本發(fā)明涉及一種與神經(jīng)退行性疾病產(chǎn)生有關(guān)的蛋白質(zhì)例如β-淀粉樣蛋白、tau蛋白、a-突觸核蛋白等的捕獲方法。該捕獲方法可為準(zhǔn)確分析和研究蛋白質(zhì)的聚集情況從而為進(jìn)一步開發(fā)這些疾病的治療藥物提供必要的條件。

背景技術(shù)：

世界人口在不斷的老齡化，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，目前全球有3560萬癡呆患者，到2030年這一數(shù)字將增加一倍，2050年這一數(shù)字將增加至三倍以上。癡呆類型包括阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病等神經(jīng)退行性疾病。普遍認(rèn)為大量錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，如β-淀粉樣蛋白(amyloid beta)、tau蛋白、a-突觸核蛋白(α-synuclein)在細(xì)胞內(nèi)聚集是神經(jīng)退行性疾病產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此在開發(fā)針對(duì)這些疾病的治療藥物的過程中，需要有一種簡單易用的方法捕獲這些蛋白，并實(shí)時(shí)監(jiān)控這些物質(zhì)對(duì)于蛋白質(zhì)聚集的影響。

水凝膠是由交聯(lián)的聚合物鏈形成的三維聚合物空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。它不溶于水但親水性使其能夠容納大量的水。此外，可以通過調(diào)節(jié)聚合物濃度和前體的分子量來改變孔徑。其內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)可以將藥物分子包裹在聚合物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)。此外，這種結(jié)構(gòu)也可以作為細(xì)胞封裝的支架：其納米級(jí)孔徑可以允許后續(xù)向細(xì)胞供應(yīng)營養(yǎng)物，但同時(shí)防止較大物質(zhì)如抗體或酶的滲透。此外，水凝膠的生物相容性使其能更好地模擬蛋白質(zhì)折疊的自然環(huán)境。

水凝膠通常分為物理凝膠和化學(xué)凝膠兩種。其中物理凝膠包括熱可逆凝膠，其在常溫下呈穩(wěn)定的凝膠態(tài)，但加熱后可轉(zhuǎn)變?yōu)槿芤?。但是，其中溫度的改變可能影響蛋白質(zhì)反應(yīng)速度，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。而化學(xué)凝膠使用較多的包括含有甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯基團(tuán)的超支化聚丙三醇(hPG)和聚乙二醇(PEG)。通過將這些大分子單體與光引發(fā)劑一同暴露于紫外線下進(jìn)行快速交聯(lián)，或利用加熱手段引發(fā)自由基進(jìn)行聚合。綜上，無論是利用加熱或紫外線輻照的方法，均會(huì)影響蛋白質(zhì)反應(yīng)，從而使得檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。此外，現(xiàn)有常規(guī)的物理凝膠和化學(xué)凝膠捕獲方法捕獲的不僅有錯(cuò)誤折疊程度高的蛋白質(zhì)寡聚物和纖維，也會(huì)捕獲錯(cuò)誤折疊程度低的小分子蛋白質(zhì)和部分小尺寸單體，無法對(duì)錯(cuò)誤折疊程度高的蛋白質(zhì)寡聚物和纖維進(jìn)行針對(duì)性研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的蛋白質(zhì)捕獲方法，該方法對(duì)錯(cuò)誤折疊程度高的蛋白質(zhì)寡聚物和纖維可進(jìn)行針對(duì)性捕獲，同時(shí)，該方法無需依賴加熱或紫外線輻照從而可以避免對(duì)蛋白質(zhì)反應(yīng)造成影響，從而可以獲得更準(zhǔn)確的分析結(jié)果。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：

一種利用水凝膠微籠捕獲蛋白的方法，其包括如下步驟：

(1)使超支化聚丙三醇水溶液、雙巰基聚乙二醇水溶液、帶有標(biāo)記的待捕獲蛋白肽單體溶液在微流控芯片上混合得到混合液，然后使所述混合液、油相物質(zhì)在所述微流控芯片上混合，獲得微液滴，所述微液滴內(nèi)，所述超支化聚丙三醇和雙巰基聚乙二醇發(fā)生巰基-烯的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)形成水凝膠，得到外層為油相內(nèi)層為含有蛋白肽溶液的微凝膠；

(2)對(duì)所述微凝膠進(jìn)行培養(yǎng)使其中的蛋白肽單體發(fā)生折疊聚集，得到外層為油相內(nèi)層含有不同折疊程度的聚合蛋白的微凝膠；

(3)向經(jīng)過步驟(2)的體系中加入脫乳化劑以破壞所述油相外層并進(jìn)行清洗以除去所述微凝膠內(nèi)小于所述微凝膠孔道的聚合蛋白或未聚合蛋白，即得捕獲了蛋白的水凝膠微籠，所述捕獲了蛋白的水凝膠微籠可用于后續(xù)的檢測(cè)分析。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述微流控芯片包括芯片本體，形成于芯片本體上且在一端部相交匯構(gòu)成第一聚焦區(qū)的第一微通道、第二微通道和第三微通道，形成于芯片本體上且在一端部相交匯構(gòu)成第二聚焦區(qū)的第四微通道、第五微通道和第六微通道，以及形成于芯片本體上的第七微通道，其中所述第四微通道的另一端與所述第一聚焦區(qū)連通，所述第七微通道的一端與所述第二聚焦區(qū)連通，將超支化聚丙三醇水溶液、雙巰基聚乙二醇水溶液、帶有標(biāo)記的待捕獲蛋白肽溶液分別注入所述第一微通道、第二微通道和第三微通道，三者在第一聚焦區(qū)混合得到所述混合液，分別向第五微通道和第六微通道內(nèi)注入所述油相物質(zhì)，混合液經(jīng)第四微通道流到第二聚焦區(qū)，在二聚焦區(qū)與從第五微通道和第六微通道內(nèi)注入的油相物質(zhì)混合形成所述微液滴。

進(jìn)一步地，在各所述微通道的進(jìn)液端設(shè)置過濾器(過濾精度為例如約1微米)，以防止可能存在的顆粒物質(zhì)造成通道堵塞。

進(jìn)一步地，所述方法還包括以軟刻蝕法制作微流控芯片的步驟，該步驟包括如下幾步：

i)將設(shè)計(jì)好的第一微通道、第二微通道、第三微通道、第四微通道、第五微通道以及第六微通道印刷在醋酸膜上，并將醋酸膜放置于涂覆有光刻膠的硅晶片頂部，經(jīng)過紫外光照射，得到芯片模板；

ii)將聚二甲基硅氧烷預(yù)聚物和其交聯(lián)劑灌注在所述芯片模板上，進(jìn)行固化，將固化的聚二甲基硅氧烷模具剝離芯片模板，并對(duì)各所述微通道的出入口進(jìn)行壓力穿孔，之后運(yùn)用表面平整的基底對(duì)各微通道進(jìn)行密封；

iii)將表面疏水劑注入各微孔通道并靜置，使得微通道表面疏水即得所述微流控芯片。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述帶有標(biāo)記的待捕獲蛋白肽單體溶液可通過先采用有機(jī)熒光素對(duì)蛋白肽單體側(cè)鏈的N-末端進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后溶解于0.5％～2％的氨水中制備預(yù)備蛋白肽單體溶液，最后以pH 7-8的緩沖液稀釋成設(shè)定濃度得到。

根據(jù)本發(fā)明，上述有機(jī)熒光色素包括但不限于Alexa Fluor405、Alexa-350、AMCA-X、Alexa-488、FITC、HiLyte Flour488、Alexa-430、Alexa-555、HiLyte Plus555、DyLight549、HiLyte Fluor555、Alexa Fluor 546、Alexa-546、Alexa-568、AlexaFlour 594、HiLyte Fluor TR(622)、Alexa-633等。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述雙巰基聚乙二醇水溶液通過將2-亞氨基硫烷鹽酸鹽與聚乙二醇雙胺在pH為7-8的緩沖溶液中反應(yīng)得到。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述蛋白肽單體為人β淀粉樣蛋白1-40，人β淀粉樣蛋白1-42，tau蛋白或a-突觸核蛋白。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述油相物質(zhì)優(yōu)選為選自氟化液、礦物類油、植物油及脂肪酸中的一種或多種的組合。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述超支化聚丙三醇和雙巰基聚乙二醇水溶液的流速分別為10-400微升/小時(shí)、所述帶有標(biāo)記的待捕獲蛋白肽單體溶液的流速為10-400微升/小時(shí)，所述油相的流速為400-4000微升/小時(shí)，所述微液滴生產(chǎn)速度為0.2-10千赫茲。

進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(1)中，所述超支化聚丙三醇和雙巰基聚乙二醇水溶液的流速分別為180-220微升/小時(shí)、所述帶有標(biāo)記的待捕獲蛋白肽單體溶液的流速為180-220微升/小時(shí)，所述油相的流速為1800-2200微升/小時(shí)。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體且優(yōu)選方面，所述脫乳化劑為全氟辛醇油，所述清洗采用pH 7-8的磷酸緩沖溶液，在離心旋杯柱中進(jìn)行清洗。

根據(jù)本發(fā)明，聚乙二醇雙胺、超支化聚丙三醇的分子量可根據(jù)需要的微籠孔徑來設(shè)計(jì)。優(yōu)選地，所述聚乙二醇雙胺的分子量為1-5kDa，超支化聚丙三醇的分子量為10-30kDa。更優(yōu)選地，所述聚乙二醇雙胺的分子量為2-3kDa，超支化聚丙三醇的分子量為15-25kDa。

根據(jù)本發(fā)明，所述微凝膠的大小約為30-80微米，優(yōu)選為40-60為微米，更優(yōu)選為45-55微米。

由于以上技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明創(chuàng)新采用巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)結(jié)合微流控技術(shù)的方法，開發(fā)出了單分散性的水凝膠蛋白質(zhì)捕獲微籠。由于在錯(cuò)誤折疊和聚集過程中，蛋白從小尺寸單體生長到更大尺寸的纖維，根據(jù)本發(fā)明方法，可以洗去折疊程度低的小分子蛋白質(zhì)，從而僅捕獲錯(cuò)誤折疊程度高的蛋白質(zhì)寡聚物和纖維，從而進(jìn)行針對(duì)性研究。同時(shí)，水凝膠的形成無需借助加熱或紫外照射，在此過程中不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，使檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的工藝原理圖；

圖2為微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3顯示了利用微流控芯片制備外層為油相內(nèi)層為含有蛋白肽溶液的微凝膠的示意圖；

圖4為實(shí)施例制備的微液滴和微籠的光學(xué)顯微鏡圖；

圖5為水凝膠微籠的熒光測(cè)定圖；

圖6為實(shí)施例制備的微液滴和微籠經(jīng)光學(xué)顯微鏡圖觀察并繪制的粒徑分布圖；

圖7為水凝膠微籠硫黃素T染色實(shí)驗(yàn)熒光強(qiáng)度的示意圖。

具體實(shí)施方式

球形水凝膠，又稱微凝膠已被用于模擬細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境。通常情況下，微凝膠可以通過勻漿機(jī)制作。但是，這種方法得到的微凝膠粒徑是多分散的，不同大小的微凝膠個(gè)體之間缺乏相互對(duì)比性。而粒徑的單分散性可以提高微凝膠球體之間的可比性。

本發(fā)明的工藝原理圖參見圖1。在本發(fā)明中，我們運(yùn)用了巰基-烯點(diǎn)擊反應(yīng)同時(shí)結(jié)合微流控技術(shù)的方法，開發(fā)出了單分散性的水凝膠蛋白質(zhì)捕獲微籠。具體的說，本發(fā)明利用微流控芯片生產(chǎn)具有單分散性的水凝膠微液滴，并將蛋白肽單體包裹在微液滴內(nèi)(如圖1A所示)。然后通過于37℃培養(yǎng)微液滴使蛋白肽折疊聚集，之后用用冰浴冷卻微液滴的方法，種植蛋白聚集過程(如圖1B所示)。隨后，通過加入脫乳化劑(如弱表面活性劑)除去油和表面活性劑的液滴涂層。脫乳化劑的加入導(dǎo)致表面活性劑在油/水界面的不穩(wěn)定，從而使油水兩相的分離(如圖1C所示)。如果使用氟油這樣的弱表面活性劑(例如全氟辛醇或其他含有一個(gè)小親水基團(tuán)的氟化合物)，未聚集的蛋白肽或低聚物和高分子積聚體(小于微凝膠孔道大小)都會(huì)在緩沖溶液沖洗微凝膠的過程中被洗出(如圖1D所示)。與此相反，大于微凝膠孔道大小的高分子聚集體和纖維狀的蛋白質(zhì)積聚體則被捕獲在微凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)。同時(shí)，由于微凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的存在，微凝膠不僅能保留蛋白積聚體，還可以后續(xù)向微凝膠中加入生物反應(yīng)所需小分子，從而進(jìn)行其他生物反應(yīng)。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。實(shí)施例中未注明的條件為常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件。

實(shí)施例1微流控芯片的設(shè)計(jì)和制作

微流控芯片設(shè)計(jì)為如圖2所示，其包括芯片本體1，形成于芯片本體1上且在一端部相交匯構(gòu)成第一聚焦區(qū)A的第一微通道2、第二微通道3和第三微通道4，形成于芯片本體1上且在一端部相交匯構(gòu)成第二聚焦區(qū)B的第四微通道5、第五微通道6和第六微通道7，以及形成于芯片本體1上的第七微通道9，其中第四微通道5的另一端與第一聚焦區(qū)A連通，第七微通道9的一端與第二聚焦區(qū)B連通。在第一至第六微通道7的進(jìn)口端分別設(shè)置有過濾器8。本例中，過濾器8的過濾精度為1微米。

以軟刻蝕法制作微流控芯片，具體步驟如下：

i)將設(shè)計(jì)好的各微通道印刷在醋酸膜上，并將醋酸膜放置于涂覆有光刻膠的硅晶片頂部，經(jīng)過紫外光照射，即得芯片模板；

ii)將聚二甲基硅氧烷預(yù)聚物和其交聯(lián)劑灌注在芯片模板上，進(jìn)行固化；將固化的聚二甲基硅氧烷模具剝離芯片模板，并對(duì)各所述微通道的出入口進(jìn)行壓力穿孔，之后運(yùn)用表面平整的基底(例如顯微鏡用載玻片)對(duì)各微通道進(jìn)行密封；

iii)將表面疏水劑(如玻璃鍍膜劑Aquapel)注入微孔道并靜置5分鐘，使得通道表面疏水，最后加裝過濾器即得微流控芯片。

實(shí)施例2捕獲人β淀粉樣蛋白1-42蛋白

(1)制備外層為油相內(nèi)層為含有蛋白肽溶液的微凝膠

將2-亞氨基硫烷鹽酸鹽、聚乙二醇雙胺(2kDa)以及超支化聚丙三醇(20kDa)分別溶解在pH 7.4的Napi緩沖溶液中，獲得濃度分別為21g/L、300g/L和1000g/L的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽、聚乙二醇雙胺以及超支化聚丙三醇的水溶液。

將2-亞氨基硫烷鹽酸鹽水溶液與聚乙二醇雙胺水溶液以體積比0.75:1混合，室溫下攪拌30分鐘，使二者反應(yīng)轉(zhuǎn)化成雙巰基聚乙二醇，得到雙巰基聚乙二醇水溶液，反應(yīng)方程式如下：

將超支化聚丙三醇水溶液及雙巰基聚乙二醇水溶液分別注入200微升固定針氣密注射器中。

用HiLyte Fluor^TM488對(duì)人β淀粉樣蛋白1-42肽單體側(cè)鏈的N-末端進(jìn)行熒光標(biāo)記，并溶解于1wt％的氨水中做為預(yù)備蛋白肽單體溶液。將預(yù)備蛋白肽單體溶液以pH 7.4的磷酸緩沖溶液稀釋成所需濃度(如5微米)，得到HiLyte Fluor^TM488修飾的人β淀粉樣蛋白1-42的水溶液(以下簡稱蛋白肽溶液)，注入注射器，并置于冰浴中。

參見圖3所示，取超支化聚丙三醇水溶液、雙巰基聚乙二醇水溶液、蛋白肽溶液分別以流速200微升/小時(shí)注入微流控芯片的第一微通道、第二微通道和第三微通道，三者在芯片的第一聚焦區(qū)混合得到混合液。混合液自第四微通道流入第二聚焦區(qū)，并在第二聚焦區(qū)被以流速2000微升/小時(shí)注入的氟化液HFE-7500包裹形成單分散微液滴(微液滴的光學(xué)顯微鏡圖參見圖4A，粒徑分布圖參見圖6A，微液滴大小為約48微米，且呈現(xiàn)非常好的單分散性)，微液滴從第七微通道流出收集。微液滴在芯片上的生成過程通過安裝在IX71倒置顯微鏡的單色幻影V7.2相機(jī)進(jìn)行成像。然后利用LabVIEW 8.2計(jì)算液滴的生成頻率，約為1.2千赫茲。在這過程中，超支化聚丙三醇和雙巰基聚乙二醇在微液滴中發(fā)生巰基-烯的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，并快速形成水凝膠。

(2)培養(yǎng)

將步驟(1)制備得到的外層為油相內(nèi)層為含有蛋白肽溶液的微凝膠置于37℃下培養(yǎng)一定時(shí)間，使蛋白肽折疊聚集。當(dāng)培養(yǎng)結(jié)束，冰浴冷卻60秒淬滅反應(yīng)。

(3)破壞微凝膠的油相外層并進(jìn)行清洗

向經(jīng)過步驟(2)的體系中加入全氟辛醇油，打開微液滴的油相外層，并用pH7.4的磷酸緩沖溶液于離心旋杯柱(0.45μm孔徑)中清洗3次，并保存在pH7.4的磷酸緩沖溶液中，得到內(nèi)含高程度聚合蛋白的水凝膠微籠(水凝膠微籠的光學(xué)顯微鏡圖參見圖4B，應(yīng)的粒徑分布圖參見圖6B，微籠大小為約47微米，且呈現(xiàn)非常好的單分散性)，以備熒光測(cè)定，相應(yīng)熒光測(cè)定圖參見圖5。從該圖可見，水凝膠微籠內(nèi)蛋白質(zhì)主要以折疊程度高的聚合蛋白(蛋白積聚體)形式存在。

此外，為了進(jìn)一步證明水凝膠微籠內(nèi)蛋白質(zhì)以蛋白積聚體存在，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)：取實(shí)施例所得水凝膠微籠，加入硫磺素T(Thioflavin T)進(jìn)行染色，于470nm激發(fā)熒光檢測(cè)，如圖7所示，微籠內(nèi)熒光強(qiáng)度值明顯大于洗出液的熒光強(qiáng)度值，表明水凝膠微籠內(nèi)蛋白的積聚程度較高(由于硫磺素T結(jié)合b淀粉樣蛋白后，染料本身結(jié)構(gòu)改變，熒光值升高(淀粉樣蛋白的積聚程度越高，則與硫磺素T結(jié)合的量就越大，因此熒光值也越高)。

上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。