以使用部件套件實(shí)施，所述套件例如設(shè)計(jì)為進(jìn)行如上詳述的方法。所述套件包可以包括如上定義的受體結(jié)合試劑。所述套件例如可以包括填充如在溶液中的受體結(jié)合試劑的容器。所述套件還可以包括如上定義的色譜基質(zhì)，其可以(預(yù))裝填到柱子如濾筒中。在一些實(shí)施方案中，與這種色譜基質(zhì)和/或容器相關(guān)的，提供以如何使用該套件來(lái)實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的方法的說(shuō)明書形式的通知。

本發(fā)明還提供了鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白(類似物)、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突變蛋白(類似物)或其混合物用于經(jīng)由色譜分離靶細(xì)胞的用途，其中所述色譜是凝膠過(guò)濾色譜。為此，實(shí)施方案中，鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突變蛋白或這些中任意的混合物如鏈霉親和素和鏈霉親和素突變蛋白的混合物，作為親和試劑固定在本文描述的“去除濾筒”的固定相上。本文使用的術(shù)語(yǔ)“鏈霉親和素”包括野生型鏈霉親和素、鏈霉親和素突變蛋白和鏈霉親和素-樣多肽。同樣，本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗生物素蛋白”包括野生型抗生物素蛋白以及抗生物素蛋白的突變蛋白，如親和素、精氨酸修飾的去糖基抗生物素蛋白(其表現(xiàn)出更中性的pi并且可以作為天然抗生物素蛋白的替代物獲得)。去糖基的中性形式的抗生物素蛋白包括那些可商購(gòu)獲得的形式，如可通過(guò)sigma-aldrich獲得的“extravidin”，或可從thermoscientific或invitrogen獲得的“neutravidin”。

在野生型鏈霉親和素(wt-streptavidin)中，涉及argarana等人，nucleicacidsres.14(1986)1871-1882公開的氨基酸序列。鏈霉親和素突變蛋白與野生型鏈霉親和素序列具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸置換、缺失或添加的多肽，并且所述多肽保留野生型鏈霉親和素的結(jié)合特性。鏈霉親和素-樣多肽和鏈霉親和素突變蛋白是在免疫學(xué)上與野生型鏈霉親和素基本上相同的多肽，并且尤其能夠以與野生型鏈霉親和素相同或不同的親和力結(jié)合生物素、生物素衍生物或生物素類似物。鏈霉親和素-樣多肽或鏈霉親和素突變蛋白可以含有不是野生型鏈霉親和素的部分的氨基酸，或者它們可以只包含野生型鏈霉親和素的一部分。鏈霉親和素-樣多肽也是不同于野生型鏈霉親和素的多肽，因?yàn)樗拗鳑](méi)有將宿主產(chǎn)生的多肽轉(zhuǎn)換為野生型鏈霉親和素的結(jié)構(gòu)所需的酶。術(shù)語(yǔ)“鏈霉親和素”還包括鏈霉親和素四聚體和鏈霉親和素二聚體，尤其是鏈霉親和素同源四聚體、鏈霉親和素同源二聚體、鏈霉親和素異源四聚體和鏈霉親和素異源二聚體。每個(gè)亞基通常都具有生物素或生物素類似物的結(jié)合位點(diǎn)或鏈霉親和素-結(jié)合肽的結(jié)合位點(diǎn)。鏈霉親和素或鏈霉親和素突變蛋白的實(shí)例在例如wo86/02077、de19641876a1、us6,022,951、wo98/40396或wo96/24606中提到。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于經(jīng)由色譜(其中所述色譜是凝膠過(guò)濾色譜)分離靶細(xì)胞的鏈霉親和素突變蛋白是在美國(guó)專利6,103,493和de19641876.3中描述的鏈霉親和素突變蛋白?；谝吧玩溍褂H和素的氨基酸序列，這些鏈霉親和素突變蛋白在氨基酸位點(diǎn)44至53的區(qū)域內(nèi)具有至少一個(gè)突變。優(yōu)選最小的鏈霉親和素的突變蛋白，其n-端起始于野生型鏈霉親和素的氨基酸10至16的區(qū)域，并且c-端結(jié)束于野生型鏈霉親和素的氨基酸133至142的區(qū)域。這種優(yōu)選的鏈霉親和素突變蛋白的實(shí)例在位點(diǎn)44具有疏水脂肪族氨基酸(而非glu)、在位點(diǎn)45具有任何氨基酸、在位點(diǎn)46具有疏水脂肪族氨基酸或/和在位點(diǎn)47具有堿性氨基酸(而非val)。鏈霉親和素突變蛋白可以是突變蛋白va144-thr45-ala46-arg47或鏈霉親和素突變蛋白(類似物)ile44-gly45-ala46-arg47，這兩個(gè)被描述在美國(guó)專利6,103,493中，例如其可以以商標(biāo)商購(gòu)獲得。

本發(fā)明還提供了用于純化靶細(xì)胞的設(shè)備，其中所述設(shè)備包括如上所述用于色譜的第一固定相和第二固定相的至少一個(gè)裝置，所述第一固定相和第二固定相意味著用于細(xì)胞選擇的色譜柱(選擇濾筒)和用于去除分離或染色靶細(xì)胞的試劑的第二色譜柱(去除濾筒)。進(jìn)行這樣的兩步驟分離程序產(chǎn)生可以直接進(jìn)行下一個(gè)所需的應(yīng)用或選擇循環(huán)的靶細(xì)胞。相比于facs和macs選擇，在本發(fā)明色譜選擇方法中，在兩個(gè)選擇循環(huán)之間不需要如洗滌和離心的進(jìn)一步程序，并且細(xì)胞在功能上并不被如受體結(jié)合試劑或磁珠的結(jié)合的分離試劑損害。因此，本發(fā)明首次提供一個(gè)可靠的、構(gòu)造簡(jiǎn)單的但仍有效純化靶細(xì)胞的設(shè)備。

與上述一致，本發(fā)明要求保護(hù)的設(shè)備可以包括多個(gè)串聯(lián)流體連接的第一固定相和第二固定相(色譜柱)的裝置。所述設(shè)備可以包括樣品入口，所述樣品入口流體連接到用于色譜的第一固定相和第二固定相的第一裝置的第一固定相。所述設(shè)備還包括用于純化的靶細(xì)胞的樣品出口，所述樣品出口流體連接到用于色譜的第一固定相和第二固定相的至少一個(gè)裝置的最后一個(gè)的第二固定相。所述設(shè)備還包括競(jìng)爭(zhēng)試劑容器，所述容器流體連接到用于色譜的第一固定相和第二固定相的裝置的第一固定相中的至少一個(gè)。

由于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠很容易領(lǐng)會(huì)本發(fā)明的公開內(nèi)容，根據(jù)本發(fā)明可以同樣采用目前存在的或以后將被開發(fā)的物質(zhì)、手段、用途、方法或步驟的其他組合，所述組合執(zhí)行與本文描述的相應(yīng)的示例性實(shí)施方案基本上相同的功能或獲得基本上相同的結(jié)果。

具體實(shí)施方案

在當(dāng)前實(shí)施例中，重組生產(chǎn)的針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物的fab片段用作受體結(jié)合試劑。fab片段在大腸桿菌或其他宿主中重組表達(dá)，并且包含鏈霉親和素結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體c。四聚體的鏈霉親和素或四聚體的鏈霉親和素突變蛋白提供了一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)z。將fab片段結(jié)合到鏈霉親和素，所述鏈霉親和素本身共價(jià)連接到珠子上。這些珠子用于細(xì)胞懸浮液的親和柱層析，所述細(xì)胞懸浮液具有含細(xì)胞外蛋白(受體分子)的細(xì)胞亞群，這些蛋白能夠由fab片段結(jié)合。未結(jié)合的細(xì)胞在此“選擇濾筒”被沖走，而結(jié)合的細(xì)胞隨后用含有生物素的緩沖液洗脫，所述緩沖液破壞fab片段(作為受體結(jié)合試劑)的鏈霉親和素結(jié)合肽和鏈霉親和素突變蛋白之間的結(jié)合。因此，具有細(xì)胞結(jié)合于其上的fab片段從柱子上釋放，并且由于失去親合效應(yīng)，fab片段從靶細(xì)胞離解?，F(xiàn)在可以使用另一個(gè)具有共價(jià)結(jié)合的鏈霉親和素的凝膠(色譜)基質(zhì)，通過(guò)第二柱層析，從剩余fab片段和生物素中純化懸浮液，由此在空隙體積中洗脫細(xì)胞，而fab片段和生物素定量結(jié)合在色譜基質(zhì)中。細(xì)胞現(xiàn)在可以進(jìn)行進(jìn)一步的純化循環(huán)，所述循環(huán)以相同的方式使用不同的fab片段或任何其他受體結(jié)合試劑。具有fab片段的柱子(選擇濾筒)和隨后的fab和生物素去除柱子(去除濾筒)可以以連續(xù)方式通過(guò)簡(jiǎn)單線性一個(gè)接一個(gè)地設(shè)置柱子而連接。通過(guò)這樣做，本發(fā)明可以提供如圖6所示自動(dòng)化細(xì)胞純化系統(tǒng)，所述系統(tǒng)沒(méi)有磁珠或任何手動(dòng)干預(yù)，并且允許快速、簡(jiǎn)易和低成本的靶細(xì)胞純化。

例如，這個(gè)程序允許t-細(xì)胞連續(xù)純化，該純化起始于cd4+純化，隨后是從cd8+級(jí)分的cd25+純化，從而得到如下所示的調(diào)節(jié)t-細(xì)胞的高度富集的級(jí)分。使用不同fab片段的進(jìn)一步純化循環(huán)當(dāng)然是可能的。

從人血液中分離cd8+t-細(xì)胞(典型的單步純化)

材料與方法

人血液用于使用標(biāo)準(zhǔn)程序分離pcmb。

實(shí)施例1：經(jīng)由柱色譜單步純化cd8+細(xì)胞

sephadexg50(sigma)用作固定相，使用cnbr方法與(重組鏈霉親和素變體，ibagmbh，德國(guó))共價(jià)耦合。sephadexg50的50％懸浮液包含共價(jià)耦合的70微克的珠子懸浮液。作為親和試劑，在加入受體結(jié)合試劑和含有靶細(xì)胞的樣品之前，親和試劑被固定在親和基質(zhì)中?？缮藤?gòu)獲得的(產(chǎn)品編號(hào)：6-8003，來(lái)自ibagmbh，哥廷根，德國(guó))cd8+結(jié)合的fab片段用作(單價(jià))受體結(jié)合試劑，所述片段的重鏈在羧基端融合有順序設(shè)置的兩個(gè)鏈霉親和素結(jié)合模塊(sawshpqfek(gggs)2ggsawshpqfek)，鏈霉親和素結(jié)合肽作為結(jié)合配偶體c。

用10微克cd8+結(jié)合fab片段在4℃下孵育含有的sephadexg50的2ml懸浮液20分鐘，以允許fab片段結(jié)合cd8+靶細(xì)胞。然后將懸浮液填充到底部有90微米熔塊的塑料微型柱(mobitec，哥廷根，德國(guó))中。因此，此柱子作為本文定義的選擇濾筒。用含0.5％牛血清白蛋白的pbs(磷酸鹽緩沖鹽水)(pbsa緩沖液)平衡柱子，得到1ml的床體積。將1mlpbsa中來(lái)自pcmb的5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞負(fù)載到柱子中，以便使樣品透入親和色譜基質(zhì)。然后用12mlpbsa洗滌柱子。收集洗滌緩沖液，然后3000g離心6分鐘，以沉淀從柱子中洗滌的細(xì)胞(沉淀物1)。此后，6ml含有0.1毫摩爾生物素(sigma)(作為競(jìng)爭(zhēng)試劑)的pbsa被加入到柱子中，以便洗脫經(jīng)由受體結(jié)合和多聚化試劑可逆固定在柱子上的cd8+細(xì)胞。收集包含生物素的級(jí)分，然后同上離心以沉淀細(xì)胞(沉淀物2)。

在1mlpbsa中重懸來(lái)自兩個(gè)級(jí)分的沉淀物，以用于分析。

沉淀物1包含約390萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，沉淀物2包含70萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。

facs分析(數(shù)據(jù)未顯示)顯示，cd8+細(xì)胞中，相對(duì)于沉淀物1，起始材料大量消耗cd8+細(xì)胞(約70％)，沉淀物2顯示純度為68％的cd8+細(xì)胞。因此，可以經(jīng)由可逆固定/親和色譜法分離cd8+靶細(xì)胞。

通過(guò)以下實(shí)驗(yàn)證實(shí)了從pbmc中富集cd8+細(xì)胞的整個(gè)結(jié)果，結(jié)果如圖5所示。在包含如上所解釋的耦合的sephadex-50樹脂的兩個(gè)柱子上實(shí)施了富集。第一個(gè)柱子(選擇濾筒)(圖b-d)負(fù)載了從如上所述ibagmbh商購(gòu)獲得的cd8結(jié)合fab片段。第二個(gè)柱子(圖e-g)用作這個(gè)選擇濾筒的陰性對(duì)照(不得與去除濾筒混淆，所述去除濾筒是設(shè)置在選擇濾筒后的“第二個(gè)柱子”)，并且未負(fù)載這個(gè)cd8結(jié)合fab片段。因此，第一個(gè)柱子應(yīng)該顯示細(xì)胞的cd8-fab-特異性富集，而第二個(gè)柱子(陰性對(duì)照)則不應(yīng)該這樣。為了測(cè)定富集情況，在開始選擇程序之前，測(cè)定pbmc中的cd8+t-細(xì)胞的細(xì)胞群(圖5，圖a，cd8+t-細(xì)胞18.4％，右上象限)。使pbmc級(jí)分設(shè)置到第一個(gè)柱子上之后，測(cè)定流經(jīng)的非阻滯細(xì)胞(圖b，cd8+t-細(xì)胞6.3％)。12.1％(18.4％-6.3％)或66％的cd8+t-細(xì)胞結(jié)合到柱子上。然后，可以通過(guò)加入生物素緩沖液(破壞strep-標(biāo)簽/相互作用)和隨后的洗滌步驟(圖c+d，cd8+t-細(xì)胞47％和62.2％)特異性洗脫這些細(xì)胞。相比之下，在第二個(gè)柱子中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)cd8+t-細(xì)胞的富集(圖d-e-f-g)，原因是流經(jīng)級(jí)分中(圖e，cd8+t-細(xì)胞，17.0％)和洗脫餾分中(圖f和g)的cd8+t-細(xì)胞群沒(méi)有明顯不同于選擇程序之前(圖a)。所應(yīng)用細(xì)胞的約1％差別是柱子上未特異性結(jié)合的細(xì)胞的原因，顯示所應(yīng)用pbma的95％通過(guò)該柱子。

實(shí)施例2：從c8+細(xì)胞中去除生物素和fab

如上所述分離cd8+細(xì)胞，不同的是，生物素洗脫(6ml緩沖液)之后的細(xì)胞直接通過(guò)superflow^tm珠子(6ml床體積)的柱子，所述珠子具有共價(jià)結(jié)合于其上的(ibagmbh，哥廷根，德國(guó))，具有300nm生物素/ml的結(jié)合能力。而superflow^tm珠子作為凝膠滲透基質(zhì)用于分離/富集靶細(xì)胞，固定在珠子上的對(duì)配有鏈霉親和素結(jié)合肽的cd8+fab和生物素都有親和力。因此，作為生物素和cd8+fab片段的親和/去除試劑。收集填充superflow珠子的第二個(gè)柱子(作為去除濾筒)的洗脫液(6ml)。

用western印跡試驗(yàn)，使用生物素分析和fab片段分析，在包含靶細(xì)胞的洗脫液中未檢出生物素和fab片段(結(jié)果未顯示)。使用fitc標(biāo)記的生物素(sigma)和熒光標(biāo)記的cd8+fab(ibagmbh)實(shí)施一個(gè)類似的實(shí)驗(yàn)。當(dāng)用敏感熒光計(jì)測(cè)量時(shí)，證實(shí)最終洗脫液中不含fab片段或生物素這一事實(shí)。因此，發(fā)現(xiàn)生物素和fab被完全去除，superflow^tm/色譜之后的洗脫液包含95％至100％的cd8+細(xì)胞，細(xì)胞沒(méi)有明顯損失。

實(shí)施例3：“線性流動(dòng)”色譜的連續(xù)純化

由于實(shí)驗(yàn)2所描述的最后級(jí)分不含生物素和fab(通過(guò)阻斷上的fab結(jié)合位點(diǎn)，兩者都會(huì)干擾后續(xù)純化過(guò)程)，純化的cd8+細(xì)胞可以進(jìn)入另一個(gè)純化循環(huán)，該循環(huán)使用例如cd25+fab片段(或存在于被分離的cd8+靶細(xì)胞的表面上的任何其他受體分子)?？梢允褂萌鐖D6a或圖6b中所描述的設(shè)備實(shí)施這樣的t-細(xì)胞的連續(xù)純化。

實(shí)施例4：通過(guò)色譜在平面基質(zhì)上純化細(xì)胞(涂覆的硝化纖維素膜)

在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用于純化實(shí)施例1和2中的細(xì)胞的(“三維”)柱色譜基質(zhì)(涂覆有的珠子)被涂覆的平面基質(zhì)代替。

實(shí)驗(yàn)程序：

1)非共價(jià)結(jié)合到硝化纖維素膜和純化cd8+t細(xì)胞。

關(guān)于在膜上的非共價(jià)結(jié)合，將一塊硝化纖維素膜(24cm²，whatman,uk)放在皮氏培養(yǎng)皿中并用10mlpbs中的4mg(ibagmbh)孵育10分鐘，然后用20mlpbs洗5次。然后加入5微克cd8+fab片段(產(chǎn)品編號(hào)：6-8003-005，ibagmbh，哥廷根，同上)到5mlpbs中，4℃孵育5分鐘。然后加入facs緩沖液(0.5％bsa(w/v)，在pbs中，ph7.4)中的5百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞(pbmc)并在4℃孵育10分鐘。然后在10mlfacs緩沖液中洗滌膜五次，收集洗滌級(jí)分用于facs分析。然后將膜在10ml包含1mmol生物素的facs緩沖液中孵育5分鐘。收集所得級(jí)分用于facs分析。

facs分析表明，含有生物素的級(jí)分為關(guān)于cd8+t細(xì)胞99.1％純的。與原始材料相比，cd8+細(xì)胞的產(chǎn)量為約1.5％。因此，這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明，使用平面色譜法以“批狀”方式可以有效地分離靶細(xì)胞。

實(shí)施例5：通過(guò)有superflowtm瓊脂糖的柱層析法單步純化人類cd8+細(xì)胞

將3mlsuperflow(300nm生物素結(jié)合，ibagmbh，哥廷根，德國(guó))被負(fù)載到微型柱(mobitec，哥廷根，德國(guó))上。用緩沖液(pbs加上0.5％的牛血清白蛋白,“facs緩沖液”)平衡柱子，然后負(fù)載來(lái)自人血液的pbmc(1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，在0.2mlfacs緩沖液中)，所述pbmc之前已經(jīng)用12微克抗cd8的fab(產(chǎn)品編號(hào)：6-8003，ibagmbh，哥廷根)孵育(如上所述，fab-片段的重鏈在羧基端融合有順序設(shè)置的兩個(gè)鏈霉親和素結(jié)合模塊sawshpqfek(gggs)2ggsawshpqfek)。此柱子用作本文定義的選擇濾筒。用12mlfacs緩沖液通過(guò)重力流洗滌柱子，然后用12ml包含1mm生物素的facs緩沖液進(jìn)行洗脫。

facs緩沖液的洗滌級(jí)分(12ml)僅包含1.77％的cd8+細(xì)胞，相比之下起始級(jí)分(a)包含7.98％的cd8+細(xì)胞，因此77.8％的cd8+細(xì)胞在柱子上被阻滯。用包含生物素的緩沖液級(jí)分(b，12ml)洗脫導(dǎo)致大約65％的結(jié)合的cd8+細(xì)胞，純度為98.5％。這個(gè)實(shí)驗(yàn)也表明，可以經(jīng)由本文描述的可逆固定/親和色譜法使用商購(gòu)可得的色譜基質(zhì)分離cd8+靶細(xì)胞。

實(shí)施例6：經(jīng)由柱色譜法單步純化人cd8+細(xì)胞

通過(guò)使用柱子從密度梯度(ficoll)純化的pbmc中純化人cd8+細(xì)胞，所述柱子由500μl-瓊脂糖(從agarosebeadstechnologies,madrid,spain獲得的交聯(lián)瓊脂糖，其排阻尺寸相比于superflow^tm瓊脂糖減小)珠子樹脂制得，所述珠子樹脂用10μg抗-cd8fab-片段(產(chǎn)品編號(hào)：6–8003，ibagmbh，哥廷根)官能化。為此，在細(xì)胞純化之前，通過(guò)以300μl/min的速度泵送1000μl包含fab的洗滌緩沖液(pbs加上0.5％牛血清白蛋白)經(jīng)過(guò)柱子，在重鏈c端攜帶順序設(shè)置的兩個(gè)鏈霉親和素結(jié)合模塊sawshpqfek(gggs)2ggsawshpqfek的fab片段被負(fù)載(固定)到-瓊脂糖基質(zhì)上。為了純化靶細(xì)胞，用蠕動(dòng)泵以300μl/min的流量，自動(dòng)負(fù)載1x10⁸現(xiàn)配的pbmc(在2ml洗滌緩沖液中)到柱子上。隨后，以2ml/min的速度，通過(guò)用總共7ml的洗滌緩沖液重復(fù)洗滌循環(huán)(4x)，從柱子中去除未結(jié)合的(cd8-陰性)細(xì)胞。最后，通過(guò)加入5ml100μmd-生物素溶液(v＝600μl/min)并且用5ml洗滌緩沖液以2ml/min洗脫，從親和基質(zhì)中去除結(jié)合的細(xì)胞，從而從柱子中洗脫cd8+靶細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析獲得的cd8-陽(yáng)性和-陰性級(jí)分。純化cd8+靶細(xì)胞，產(chǎn)量為80％，純度為88％。相應(yīng)的起始-、陰性-和陽(yáng)性-級(jí)分的點(diǎn)狀圖以及代表選擇的相應(yīng)純度和產(chǎn)量如圖7所示。

實(shí)施例7：經(jīng)由柱色譜法單步從全血中純化人cd8+細(xì)胞

通過(guò)使用柱子從全血中純化人cd8+細(xì)胞，所述柱子由1200μl-瓊脂糖(從agarosebeadstechnologies,madrid,spain獲得的交聯(lián)瓊脂糖，其排阻尺寸相比于superflow^tm瓊脂糖減小)珠子樹脂制得，所述珠子樹脂用30μg抗-cd8fab-片段(產(chǎn)品編號(hào)：6–8003，ibagmbh，哥廷根)官能化。為此，在細(xì)胞純化之前，通過(guò)以300μl/min的速度泵送1500μl包含fab片段的洗滌緩沖液(pbs加上0.5％牛血清白蛋白)經(jīng)過(guò)柱子，在重鏈c端攜帶順序設(shè)置的兩個(gè)鏈霉親和素結(jié)合模塊sawshpqfek(gggs)2ggsawshpqfek的fab片段被固定到-瓊脂糖基質(zhì)上。為了純化靶細(xì)胞，用蠕動(dòng)泵以300μl/min的流量，自動(dòng)負(fù)載10ml現(xiàn)抽全血(用洗滌緩沖液1:1稀釋)到柱子上。隨后，以2ml/min的速度，通過(guò)用總共13ml的洗滌緩沖液重復(fù)洗滌循環(huán)(4x)，從柱子中去除未結(jié)合的(cd8-陰性)細(xì)胞。最后，通過(guò)加入10ml100μmd-生物素溶液(v＝600μl/min)并且用10ml洗滌緩沖液以2ml/min洗脫，從親和基質(zhì)中去除結(jié)合的細(xì)胞，從而從柱子中洗脫cd8+靶細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析獲得的cd8-陽(yáng)性和-陰性級(jí)分。純化cd8+靶細(xì)胞，產(chǎn)量為80％，純度為88％。相應(yīng)的起始-、陰性-和陽(yáng)性-級(jí)分的點(diǎn)狀圖以及代表選擇的相應(yīng)純度和產(chǎn)量如圖8所示。

實(shí)施例8：基于移液器的從脾細(xì)胞中單步純化鼠cd4+細(xì)胞

通過(guò)使用移液器從脾細(xì)胞中分離cd4+細(xì)胞，所述移液器負(fù)載80μl-瓊脂糖珠子樹脂(從agarosebeadstechnologies,madrid,spain獲得的交聯(lián)瓊脂糖，其排阻尺寸相比于superflow^tm瓊脂糖減小)，所述珠子樹脂用2μg抗-cd4fab-片段(產(chǎn)品編號(hào)：6–8003，ibagmbh，哥廷根)官能化。移液器頭填充phynexusinc.,usa的瓊脂糖材料。所用的fab片段包含cd4結(jié)合抗體gk1.5的野生型可變結(jié)構(gòu)域(dialynasdp等人,immunolrev.1983；74:29-56,genbankentrykappalightchain:m84148.1genbankentryheavychain:m84149.1)，在重鏈c端攜帶順序設(shè)置的兩個(gè)鏈霉親和素結(jié)合模塊sawshpqfek(gggs)2ggsawshpqfek。在細(xì)胞純化之前，通過(guò)使用手持電動(dòng)移液器將400μl包含fab片段的洗滌緩沖液(pbs加上0.5％牛血清白蛋白)以300μl/min的速度吸移到瓊脂糖色譜基質(zhì)上，實(shí)現(xiàn)fab片段負(fù)載/固定到-瓊脂糖基質(zhì)上。為了純化靶細(xì)胞，使用移液管以300μl/min的速度，通過(guò)樣品的3x重復(fù)上下循環(huán)，將1x10⁷鼠脾細(xì)胞(0.5ml洗滌緩沖液)應(yīng)用到存在于移液器頭的色譜基質(zhì)中。這個(gè)具有包含細(xì)胞的緩沖液的上下運(yùn)動(dòng)“批狀”色譜程序相當(dāng)于使用用于使細(xì)胞固定在色譜基質(zhì)上的基于流動(dòng)-的方法。隨后，通過(guò)用1ml洗滌緩沖液以2ml/min的速度三次重復(fù)洗滌(通過(guò)上下吸移洗滌緩沖液)從移液器頭去除未結(jié)合的(cd4-陰性)細(xì)胞。最后，通過(guò)加入1ml100μmd-生物素溶液(v＝600μl/min)并且用2ml(2x1ml)洗滌緩沖液以2ml/min的流量洗脫，從親和基質(zhì)中去除結(jié)合的細(xì)胞，從而從移液器頭中洗脫cd4+靶細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析獲得的cd4-陽(yáng)性和-陰性級(jí)分。純化cd4+靶細(xì)胞，產(chǎn)量為95％，純度為85％。相應(yīng)的起始-、陰性-和陽(yáng)性-級(jí)分的點(diǎn)狀圖以及代表選擇的相應(yīng)純度和產(chǎn)量如圖9所示。

實(shí)施例9：經(jīng)由柱色譜法單步純化人cd4+細(xì)胞

通過(guò)使用移液器頭從密度梯度(ficoll)純化的pbmc中純化人cd4+細(xì)胞，所述移液器頭負(fù)載80μl-瓊脂糖(從agarosebeadstechnologies,madrid,spain獲得的交聯(lián)瓊脂糖，其排阻尺寸相比于superflow^tm瓊脂糖減小)珠子樹脂制得，所述珠子樹脂用2μg抗-cd4fab-片段官能化。使用的cd4fab片段是美國(guó)專利7,482,000和bes,c.,等人.jbiolchem278,14265-14273(2003))所描述的13b8.2fab的突變體。稱為“m13b8.2”的突變體fab片段攜帶cd4結(jié)合鼠抗體13b8.2的可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域，所述恒定結(jié)構(gòu)域由用于重鏈的γ1型恒定人ch1結(jié)構(gòu)域和κ型恒定人輕鏈結(jié)構(gòu)域組成，如美國(guó)專利7,482,000中所描述的。相比于m13b8.2中的13b8.2fab片段的可變結(jié)構(gòu)域，輕鏈位點(diǎn)91的his殘基(在seqidno:2中為位點(diǎn)93)突變成ala，并且重鏈位點(diǎn)53的arg殘基(在seqidno:1中為位點(diǎn)55)突變成ala。此外，fab片段m13b8.2在重鏈c端攜帶順序設(shè)置的兩個(gè)鏈霉親和素結(jié)合模塊sawshpqfek(gggs)2ggsawshpqfek。在細(xì)胞純化之前，通過(guò)使用手持電動(dòng)移液器將200μl包含fab片段的洗滌緩沖液以300μl/min的速度吸移，將fab片段固定到-瓊脂糖基質(zhì)上。為了選擇靶細(xì)胞，使用移液管以300μl/min的速度，通過(guò)樣品的3x重復(fù)上下循環(huán)，將1x10⁷現(xiàn)配的pbmc(在0.5ml洗滌緩沖液中)(pbs加上0.5％牛血清白蛋白)自動(dòng)應(yīng)用到存在于移液器頭的色譜基質(zhì)中。隨后，通過(guò)用1ml洗滌緩沖液以2ml/min的速度三次重復(fù)洗滌(通過(guò)上下吸移洗滌緩沖液)，從移液器頭去除未結(jié)合的(cd8-陰性)細(xì)胞。最后，通過(guò)加入1ml100μmd-生物素溶液(v＝600μl/min)并且用2ml(2x1ml)洗滌緩沖液以2ml/min的流量洗脫，從親和基質(zhì)中去除結(jié)合的細(xì)胞，從而從移液器頭中洗脫cd4+靶細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析獲得的cd4-陽(yáng)性和-陰性級(jí)分。純化cd4+靶細(xì)胞，產(chǎn)量為90％，純度為99％。相應(yīng)的起始-、陰性-和陽(yáng)性-級(jí)分的點(diǎn)狀圖以及代表選擇的相應(yīng)純度和產(chǎn)量如圖10所示。

實(shí)施例10：基于移液器的從全血中單步純化人cd4+細(xì)胞

通過(guò)使用移液器頭從全血中分離cd4+細(xì)胞，所述移液器負(fù)載80μl-瓊脂糖(從agarosebeadstechnologies,madrid,spain獲得的交聯(lián)瓊脂糖，其排阻尺寸相比于superflow^tm瓊脂糖減小)珠子樹脂制得，所述珠子樹脂用0.5μg抗-cd4fab-片段官能化。實(shí)施例9中所用的cd4結(jié)合fab片段m13b8.2也用于實(shí)施例10。在細(xì)胞分離之前，通過(guò)使用手持電動(dòng)移液器將200μl包含fab的洗滌緩沖液以300μl/min的速度吸移，將fab片段固定在-瓊脂糖基質(zhì)上。為了分離靶細(xì)胞，使用移液管以300μl/min的速度，通過(guò)3x重復(fù)上下循環(huán)，將2ml現(xiàn)抽全血(用洗滌緩沖液1:1稀釋)(pbs加上0.5％牛血清白蛋白)自動(dòng)應(yīng)用到存在于移液器頭的色譜基質(zhì)中。隨后，通過(guò)1ml的洗滌緩沖液以2ml/min的速度5次重復(fù)洗滌(通過(guò)上下吸移)，從移液器頭去除未結(jié)合的(cd4-陰性)細(xì)胞。最后，通過(guò)加入1ml100μmd-生物素溶液(v＝600μl/min)并且用2ml(2x1ml)洗滌緩沖液以2ml/min洗脫，從親和介質(zhì)中移除結(jié)合的細(xì)胞，從而從移液器頭中洗脫cd4+靶細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析獲得的cd4-陽(yáng)性和-陰性級(jí)分。純化cd4+靶細(xì)胞，產(chǎn)量為88％，純度為70％。相應(yīng)的起始-、陰性-和陽(yáng)性-級(jí)分的點(diǎn)狀圖以及代表選擇的相應(yīng)純度和產(chǎn)量如圖11所示。

在本文中，注意對(duì)于如在實(shí)施例4至11中獲得的靶細(xì)胞的進(jìn)一步純化或進(jìn)一步用途，作為洗脫液的生物素和作為相應(yīng)的受體結(jié)合試劑的fab片段可以通過(guò)實(shí)施例2中描述的“去除濾筒”從靶細(xì)胞樣品中去除。

本說(shuō)明書中之前發(fā)表文件的列表或討論不一定看做是承認(rèn)該文件是現(xiàn)有技術(shù)的一部分或公知常識(shí)。

在缺乏未在本文具體公開的任何一個(gè)或多個(gè)元素、一個(gè)或多個(gè)限制的情況下，可以適當(dāng)?shù)貙?shí)施本文示例性描述的本發(fā)明。因此，例如，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包括”、“含有”等應(yīng)該在廣義上理解且沒(méi)有限制。此外，本文使用的術(shù)語(yǔ)和表述被用作描述性術(shù)語(yǔ)且沒(méi)有限制，在使用這些術(shù)語(yǔ)和表述時(shí)，沒(méi)有排除顯示和描述的特征或其部分的等同物的意思，而是應(yīng)認(rèn)識(shí)到各種修改均可在發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)理解的是，盡管本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)示例性實(shí)施方案和可選特征進(jìn)行了具體公開，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以尋求對(duì)其中體現(xiàn)的發(fā)明做出修改和變化，這樣的修改和變化被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。.

本文已經(jīng)全面且一般地描述了本發(fā)明。落入一般公開內(nèi)容內(nèi)的每個(gè)較窄種類和亞屬分組也形成本發(fā)明的部分。這包括本發(fā)明的一般描述，其具有從屬中移除任何主題的條件或否定限制，無(wú)論離體材料是否在本文專門敘述。

其他實(shí)施方案在以下權(quán)利要求范圍內(nèi)。此外，在本發(fā)明的功能或方面以馬庫(kù)什組的方式描述時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明也由此以馬庫(kù)什組的任何個(gè)體成員或成員亞組的形式描述。

序列表

<110>朱諾治療有限公司

<120>細(xì)胞和其它復(fù)雜生物材料的色譜分離

<130>lc14310012p-d

<150>us61/602,150

<151>2012-02-23

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<223>fab片段m13b8.2的重鏈

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210215220

alatrpserhisproglnpheglulysglyglyglyserglyglygly

225230235240

serglyglyseralatrpserhisproglnpheglulys

245250

<210>2

<211>218

<212>prt

<213>人

<220>

<223>fab片段m13b8.2的輕鏈

<400>2

alametaspileglnmetthrglnserproalaserleuseralaser

151015

valglygluthrvalthrphethrcysargalaserglumetiletyr

202530

sertyrleualatrptyrglnglnlysglnglylysserproglnleu

354045

leuvalhisaspalalysthrleualagluglyvalproserargphe

505560

serglyglyglyserglythrglnpheserleulysileasnthrleu

65707580

glnprogluasppheglythrtyrtyrcysglnalahistyrglyasn

859095

proprothrpheglyglyglythrlysleugluilelysargglyile

100105110

alaalaproservalpheilepheproproseraspgluglnleulys

115120125

serglythralaservalvalcysleuleuasnasnphetyrproarg

130135140

glualalysvalglntrplysvalaspasnalaleuglnserglyasn

145150155160

serglngluservalthrgluglnaspserlysaspserthrtyrser

165170175

leuserserthrleuthrleuserlysalaasptyrglulyshislys

180185190

valtyralacysgluvalthrhisglnglyleuserserprovalthr

195200205

lysserpheasnargglyglucysglyser

210215

<210>3

<211>8

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>鏈霉親和素-結(jié)合肽

<400>3

trpserhisproglnpheglulys

15

<210>4

<211>9

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>ha-標(biāo)簽

<400>4

tyrprotyraspvalproasptyrala

15

<210>5

<211>11

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>vsv-g.標(biāo)簽

<400>5

tyrthraspileglumetasnargleuglylys

1510

<210>6

<211>11

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>hsv-標(biāo)簽

<400>6

glnprogluleualaprogluaspprogluasp

1510

<210>7

<211>10

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>t7表位

<400>7

alasermetthrglyglyglnglnmetgly

1510

<210>8

<211>10

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>myc-表位

<400>8

gluglnlysleuileserglugluaspleu

1510

<210>9

<211>14

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>v5-標(biāo)簽

<400>9

glylysproileproasnproleuleuglyleuaspserthr

1510

<210>10

<211>11

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>mat-標(biāo)簽

<400>10

hisasnhisarghislyshisglyglyglycys

1510

<210>11

<211>4

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>鏈霉親和素突變蛋白

<400>11

valthralaarg

1

<210>12

<211>4

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>鏈霉親和素突變蛋白類似物

<400>12

ileglyalaarg

1

<210>13

<211>30

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>鏈霉親和素結(jié)合模塊

<400>13

seralatrpserhisproglnpheglulysglyglyglyserglygly

151015

glyserglyglyseralatrpserhisproglnpheglulys

202530