本發(fā)明屬于有機(jī)化合物合成技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物及其制備方法與應(yīng)用和檢測方法。

背景技術(shù)：

5-羥甲基糠醛(HMF)是熱加工食品中普遍存在、含量較高的內(nèi)源污染物，具有活潑的α,β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)。研究表明，小鼠和人體內(nèi)的轉(zhuǎn)硫酶能夠?qū)MF轉(zhuǎn)化為致癌物質(zhì)羥甲基糠酰磺酸鹽(SMF)，使食品中HMF的安全問題引起廣泛關(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物。本發(fā)明方法合成得到加合物，通過大孔樹脂、葡聚糖凝膠以及C18反相硅膠樹脂層析法，無需結(jié)晶操作，即可得到高純度的目標(biāo)加合物，具有方法簡單高效，產(chǎn)品純度高的特點(diǎn)，以此為標(biāo)準(zhǔn)品，檢測食品中加合物的含量；可為食品中加合物的檢測分析提供標(biāo)準(zhǔn)品。

本發(fā)明另一目的在于提供上述方法制備的5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物。

本發(fā)明再一目的在于提供上述5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物在食品中加合物檢測的應(yīng)用。

本發(fā)明再一目的在于提供一種上述5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物在檢測食品加合物中的檢測方法。

本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)：

一種5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物的制備方法，包括以下步驟：5-羥甲基糠醛與半胱氨酸的摩爾比為1:5～1:15置于水溶液中，避光加熱反應(yīng)，得到5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物。

所述5-羥甲基糠醛與半胱氨酸的摩爾比為1:5。

所述加熱反應(yīng)為在20～120℃下反應(yīng)1～15h。

所述加熱反應(yīng)為在80℃下反應(yīng)10h。

所述加熱反應(yīng)優(yōu)選在恒溫水浴中進(jìn)行。

所述恒溫水浴震蕩頻率優(yōu)選為150rpm。

本發(fā)明制備方法的產(chǎn)率高達(dá)85％。

可對上述反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行純化，包括以下步驟：將反應(yīng)后體系避光4℃下靜置12h，過濾，得到濾液，依次用大孔樹脂層析法、凝膠樹脂層析法、反相硅膠層析法進(jìn)行純化。

所述大孔樹脂層析法具體操作：選用HP-20型號的大孔樹脂，上樣，去離子水洗脫，得到洗脫液，冷凍干燥，得到初處理樣品。

所述層析柱的規(guī)格為30×500mm。

所用大孔樹脂和濾液的體積比為4:1。

所述上樣優(yōu)選以1.0mL/min流速進(jìn)行上樣。

所述洗脫優(yōu)選以1.5mL/min流速進(jìn)行洗脫。

所用去離子水和濾液的體積比優(yōu)選為8:1。

所述冷凍干燥的條件優(yōu)選為-70～-50℃，1～100Pa，48h。

通過大孔樹脂層析法可將低極性雜質(zhì)吸附除去，洗脫得到目標(biāo)加合物與其它高極性物質(zhì)。

所述凝膠樹脂層析法具體操作：選用LH-20型號的葡聚糖凝膠樹脂，將初處理樣品溶于水中，上樣，5％甲醇水溶液洗脫，通過高效液相色譜法(HPLC)檢測收集目標(biāo)加合物，收集洗脫液，冷凍干燥，得到二次處理樣品。

所述層析柱規(guī)格為10×1000mm。

所用葡聚糖凝膠樹脂與初處理樣品的比例為80mL:1g。

所述冷凍干燥的條件優(yōu)選為-70～-50℃，1～100Pa，48h。

所述反相硅膠層析法具體操作：選用反相硅膠ODS樹脂，將二次處理樣品溶于水中，上樣，5％甲醇水溶液洗脫，通過高效液相色譜檢測法(HPLC)收集目標(biāo)加合物，收集洗脫液，冷凍干燥，得到純化后樣品。

所述層析柱規(guī)格為20×500mm。

所述冷凍干燥的條件優(yōu)選為-70～-40℃，1～100Pa，36h。

根據(jù)高效液相檢測結(jié)果以及核磁共振圖譜結(jié)果可知，本發(fā)明方法制備得到的加合物的純度高達(dá)99％，其中高效液相色譜圖各個顯示波長下(200～400nm)的目標(biāo)單峰的峰純度高達(dá)99.9％。

所述HPLC法測定的條件為：色譜柱Zorbax SB-Aq C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動相A為純水，流動相B為甲醇；色譜條件為：檢測波長254nm，流速0.6mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量5μL；流動相A體積分?jǐn)?shù)為95％，流動相B的體積分?jǐn)?shù)為5％等梯度洗脫22min。

在該檢測方法下，目標(biāo)物的保留時間為5.76min，呈現(xiàn)可重復(fù)、分離度高、尖銳無拖尾的良好峰型。

本發(fā)明方法制備得到的5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物其分子式為：C₁₂H₁₈O₆N₂S₂，分子量：350.4，結(jié)構(gòu)式如下所示：

本發(fā)明的高純度5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物可應(yīng)用于食品中加合物檢測。

本發(fā)明還提供一種上述高純度5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物在檢測食品加合物中的檢測方法，包括以下步驟：將待檢測食品粉碎，水提取，得到待檢測液，采用HPLC法進(jìn)行檢測，與5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物譜圖及標(biāo)準(zhǔn)曲線比對，獲得檢測結(jié)果。

所述水提取優(yōu)選包括以下步驟：將待檢測食品粉碎后加入水中，超聲提取，離心，得到上清液；加水，再次超聲提取，離心，合并上清液，定容，得到待檢測液。

所述待檢測液過0.45μm濾膜后采用HPLC法進(jìn)行檢測。

所述HPLC法測定的條件為：色譜柱Zorbax SB-Aq C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動相A為純水，流動相B為甲醇；檢測波長254nm，流速0.6mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量20μL；流動相A體積分?jǐn)?shù)為95％，流動相B的體積分?jǐn)?shù)為5％等梯度洗脫40min。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

本發(fā)明提供了一種5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物的制備方法，產(chǎn)率高，純度高達(dá)99％，可利用其作為標(biāo)準(zhǔn)物檢測食品中的加合物。

附圖說明

圖1～圖2為5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物的一級質(zhì)譜圖。

圖3～圖4為5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物的二級質(zhì)譜圖。

圖5為5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物的¹³C NMR核磁譜圖。

圖6為5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物的¹H NMR核磁譜圖。

圖7為5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物的高效液相色譜圖。

圖8為5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖9為檢測對比色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1：5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物的制備

水溶液中，5-羥甲基糠醛與半胱氨酸的摩爾比為1:5，恒溫水浴震蕩頻率150rpm，避光加熱80℃反應(yīng)10h，得到5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物，產(chǎn)率高達(dá)85％。

純化：將反應(yīng)后體系避光4℃下靜置12h，過濾，得到濾液，依次用大孔樹脂層析法、凝膠樹脂層析法、反相硅膠層析法進(jìn)行純化。

所述大孔樹脂層析法具體操作：選用HP-20型號的大孔樹脂200mL，層析柱規(guī)格為30×500mm，用純水裝柱，以1.0mL/min流速進(jìn)行上樣，將50mL濾液通過樹脂柱，低極性雜質(zhì)被樹脂吸附，再用400mL去離子水作為洗脫液，以1.5mL/min流速進(jìn)行洗脫，未吸附的目標(biāo)加合物與其它高極性物質(zhì)被洗脫下來，收集水洗液，冷凍干燥后得到初步處理樣品，冷凍干燥條件為-70～-50℃，1～100Pa，48h。

所述凝膠樹脂層析法具體操作：選用LH-20型號的葡聚糖凝膠樹脂80mL，層析柱規(guī)格為10×1000mm，取初步處理樣品1g溶于1mL去離子水，過0.45μm濾膜后上樣，以5％甲醇水溶液作為洗脫液，全流速等度洗脫，通過高效液相色譜檢測收集目標(biāo)加合物，將收集液冷凍干燥得到二次處理樣品，冷凍干燥條件為-70～-50℃，1～100Pa，48h。

所述反相硅膠層析法具體操作：選用反相硅膠ODS樹脂80mL，層析柱規(guī)格為20×500mm，將二次處理樣品溶于水中200μL去離子水，過0.45μm濾膜后上樣，以5％甲醇水溶液作為洗脫液，全流速等度洗脫，通過高效液相色譜法(HPLC法)檢測，收集目標(biāo)加合物，冷凍干燥后得到高純的目標(biāo)加合物約為100mg，冷凍干燥條件為-70～-40℃，1～100Pa，36h。

根據(jù)圖1～圖7的高效液相檢測結(jié)果以及核磁共振圖譜結(jié)果可知，方法制備得到的加合物的純度高達(dá)99％，其中高效液相色譜圖各個顯示波長下(200～400nm)的目標(biāo)單峰的峰純度高達(dá)99.9％。且在該檢測方法下，目標(biāo)物的保留時間為5.76min，呈現(xiàn)可重復(fù)、分離度高、尖銳無拖尾的良好峰型。

實(shí)施例2：食品中加合物的檢測

選用餅干作為待檢測食品：將餅干粉粹過篩，取3g餅干粉末于離心管中，加入10mL去離子水，超聲提取30min，3500rpm、15min離心，取出上清液，再向離心管中加入5mL去離子水，渦旋混合后超聲提取30min，離心后合并上清液定容至20mL，取1mL提取液過0.45μm濾膜，采用HPLC法進(jìn)行檢測。

HPLC法測定的條件為：色譜柱Zorbax SB-Aq C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動相A為純水，流動相B為甲醇；檢測波長254nm，流速0.6mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量10μL；流動相A體積分?jǐn)?shù)為95％，流動相B的體積分?jǐn)?shù)為5％等梯度洗脫40min。在該檢測條件下，餅干水提液中的物質(zhì)得到較好的分離。

5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配制濃度為5、25、50、100、250、500μg/mL的5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度設(shè)置3個平行，使用上述HPLC測定方法進(jìn)行檢測，以濃度作為橫坐標(biāo)，254nm下的目標(biāo)峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖8。

餅干模擬體系：水溶液中，5-羥甲基糠醛與半胱氨酸摩爾比例為1:10，160℃下反應(yīng)15min，模仿餅干的高溫烘烤，使兩種反應(yīng)物在高溫短時下進(jìn)行反應(yīng)，再采用HPLC法進(jìn)行檢測。

將上述兩個體系與實(shí)施例制備得到的高純度加合物譜圖進(jìn)行比較，結(jié)果見圖9，其中，數(shù)據(jù)2為餅干模擬體系色譜圖，數(shù)據(jù)3為高純度加合物色譜圖，數(shù)據(jù)4為餅干提取液色譜圖。由圖可見，目標(biāo)加合物的峰保留時間為5.76分鐘。根據(jù)本發(fā)明檢測方法，可快速定量檢測食品中5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物含量，評估食品中5-羥甲基糠醛與5-羥甲基糠醛-半胱氨酸加合物的暴露水平，從而對此類食品的安全性進(jìn)行較為全面的評價。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。