本發(fā)明涉及一種用于MALDI-TOF MS且具有微納米結(jié)構(gòu)的改進(jìn)基片，屬于質(zhì)譜檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

MALDI-TOF-MS是Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry的英文縮寫，即基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，又稱MALDI TOF，它是近年來發(fā)展起來的一種軟電離新型有機(jī)質(zhì)譜，通過引入基質(zhì)分子，使待測(cè)分子不產(chǎn)生碎片，解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性生物大分子解吸離子化的問題，是分析難揮發(fā)的有機(jī)物質(zhì)的重要手段之一。MALDI TOF在世界范圍內(nèi)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，并廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和制藥企業(yè)的藥物開發(fā)、科研領(lǐng)域的生物分析和化學(xué)檢測(cè)以及安全部門的核輻射、化學(xué)物質(zhì)和生物病原體的監(jiān)測(cè)等。

MALDI-TOF MS的原理是：當(dāng)用一定強(qiáng)度的激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場(chǎng)作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即測(cè)定離子的質(zhì)量電荷之比(M/Z)與離子的飛行時(shí)間成正比來檢測(cè)離子。MALDI-TOF MS的中心技術(shù)就是依據(jù)樣品的質(zhì)荷比(m/z)的不同來進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)得樣品分子的分子量。根據(jù)MALDI-TOF MS的原理，MALDI-TOF MS具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、分辨率高、圖譜簡(jiǎn)明、質(zhì)量范圍廣及速度快等特點(diǎn)，在操作上制樣簡(jiǎn)便、可微量化、大規(guī)模、并行化和高度自動(dòng)化處理待檢生物樣品，而且在測(cè)定生物大分子和合成高聚物應(yīng)用方面有特殊的優(yōu)越性。近年來已成為檢測(cè)和鑒定多肽、蛋白質(zhì)、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多種合成聚合物的強(qiáng)有力工具。如應(yīng)用MALDI-TOF MS測(cè)定蛋白質(zhì)酶解的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)、源后裂解(PSD)碎片離子圖譜、并結(jié)合質(zhì)譜網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，可獲得多肽、蛋白質(zhì)的序列。應(yīng)用MALDI-TOF對(duì)基因組單核苷酸多態(tài)性(SNPs)進(jìn)行分析檢測(cè)，可區(qū)分和鑒別相對(duì)分子質(zhì)量達(dá)7,000左右(含20多個(gè)堿基)、僅存在1個(gè)堿基差別的不同DNA。特別值得指出的是，MALDI-TOF已成為生命科學(xué)領(lǐng)域蛋白質(zhì)組研究中必不可缺的重要關(guān)鍵技術(shù)之一。

MALDI-TOF可以解決當(dāng)前蛋白組學(xué)中以下幾種潛在的挑戰(zhàn)，即生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)、分子診斷研發(fā)、蛋白質(zhì)高通量分析和蛋白質(zhì)組圖譜，但絕不局限于此，MALDI-TOF MS應(yīng)用于生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)和在分子層次上對(duì)疾病機(jī)理進(jìn)行揭示，從而被應(yīng)用于分子診斷、目標(biāo)治療以及個(gè)性化用藥，將為人們更完整地提示生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝調(diào)控等生命活動(dòng)的規(guī)律和嚴(yán)重疾病的發(fā)生機(jī)理，為人類進(jìn)行疾病的診斷防治和新藥開發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。

MALDI-TOF由于具備快速分析、操作簡(jiǎn)易、自動(dòng)化、樣品用量少和高通量等特點(diǎn)，可直接檢測(cè)血清、血漿、尿液、腦脊液、關(guān)節(jié)腔滑液、支氣管洗脫液、細(xì)胞裂解液、組織提取物和各種分泌物，應(yīng)用MALDI-TOF形成規(guī)模化的重大疾病、重要生物資源的蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)組指紋圖譜或質(zhì)譜肽圖研究技術(shù)平臺(tái)，可建立具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)疾病的相關(guān)蛋白譜和具有重要應(yīng)用前景的生物標(biāo)記分子譜，以揭示疾病的發(fā)生機(jī)制，作為早期診斷、分子分型、療效及預(yù)后判斷的依據(jù)，并找出可能成為新藥設(shè)計(jì)的分子靶點(diǎn)，為疾病提供新的治療方案?；贛ALDI-TOF的蛋白質(zhì)組圖譜、質(zhì)譜肽圖、生物標(biāo)記物譜等分析診斷的發(fā)展將是分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一場(chǎng)革命，它不僅提供了一種新的診斷方法，并且具有很高的可行性，它可在數(shù)分鐘時(shí)間內(nèi)從微量血液中測(cè)出上萬個(gè)結(jié)果并對(duì)其進(jìn)行分析。

對(duì)此，本發(fā)明人首先采用MALDI-TOF MS進(jìn)行血清等生物樣品分離、多肽譜快速掃描和疾病特征峰測(cè)序，在研究人類重要生理和病理過程中重要生物標(biāo)志物譜實(shí)驗(yàn)確證和分析技術(shù)，獲得若干與人類重大疾病相關(guān)的重要生物標(biāo)志物譜，應(yīng)用于重大疾病的早期預(yù)警和病程判斷。如本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了用于發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤血清標(biāo)志物譜，創(chuàng)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的我國(guó)常見惡性腫瘤人群的“血清質(zhì)譜多肽譜”，獲得腫瘤早期預(yù)警、病程判斷的質(zhì)譜數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，例如中國(guó)授權(quán)專利200810172142.0、“一種用于檢測(cè)肝癌特征蛋白模型的制備方法”、中國(guó)授權(quán)專利200810147419.4、“用于檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤特征蛋白質(zhì)譜模型的制備方法”、中國(guó)授權(quán)專利201110216986.2、“用于檢測(cè)肺癌蛋白的質(zhì)譜模型及構(gòu)建方法”。另外，根據(jù)質(zhì)譜技術(shù)在針對(duì)核酸與待測(cè)物(如微生物、特定來源成分)或癥狀(齲齒、老年癡呆、遺傳性耳聾)的研究中，本發(fā)明人也獲得眾多的中國(guó)授權(quán)專利，例如中國(guó)授權(quán)專利201310158363.3、“制備細(xì)菌核酸指紋特征譜庫(kù)的方法”，中國(guó)授權(quán)專利201310368422.X、“檢測(cè)齲齒蛋白的質(zhì)譜模型及構(gòu)建方法”，中國(guó)授權(quán)專利201310175514.6、“用于檢測(cè)與遺傳性耳聾相關(guān)的基因SNP的引物系統(tǒng)及其用途”。因此，針對(duì)MALDI-TOF MS發(fā)展用于“血清質(zhì)譜多肽譜”的疾病相關(guān)數(shù)據(jù)挖掘的生物信息學(xué)工具和疾病診斷軟件，可應(yīng)用于臨床并推向市場(chǎng)。無論對(duì)于科研領(lǐng)域、醫(yī)療系統(tǒng)，還是生物市場(chǎng)皆具有廣闊的前景。

由于在MALDI-TOF的檢測(cè)載體(靶板或基片)上形成超薄且均一的樣品結(jié)晶，一直是改進(jìn)質(zhì)譜圖質(zhì)量的研究方向之一，因此出現(xiàn)一些相關(guān)的研究。中國(guó)授權(quán)專利201410090967.3、“制備親疏水相間的微陣列芯片及其用于質(zhì)譜成像定量分析的方法”提供了一種通過在芯片上設(shè)置疏水和親水區(qū)域來制備檢測(cè)芯片，其中采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)將疏水性聚合物(聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯)按照設(shè)計(jì)好的模板刷在導(dǎo)電玻璃上，其中涂布區(qū)為疏水區(qū)，空白區(qū)作為預(yù)留的親水區(qū)。然后，用親水材料(如樣品體系的水溶液)涂布空白區(qū)，形成均一間隔的親水區(qū)和疏水區(qū)。該方法通過利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)來設(shè)計(jì)模板形狀，預(yù)先在親水區(qū)留出空白區(qū)(又稱“留白處理”)，因此需要特殊的印刷設(shè)備和操作軟件，同時(shí)在涂布疏水區(qū)時(shí)靶板要絕對(duì)靜置。同時(shí)，絲網(wǎng)印刷技術(shù)的精度低，親疏水區(qū)域的分界不能達(dá)到微米精度。并且，需要將待測(cè)混合物體系水溶液均勻地鋪在親水區(qū)，芯片烘干固化，置于烘箱中60攝氏度固化2h，增加了生產(chǎn)時(shí)間和成本。

中國(guó)授權(quán)專利201110401165.6、“對(duì)生物樣品進(jìn)行富集和除鹽凈化處理的方法”公開了一種利用疏水和親水材料制備具有封閉圖案化表面的檢測(cè)靶板的方法，包括通過在基底上構(gòu)筑具有較大直徑的聚合物涂層(如聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯或光刻膠)作為擋層圓區(qū)，然后以含氟單分子層或蒸鍍金屬層作為疏水層貼在整個(gè)基底上。由于該疏水層不能粘附在上述擋層圓區(qū)，因此將靶板浸入有機(jī)溶劑中進(jìn)行超聲處理，可以除去擋層圓區(qū)。最后，再將所述聚合物涂層在所述圓區(qū)內(nèi)部突變較小直徑的同心圓，從而獲得疏水外圈(含氟單分子層或蒸鍍金屬層)-親水中圈-疏水內(nèi)圈(聚合物涂層)的同心圓圖案的質(zhì)譜靶板，因此該方法又稱“擋層涂布”。然而，該方法在基底上構(gòu)筑疏水-親水-疏水區(qū)域的封閉圖案化表面，需要進(jìn)行兩步疏水處理，即采用含氟的試劑在100～250℃下加熱生長(zhǎng)1～5個(gè)小時(shí)，工藝復(fù)雜，過程耗時(shí)。由于該方法需要精確控制兩次聚合物涂層的間距，間距過小導(dǎo)致外圈和內(nèi)圈相連，同時(shí)由于使用兩種不同的疏水材料來分別突變不同的基底表面，所獲得的疏水區(qū)液滴的接觸角過小，導(dǎo)致疏水效果差，影響了普通實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

中國(guó)專利申請(qǐng)200610023671.5、公開了“一種低豐度蛋白靶上一步除鹽與富集的方法”，其中通過疏水聚合物(聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚氟乙烯等)預(yù)先在靶板的樣品池中央部分進(jìn)行涂布，然后進(jìn)行蛋白點(diǎn)樣，使得蛋白樣品富集在疏水聚合物層上。然后，將基質(zhì)溶液加入點(diǎn)樣區(qū)，使得蛋白樣品中的污染物和無機(jī)鹽擴(kuò)散出去，最后得到樣品和基質(zhì)均勻細(xì)致的結(jié)晶。由于該方法是直接將蛋白樣品加到疏水層，通過加入過量的基質(zhì)溶液來進(jìn)行純化，雖然客觀上有一定純化效果，但造成了蛋白樣品的浪費(fèi)。同時(shí)，如果手動(dòng)操作將0.2μl疏水性聚合物溶液點(diǎn)在每個(gè)Kapton膜的小孔內(nèi)，耗時(shí)，且0.2μl溶液的精度難以控制，影響小孔表面疏水均一性；如果自動(dòng)操作，需要配置相應(yīng)點(diǎn)樣設(shè)備，增加成本，制備復(fù)雜，并不適合不易制備的微量蛋白樣品的檢測(cè)和應(yīng)用。

由于上述靶板的在先研究中，或是靶板表面沒有親水疏水差異，(如中國(guó)專利200610023671.5)，導(dǎo)致結(jié)晶形態(tài)差，或是形成親水疏水差異的涂層，但親疏水分界不能達(dá)到微米精度或液滴接觸角過小，但制備過程過于復(fù)雜，不能節(jié)約時(shí)間和成本(如中國(guó)專利201410090967.3、專利201110401165.6)，或是需要額外的裝置和檢測(cè)軟件，或是需要過多的珍貴蛋白樣本進(jìn)行檢測(cè)，這些都導(dǎo)致質(zhì)譜檢測(cè)樣本峰的準(zhǔn)確度低，信噪比低，基線高。

另外，隨著MALDI TOF在生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)、分子診斷研發(fā)、蛋白質(zhì)高通量分析和蛋白質(zhì)組圖譜領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，提供較為簡(jiǎn)單、便利和廉價(jià)的靶板也成為了現(xiàn)實(shí)需求。為此，本發(fā)明人在先授權(quán)專利201520142252.8、“質(zhì)譜檢測(cè)用的疏水性濃縮靶板”中，提供一種制備靶板的簡(jiǎn)易方法，其中，使用不銹鋼或鋁合金的靶板主體，通過使用疏水性材料(如聚丙烯或聚乙烯或含氧烷基聚合物)貼膜或涂布靶板表面。其中，該靶板設(shè)有與樣品室底部的契合關(guān)系的形狀或結(jié)構(gòu)，并通過不同的橫排和豎列標(biāo)識(shí)的組合，以定位不同的樣品。由于含有樣品的基質(zhì)在點(diǎn)樣區(qū)域因疏水作用發(fā)生聚集，可以降低樣品用量，并通過干燥結(jié)晶后再進(jìn)行質(zhì)譜，取得良好的效果。實(shí)驗(yàn)證明，具有上述特定形狀和結(jié)構(gòu)的疏水性濃縮靶板，明顯優(yōu)于單一的金屬靶板，同時(shí)具有樣品定位準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，符合質(zhì)譜要求。

如上所述，由于靶板上的樣品形成完好結(jié)晶能在一定上有利于獲得高質(zhì)量的質(zhì)譜檢測(cè)圖，并且出于生產(chǎn)成本的考慮，獲得能夠高質(zhì)量結(jié)晶且制備簡(jiǎn)單和廉價(jià)的質(zhì)譜靶板成為技術(shù)人員不斷深入的研究目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服傳統(tǒng)質(zhì)譜檢測(cè)靶板表面沒有親水疏水差異，導(dǎo)致結(jié)晶形態(tài)差，質(zhì)譜檢測(cè)樣本峰的準(zhǔn)確度低，信噪比低，基線高，同時(shí)制備成本過高和復(fù)雜的缺點(diǎn)，液滴接觸角過小影響疏水性能的缺陷，本發(fā)明提供一種用于MALDI-TOF檢測(cè)且具有微納米結(jié)構(gòu)的改進(jìn)基片，通過在表面增加靶板的親水與疏水性差異，使待測(cè)樣本在基片定位孔內(nèi)形成完好結(jié)晶，提高質(zhì)譜檢測(cè)譜圖質(zhì)量，以及鑒定結(jié)果準(zhǔn)確度。

因此，本發(fā)明第一目的是提供一種用于MALDI-TOF檢測(cè)且具有微納米結(jié)構(gòu)的改進(jìn)基片，包括具有親水性的點(diǎn)樣區(qū)、點(diǎn)樣區(qū)外的疏水區(qū)基片，其中：

所述基片的表面被硅烷偶聯(lián)劑處理，從而形成疏水區(qū)；

所述點(diǎn)樣區(qū)被酸性試劑處理，去除硅烷偶聯(lián)劑，并發(fā)生化學(xué)反應(yīng)修飾后，從而形成親水區(qū)。

在另一實(shí)施方案中，所述基片是質(zhì)地堅(jiān)韌、平面度佳的不銹鋼、金剛石、單晶硅、石英晶體的基片。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基片預(yù)先通過化學(xué)機(jī)械拋光(chemical mechanism polish,CMP)被處理具有單面拋光鏡面效應(yīng)。通過CMP方法，對(duì)基片進(jìn)行兩次拋光，粗拋與細(xì)拋。粗拋目的是去除基片表面殘留的機(jī)械損傷，一般從表面除去30um范圍內(nèi)的厚度。細(xì)拋目的是去除第一次拋光在基片表面留下的輕微損傷和云霧狀缺陷，一般從表面除去2～3um。經(jīng)過兩次拋光的基片表面具有鏡面效應(yīng)，在質(zhì)譜檢測(cè)過程中，通過照明、光路反射及攝像頭實(shí)時(shí)顯示，可以直接觀測(cè)基片表面樣本被轟擊的情況，改變激光轟擊的位置，得到最佳圖譜。在一個(gè)更具體實(shí)施方案中，所述基片是單面拋光的硅基片或石英基片。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述硅烷偶聯(lián)劑選自乙烯基硅烷、氨基硅烷、二甲基二氯硅烷。其中，二甲基二氯硅烷生長(zhǎng)疏水膜操作簡(jiǎn)單，接觸較大，疏水性佳，疏水層厚度能達(dá)到納米至微米量級(jí)，因此硅烷偶聯(lián)劑優(yōu)選是二甲基二氯硅烷。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，被所述偶聯(lián)劑整體硅烷化的疏水表面，其接觸角＞120°或＞130°或＞140°，在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接觸角＞150°，以形成超疏水表面。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疏水表面的厚度在納米到微米量級(jí)。

在一個(gè)其他實(shí)施方案中，所述點(diǎn)樣區(qū)被劃隔成適合MALDI-TOF樣品室規(guī)格的長(zhǎng)方形，劃隔精度小于10μm。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，制作光刻掩膜版，在基片表面形成親疏水區(qū)域(見圖1)，邊界精度達(dá)到微米級(jí)別。所述酸性試劑選自氫氟酸(HF)、硫酸(H₄SO₂)、溴化氫(HBr)，優(yōu)選是氫氟酸(HF)。在另一具體實(shí)施方案中，將經(jīng)過配制的酸性試劑，滴在孔內(nèi)區(qū)域，化學(xué)反應(yīng)修飾后，使得孔內(nèi)區(qū)域呈現(xiàn)親水性。

在上述任一實(shí)施方案中，所述基片具有用于基片身份識(shí)別的二維碼區(qū)域，其中通過光刻或蝕刻來印制二維碼圖形，至少分成8×8～15×15的陣列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過計(jì)算機(jī)控制激光光束在基片蝕刻或光刻預(yù)先設(shè)定的二維碼圖形，該圖形厚度在納米到微米量級(jí)。在另一具體實(shí)施方案中，所述用于基片身份識(shí)別，指二維碼與病人的生物信息或樣品的來源信息關(guān)聯(lián)。其他實(shí)施方案中，在進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)的同時(shí)，可用讀碼器或掃碼器讀取二維碼，并將基片對(duì)應(yīng)的病人生物信息或樣品的來源信息以及對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)同時(shí)輸入電腦進(jìn)行編碼、存儲(chǔ)和識(shí)別。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基片上的親水點(diǎn)樣區(qū)數(shù)量為48、56、70、96、384或其他數(shù)量，親水區(qū)形狀可以選擇圓形，正方形，三角形，多邊形等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述親水區(qū)域尺寸范圍為100×100μm至1×1mm，所述基片尺寸為20×30-83×125mm。

在上述所有實(shí)施方案中，其中所述基片是用于MALDI-TOF BIOMARK檢測(cè)的基片。

本發(fā)明第二目的是提供用于MALDI-TOF檢測(cè)的微納米結(jié)構(gòu)基片的制備方法，包括：

(1)選用質(zhì)地堅(jiān)韌、平面度佳的基片作為基底；

(2)用硅烷偶聯(lián)劑處理基片

(i)清洗基片：將先后浸入丙酮、甲醇水溶液、氯仿，分別清洗后，取出干燥；

(ii)在加熱條件下，將濃酸和雙氧水緩慢加入含有基片的水溶液中，進(jìn)行充分氧化反應(yīng)后，分別在氯仿、超純水中進(jìn)行清洗，該步驟可重復(fù)多次；

(iii)將基片置于干凈容器中，加入預(yù)先水解的硅烷偶聯(lián)劑溶液，并加入氨水催化，直至硅烷化反應(yīng)充分完成；

(iv)取出基片，分別置于乙醇、超純水、氯仿中，超聲清洗；

(v)將清洗后的基片，測(cè)量并選擇接觸角＞120°的基片，作為合格基片；

(3)點(diǎn)樣區(qū)的親水性處理：將調(diào)制后的酸性試劑直接滴在點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，通過該酸性試劑對(duì)表面進(jìn)行化學(xué)修飾后，形成親水性孔狀結(jié)構(gòu)，然后分別置于乙醇、超純水、氯仿中，超聲清洗。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(1)所述基片是質(zhì)地堅(jiān)韌、平面度佳的不銹鋼、金剛石、單晶硅、石英晶體的基片。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述基片預(yù)先通過化學(xué)機(jī)械拋光(chemical mechanism polish,CMP)被處理具有單面拋光鏡面效應(yīng)。通過CMP方法，對(duì)基片進(jìn)行兩次拋光，粗拋與細(xì)拋。粗拋目的是去除基片表面殘留的機(jī)械損傷，一般從表面除去30um范圍內(nèi)的厚度。細(xì)拋目的是去除第一次拋光在基片表面留下的輕微損傷和云霧狀缺陷，一般從表面除去2～3um。經(jīng)過兩次拋光的基片表面具有鏡面效應(yīng)，在質(zhì)譜檢測(cè)過程中，通過照明、光路反射及攝像頭實(shí)時(shí)顯示，可以直接觀測(cè)基片表面樣本被轟擊的情況，改變激光轟擊的位置，得到最佳圖譜。在一個(gè)更具體實(shí)施方案中，所述基片是單面拋光的硅基片或石英基片。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)所述硅烷偶聯(lián)劑選自乙烯基硅烷、氨基硅烷、二甲基二氯硅烷。其中，二甲基二氯硅烷生長(zhǎng)疏水膜操作簡(jiǎn)單，接觸較大，疏水性佳，疏水層厚度能達(dá)到納米至微米量級(jí)，因此硅烷偶聯(lián)劑優(yōu)選是二甲基二氯硅烷。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，被所述偶聯(lián)劑整體硅烷化的疏水表面，其接觸角＞120°，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述接觸角＞150°，以形成超疏水表面。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疏水表面的厚度在納米到微米量級(jí)。

在一個(gè)其他實(shí)施方案中，步驟(3)所述點(diǎn)樣區(qū)被劃隔成適合MALDI-TOF樣品室規(guī)格的長(zhǎng)方形，劃隔精度小于10μm。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，制作光刻掩膜版，在基片表面形成親疏水區(qū)域(見圖1)，邊界精度達(dá)到微米級(jí)別。所述酸性試劑選自氫氟酸(HF)、硫酸(H₄SO₂)、溴化氫(HBr)，優(yōu)選是氫氟酸(HF)。在另一具體實(shí)施方案中，將經(jīng)過配制的酸性試劑，滴在孔內(nèi)區(qū)域，化學(xué)反應(yīng)修飾后，使得孔內(nèi)區(qū)域呈現(xiàn)親水性。

在上述任一實(shí)施方案中，步驟(4)所述基片具有用于基片身份識(shí)別的二維碼區(qū)域，其中通過光刻或蝕刻來印制二維碼圖形，至少分成8×8～15×15的陣列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，通過計(jì)算機(jī)控制激光光束在基片蝕刻或光刻預(yù)先設(shè)定的二維碼圖形，該圖形厚度在納米到微米量級(jí)。在另一具體實(shí)施方案中，所述用于基片身份識(shí)別，指二維碼與病人的生物信息或樣品的來源信息關(guān)聯(lián)。其他實(shí)施方案中，在進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)的同時(shí)，可用讀碼器或掃碼器讀取二維碼，并將基片對(duì)應(yīng)的病人生物信息或樣品的來源信息以及對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)同時(shí)輸入電腦進(jìn)行編碼、存儲(chǔ)和識(shí)別。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基片上的親水點(diǎn)樣區(qū)數(shù)量為48、56、70、96、384或其他數(shù)量，親水區(qū)形狀可以選擇圓形，正方形，三角形，多邊形等。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述親水區(qū)域尺寸范圍為100×100μm至1×1mm，所述基片尺寸為20×30-83×125mm。

本發(fā)明第三個(gè)目的是提供上述方法所制備的基片。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基片是用于MALDI-TOF BIOMARK檢測(cè)的基片。

本發(fā)明第四個(gè)目的是提供所述基片用于質(zhì)譜檢測(cè)生物分子或生物標(biāo)記物樣品的用途。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基片是用于MALDI-TOF BIOMARK檢測(cè)的基片。在另一實(shí)施方案中，所述生物分子生物標(biāo)記物是蛋白或多肽樣品，核酸樣品。在一具體實(shí)施方案中，其中在進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，可用讀碼器或掃碼器讀取二維碼，并將基片對(duì)應(yīng)的病人生物信息或樣品的來源信息以及對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)同時(shí)輸入電腦進(jìn)行編碼、存儲(chǔ)和識(shí)別。

術(shù)語和定義

疏水性(hydrophobicity)：在化學(xué)學(xué)科里，疏水性指的是一個(gè)分子(疏水物)與水互相排斥的物理性質(zhì)。疏水性分子偏向于非極性，并因此較會(huì)溶解在中性和非極性溶液(如有機(jī)溶劑)。疏水性分子在水里通常會(huì)聚成一團(tuán)，而水在疏水性溶液的表面時(shí)則會(huì)形成一個(gè)很大的接觸角而成水滴狀。舉例來說，疏水性分子包含有烷烴、油、脂肪和多數(shù)含有油脂的物質(zhì)。

親水性(hydrophilic property)：指分子帶有極性基團(tuán)的分子，對(duì)水有大的親和能力，可以吸引水分子，或溶解于水。這類分子形成的固體材料的表面，易被水所潤(rùn)濕。具有這種特性都是物質(zhì)的親水性。

接觸角(contact angle)：是指在氣、液、固三相交點(diǎn)處所作的氣-液界面的切線穿過液體與固-液交界線之間的夾角θ，是潤(rùn)濕程度的量度。若θ<90°，則固體表面是親水性的，即液體較易潤(rùn)濕固體，其角越小，表示潤(rùn)濕性越好；若θ>90°，則固體表面是疏水性的，即液體不容易潤(rùn)濕固體，容易在表面上移動(dòng)。接觸角的測(cè)定方法很多，有角度測(cè)量法(液滴角度測(cè)量法)、長(zhǎng)度/高度測(cè)量法、力測(cè)量法等。其中液滴角度測(cè)量法是最常用的，即在平整表面滴一小液滴，使用低倍顯微鏡的量角器即可測(cè)量角度大小。

BIOMARK，即生物標(biāo)記物，微生物鑒定、蛋白指紋圖譜檢測(cè)、基因分型與基因突變檢測(cè)，歸根結(jié)底是發(fā)現(xiàn)變異的BIOMARK生物標(biāo)記物，用靶板或基片承載，送入MALDI-TO F樣品室，進(jìn)行檢測(cè)分析，基片的結(jié)構(gòu)與指標(biāo)直接影響檢測(cè)結(jié)果的好壞。所述MALDI-TOF BIOMARK，既可以是利用MALDI-TOF檢測(cè)BIOMARK的技術(shù)，也可以是以此為基礎(chǔ)研發(fā)的相關(guān)質(zhì)譜儀或質(zhì)譜產(chǎn)品的名稱，例如美國(guó)Fluidigm公司研發(fā)的相關(guān)產(chǎn)品。

硅烷偶聯(lián)劑：指一類具有特殊結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物，含有有機(jī)官能團(tuán)，無機(jī)官能團(tuán)，同時(shí)與陰極、非極性物質(zhì)產(chǎn)生結(jié)合力。硅烷偶聯(lián)劑的化學(xué)通式為Y-R-SiX3，式中Y是通過碳原子與硅相連的非水解性有機(jī)官能團(tuán)，可與粘結(jié)劑機(jī)體中的樹脂發(fā)生反應(yīng)從而提高相容性，如氨基、乙烯基、環(huán)氧基、巰基、丙烯酰氧丙基等；R為具有飽和和不飽和鍵的碳鏈，將Y和Si原子連接起來；X為水解性基團(tuán)，如鹵族、烷氧基、異丙烯氧基等。這些基團(tuán)水解形成的硅醇能與金屬或非金屬表面的氧化物或烴基反應(yīng)，從而在金屬或非金屬表面形成Si-O-Si三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的硅烷莫，防止金屬或非金屬的腐蝕，表面呈現(xiàn)疏水性。適于本發(fā)明的硅烷偶聯(lián)劑只限于氨基硅烷(如氨丙基三乙氧基硅烷)、乙烯基硅烷(乙烯基三乙氧基硅烷)以及二甲基二氯硅烷，其中優(yōu)選硅烷偶聯(lián)劑為二甲基二氯硅烷。

MALDI-TOF-MS是Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry的英文縮寫，即基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，又稱MALDI TOF，它是近年來發(fā)展起來的一種軟電離新型有機(jī)質(zhì)譜，通過引入基質(zhì)分子，使待測(cè)分子不產(chǎn)生碎片，解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性生物大分子解吸離子化的問題，是分析難揮發(fā)的有機(jī)物質(zhì)的重要手段之一，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛用于蛋白樣品和核酸樣品的BIOMARK的分子檢測(cè)中。與MALDI TOF相似的技術(shù)，表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)飛行時(shí)間質(zhì)譜是一種比較新的蛋白鑒定技術(shù)和方法。它最吸引人的地方是它將樣品的分離和質(zhì)譜(準(zhǔn)確的說是色譜)鑒定蛋白聯(lián)用，使得樣品在不用粗分離的狀態(tài)下直接上樣，這使得多蛋白樣品(如血清)能夠快速的得到鑒定。但是，該方法的缺陷在于：(1)對(duì)于不同的樣本，根據(jù)檢測(cè)的目標(biāo)采取或者設(shè)計(jì)幾種芯片，理論上可以把所有的相同性質(zhì)蛋白質(zhì)捕獲，但是實(shí)際上仍有少量的分子沒與表面探針結(jié)合。(2)使用SELDI-TOF-MS，僅能給出蛋白質(zhì)的分子量，不能給出C端、N端的序列，也沒法知道蛋白質(zhì)的構(gòu)型，因此需要將蛋白質(zhì)充分純化后，用蛋白酶消化芯片上的蛋白質(zhì)，分析肽段，再用生物信息學(xué)方法鑒定蛋白質(zhì)序列。(3)該方法比較適合臨床診斷，但不能進(jìn)行蛋白質(zhì)的序列鑒定和功能研究。因此，該方法所用的BIOMARK基片不能與MALDI TOF通用。

“二維碼用于基片身份識(shí)別”，指二維碼與病人的生物信息或樣品的來源信息關(guān)聯(lián)。例如，病人的生物信息可包括但不限于，病人病例、生活習(xí)慣、個(gè)人背景，具體可以是病人的就診記錄、病人的家族遺傳關(guān)系、病人生活方式數(shù)據(jù)(是否吸煙、飲酒、熬夜、長(zhǎng)期服藥、居于各種輻射環(huán)境等)。

樣品的來源信息可以包括但不限于，樣品的環(huán)境信息或樣品的產(chǎn)品信息。例如樣品的環(huán)境信息可以包括但不限于：樣品的地理位置信息、水文土壤信息、地理資源信息、動(dòng)植物和微生物等生物信息；或，包括環(huán)境病菌污染物、蛋白或多肽污染物、進(jìn)出口岸污染物的蛋白或多肽的質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息。

例如，樣品的產(chǎn)品信息可以包括但不限于：食品、農(nóng)產(chǎn)品、工業(yè)品種的蛋白或多肽污染物或雜質(zhì)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息。

技術(shù)效果

1、本發(fā)明制備方法具有制備簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，可以進(jìn)行人工制備，不需要特殊裝置，適于普通實(shí)驗(yàn)室的大規(guī)模使用。

2、本發(fā)明引入二維碼實(shí)現(xiàn)基片身份識(shí)別，與病人的生物信息關(guān)聯(lián)，通過計(jì)算機(jī)的實(shí)時(shí)監(jiān)控和信息處理，遠(yuǎn)程管理，適于自動(dòng)化高通量的醫(yī)院使用。

3、相比于常規(guī)基片的樣品蛋白結(jié)晶，能夠有效富集樣本，晶向均一生長(zhǎng)，BIOMARK生物檢測(cè)的質(zhì)譜曲線樣本峰準(zhǔn)確度高，信噪比高，基線底。

4、本發(fā)明可以使用工業(yè)級(jí)的硅烷偶聯(lián)劑作為疏水性材料，效果與其他已知的疏水性材料相當(dāng)甚至更佳，無需高溫固化，節(jié)約時(shí)間與成本，操作簡(jiǎn)便，并且所制備的基片表面的水滴接觸角能達(dá)到130～155°，具有優(yōu)異的疏水性能。

5、相比于傳統(tǒng)的疏水和親水處理方法如絲網(wǎng)印刷技術(shù)，本發(fā)明通過光刻掩膜版制備親水疏水區(qū)域，邊界精度達(dá)到微米量級(jí)，使樣本結(jié)晶形態(tài)規(guī)則，邊界清晰。

6、相比于傳統(tǒng)的疏水和親水處理基片的“擋層涂布”的三步法，本發(fā)明實(shí)際上屬于兩步法，即疏水涂布-親水涂布，不需要特殊裝置和精密處理過程，過程相對(duì)于更加簡(jiǎn)便。

7、本發(fā)明的基片采用CMP(chemical mechanism polish)方法進(jìn)行單面拋光處理，使基片表面具有鏡面效應(yīng)，在質(zhì)譜檢測(cè)過程中，通過照明、光路反射及攝像頭實(shí)時(shí)顯示，可以直接觀測(cè)基片表面樣本被轟擊的情況，改變激光轟擊的位置，得到最佳圖譜。

附圖說明

圖1，圖2為一種用于MALDI-TOF檢測(cè)的微納米結(jié)構(gòu)基片示意圖，圖1為正方形孔位，圖2為圓形孔位；其中包括三個(gè)分區(qū)：1、親水區(qū)域；2、疏水區(qū)域；3、二維碼區(qū)域；

圖3為濃酸溶液中清洗基片示意圖。

圖4為BIOMARK結(jié)晶形態(tài)對(duì)比示意圖，其中左下圖為基片J1表面接觸角約為135°的樣品結(jié)晶圖，右下圖為基片J2表面接觸角約為155°的樣品結(jié)晶圖。

圖5為MALDI-TOF檢測(cè)樣本峰譜圖對(duì)比。

具體實(shí)施方案

本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例做進(jìn)一步的說明，這些實(shí)例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。

實(shí)施例一、制備基片

(一)基片材料選擇

特征是質(zhì)地堅(jiān)韌、平面度佳；如不銹鋼，金剛石，單晶硅，石英晶體等；劃隔成適合MALDI-TOF樣品室規(guī)格的長(zhǎng)方形，為保證質(zhì)量檢測(cè)精度，劃隔精度小于10μm。

(二)硅烷化處理

1、清洗基片

將基片放在一個(gè)燒杯中，平鋪開，不要交疊，用丙酮沖洗基片，清洗后的基片轉(zhuǎn)移到一個(gè)新燒杯中。

向燒杯中加入一定量的甲醇與水的混合液，超聲，時(shí)間30min。

將基片轉(zhuǎn)移到新燒杯中，加入一定量的氯仿，超聲，時(shí)間30min。

取出，干燥基片。

2、用濃酸溶液清洗基片

如圖3所示，將基片放置在干凈的燒杯中，燒杯固定在支架上。

準(zhǔn)備水槽，裝滿水，放置在燒杯下方，加熱；

將濃酸與雙氧水按照一定比例(1:5～1:20)緩緩加入裝有基片的燒杯中，待不斷出現(xiàn)小氣泡，氧化反應(yīng)開始，反應(yīng)時(shí)間40min。注意，需要在通風(fēng)櫥通風(fēng)的條件下小心處理。注意個(gè)人防護(hù)。

將基片取出，放在盛有氯仿的燒杯中，超聲2min；

將基片取出，放在盛有超純水的燒杯中，超聲2min。

重復(fù)步驟8，9，直至清洗完全。

廢液處理：濃酸溶液中加入大量水，緩慢稀釋，并用NaOH中和。

3、硅烷化處理

將基片放置在潔凈的燒杯中。

將硅烷偶聯(lián)劑進(jìn)行水解，按照配比硅烷偶聯(lián)劑：水：乙醇＝1:1:8混合，其中硅烷偶聯(lián)劑為濃度5％～10％的二甲基二氯硅烷溶液，水采用去離子水，乙醇濃度為99％。

將水解后的硅烷化溶液取適量加入含有基片的燒杯中；

加入濃度為13％～30％的氨水催化，配比氨水:硅烷化＝1:5，加速反應(yīng)進(jìn)行。

將表面產(chǎn)生白煙的溶液放置在通風(fēng)廚中，反應(yīng)持續(xù)至少時(shí)間30分鐘。

4、硅烷化后清洗

取出基片，放置到盛有乙醇的新燒杯中，超聲，時(shí)間10min。

取出基片，放置在成盛有超純水水的新燒杯中，超聲，時(shí)間10min。

取出基片，放置在成盛有氯仿的新燒杯中，超聲，時(shí)間10min。

干燥基片后，在基片表面滴1μl水滴，使用低倍顯微鏡的量角器測(cè)量水滴接觸角大小，分別得到接觸角約135°、155°的兩種基片初品。

(三)親水處理

1、按照基片表面的孔位及尺寸，制作掩蓋模板，金屬或玻璃板材，將孔外疏水區(qū)域掩蓋，或者直接通過計(jì)算機(jī)控制，進(jìn)行親水試劑點(diǎn)樣修飾處理；

2、親水性修飾：選取氫氟酸HF試劑，經(jīng)過配制后，滴在孔內(nèi)區(qū)域，化學(xué)反應(yīng)修飾后，孔內(nèi)區(qū)域呈現(xiàn)親水性；

3、清洗

化學(xué)修飾后的基片放入盛有乙醇的潔凈燒杯中，超聲，5min；

取出基片，放入盛有氯仿的潔凈燒杯中，超聲，5min；

取出基片，放入盛有純凈水或超純水的結(jié)晶燒杯中，超聲，5min；

(四)二維碼刻印

正方形的二維碼區(qū)域，至少分成8×8～15×15的陣列，最小單元尺寸微米量級(jí)，激光刻印制作二維碼圖形，厚度為納米至微米量級(jí)，MALDI-TOF進(jìn)樣室掃二維碼，識(shí)別基片身份；

經(jīng)過上述步驟，得到接觸角約135°、155°的兩種基片成品。

實(shí)施例二、靶板的樣品結(jié)晶觀察和對(duì)比

將制備好的基質(zhì)溶液取適量分別滴在接觸角約135°、155°的兩種基片J1、J2，以及兩塊傳統(tǒng)靶板T1、T2上；基質(zhì)自然晾干，再吸取適量的樣本滴在J1、J2、T1、T2上，樣本自然晾干后，顯微鏡下觀察結(jié)晶形態(tài)，見圖4。

其中，所述傳統(tǒng)靶板為SHIMADZU生產(chǎn)的型號(hào)為TO-488基因檢測(cè)靶板。

如圖4所示，傳統(tǒng)生物檢測(cè)靶板T1、T2結(jié)晶形態(tài)(見圖4)外形不規(guī)整，線條不圓滑，呈咖啡環(huán)狀態(tài)，表面不均勻。由于中間空而周圍厚，當(dāng)激光轟擊樣品時(shí)，樣本峰準(zhǔn)確度差，噪聲高，基線高。

而本發(fā)明的生物檢測(cè)基片J1、J2結(jié)晶形態(tài)(見圖4)外形呈現(xiàn)規(guī)整的圓形，表面圓潤(rùn)如玉石，質(zhì)地規(guī)則均一，晶體各向生長(zhǎng)細(xì)致，為理想的蛋白結(jié)晶形態(tài)。其中，左下圖J1接觸角約135°，右下圖J2接觸角約155°，相比而言，J2比J1的質(zhì)地更加均勻，結(jié)晶平整。

實(shí)施例三、質(zhì)譜檢測(cè)效果比較

將覆有基因樣品的基片J1和傳統(tǒng)靶板T1，放入MALDI-TOF質(zhì)譜儀中檢測(cè)。

參數(shù)設(shè)置：

Turing mode:linear

Mass Range:3000-9000

Max Laser Rep Rate:10.0

Power:90

Profiles:40

Shots:10

比較兩種靶板的檢測(cè)結(jié)果。

如圖5所示，T1靶板檢測(cè)結(jié)果基線高，出峰少，準(zhǔn)確度差，信噪比低；J1基片檢測(cè)結(jié)果基線低，出峰多，準(zhǔn)確度高，信噪比高。

實(shí)施例四、基片的疏水層和親水層的測(cè)量

本發(fā)明的微納米結(jié)構(gòu)基片，疏水層截面在電鏡下測(cè)量，厚度800nm-1μm，此厚度直接影響疏水性好壞，疏水層薄，接觸角小，疏水性差；疏水層厚，接觸角大，疏水性佳。

親水層厚度300nm-500nm，親水層厚度小于疏水層厚度，親水區(qū)域有凹槽，當(dāng)樣品滴在靶點(diǎn)上，孔內(nèi)親水孔外疏水有助于結(jié)晶形成與生長(zhǎng)。