本發(fā)明涉及中藥材的鑒別與質(zhì)量控制方法，具體涉及基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的洋金花藥材鑒別方法。

背景技術(shù)：

洋金花，又名南洋金花、風(fēng)茄花、白花曼陀羅，為茄科植物白花曼陀羅Datura metel L.的干燥花。性溫、味辛、有毒，歸心、肺、肝經(jīng)?？捎糜诳人韵?、風(fēng)濕痹痛、脘腹冷痛和外科麻醉等。東莨菪堿和莨菪堿為其主要功效成分，對(duì)毒蕈堿型膽堿受體具有拮抗作用。洋金花主要分布于江蘇、安徽、四川、廣東、福建等地。其混淆品眾多，例如凌霄花、鬧羊花、百合花、泡桐花。它們的性狀特征相似，但功效卻相差甚遠(yuǎn)。若不能加以區(qū)分，則無法保證用藥的安全性和有效性。

《中國(guó)藥典》中對(duì)洋金花的鑒別，采用了顯微鑒別和理化鑒別兩種方式。顯微鑒別對(duì)洋金花花粉粒、花萼非腺毛等性狀都有明確規(guī)定。該方法雖然簡(jiǎn)單，但由于洋金花與其混淆品在很多方面性狀相似，顯微鑒別的準(zhǔn)確性很大程度上依賴于操作者的經(jīng)驗(yàn)。理化鑒別是以硫酸阿托品和氫溴酸東莨菪堿為對(duì)照品，將供試品溶液和對(duì)照品溶液分別于同一硅膠G薄層板上展開，對(duì)比供試品和對(duì)照品在相應(yīng)的位置上是否顯示相同顏色的斑點(diǎn)。此方法具有操作繁雜、通量小和效率低等缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種通量高、專屬性強(qiáng)的洋金花藥材鑒別方法，能夠有效區(qū)分洋金花及其7種易混偽品。

本發(fā)明的檢測(cè)原理是細(xì)胞膜受體接受刺激會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)部動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布，而光學(xué)傳感器能夠檢測(cè)由于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)量再分布產(chǎn)生的折光率的變化，該變化與產(chǎn)生刺激的小分子的量成正比(圖1)。

本發(fā)明涉及一種洋金花藥材的鑒定方法，其中包括：基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理鑒別法、HPLC，包括如下五個(gè)步驟：

(1)藥材的提取、

(2)用共振波導(dǎo)光柵傳感器檢測(cè)藥材提取液刺激CHO-M₂細(xì)胞所產(chǎn)生的藥理表型、

(3)用共振波導(dǎo)光柵傳感器檢測(cè)乙酰膽堿和藥材提取液共同刺激CHO-M₂細(xì)胞所產(chǎn)生的整合藥理表型、

(4)整合第2、3步的藥理表型，并與洋金花藥材表型進(jìn)行比對(duì)。

(5)基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理鑒別法與HPLC的聯(lián)合用于鑒定洋金花藥材質(zhì)量

具體步驟如下：

(1)藥材的提?。壕芊Q定1g藥材粉末，置錐形瓶中，加入10mL濃度為2mol/L的鹽酸溶液，超聲處理(功率250W，頻率40kHz)30分鐘，放冷，濾過，濾渣和濾器用10mL上述鹽酸溶液分?jǐn)?shù)次洗滌，合并濾液和洗液，用濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至9，用三氯甲烷振搖提取4次，每次10mL，合并三氯甲烷，回收溶劑至干，殘?jiān)镁彌_液溶解，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加緩沖液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用于測(cè)試。

(2)取20μL CHO-M₂細(xì)胞懸液接種在細(xì)胞測(cè)試板中，放入含有5％二氧化碳、溫度為37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14小時(shí)。取出細(xì)胞測(cè)試板，移除培養(yǎng)基，用移液槍向每個(gè)孔中加入20μL Hank's平衡鹽溶液。將測(cè)試板放入Corning EpicBT系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)平衡。1小時(shí)后，將基線歸零并啟動(dòng)一個(gè)新的信號(hào)記錄程序。記錄2分鐘后，暫停程序，用排槍將10μL提取液加入每個(gè)微孔中，并繼續(xù)記錄1小時(shí)。如果加入藥材提取液后檢測(cè)信號(hào)超過100pm，則該表型記為1；若信號(hào)在-100到100之間，則該表型記為0；若信號(hào)小于-100，則該表型記為-1。藥材提取液在該階段所產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布信號(hào)即為第一相表型。

(3)在上述記錄程序結(jié)束后，重新開始一個(gè)程序。信號(hào)記錄2分鐘后暫停程序，用排槍向每個(gè)孔中加入10μL濃度為16μM的乙酰膽堿Hank's平衡鹽溶液，然后繼續(xù)記錄程序1小時(shí)。如果加入乙酰膽堿溶液后信號(hào)超過100pm，則該表型記為1；若信號(hào)在-100到100之間，則該表型記為0；若信號(hào)小于-100，則該表型記為-1。該階段產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布信號(hào)即為第二相表型。

(4)綜合步驟2和3的表型，如果滿足(1,0)則為洋金花，其中“1”為步驟2的表型，“0”為步驟3的表型。否則，即為偽品藥材。

(5)按照如下條件對(duì)洋金花進(jìn)行HPLC分析，將成分的峰面積或含量與藥材活性值進(jìn)行關(guān)聯(lián)。

流動(dòng)相A:含有0.0025mol/L庚烷磺酸鈉的水溶液，用磷酸調(diào)至pH＝5；

流動(dòng)相B：乙腈。

分離條件為(以B％表示)：

0-13min，16-16％；

13-20min，16-18％；

20-28min，18-18％；

28-30min，18-20％；

30-42min，20-20％；

42-60min，20-25％。

流速為1.0mL/min。

檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。

上述步驟所述CHO-M₂細(xì)胞是指能夠穩(wěn)定表達(dá)毒蕈堿M₂型膽堿受體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞。

上述步驟(1)所述的緩沖液為Hank's平衡鹽溶液。

上述步驟(2)所述的培養(yǎng)基為含有10％胎牛血清、80U/mL青霉素、0.08mg/mL鏈霉素、0.4mg/mL遺傳霉素和0.08mg/mL博來霉素的HyClone Ham'sF-12營(yíng)養(yǎng)液。

上述步驟(2)所述的CHO-M₂細(xì)胞密度為2,5000個(gè)/孔。

上述步驟(2)所述的細(xì)胞測(cè)試板為Epic 384孔細(xì)胞測(cè)試板或纖維蛋白覆蓋的Epic 384孔細(xì)胞測(cè)試板。

正品洋金花通過上述方法會(huì)產(chǎn)生一個(gè)唯一的二相表型。第一相為洋金花與CHO-M₂細(xì)胞相互作用產(chǎn)生的藥理表型。由于洋金花藥材中的復(fù)雜成分作用于CHO-M₂細(xì)胞表面的某種受體，引起了細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布，導(dǎo)致傳感器信號(hào)的抬升(表型記為“1”)。第二相為洋金花、乙酰膽堿與CHO-M₂細(xì)胞三者相互作用產(chǎn)生的藥理表型。由于洋金花可以拮抗M₂受體，而乙酰膽堿激動(dòng)M₂受體，二者作用抵消，使傳感器信號(hào)基本保持不變(表型記為“0”)。理論上，藥物與CHO-M₂細(xì)胞在傳感器上一共能產(chǎn)生上升(1)、下降(-1)、不變(0)三種表型(如圖2)，而基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理法可能產(chǎn)生3×3＝9種表型。洋金花的專屬表型為(1,0)，而其混偽品的表型則對(duì)應(yīng)其他8種表型。以此方法可對(duì)洋金花與其混偽品進(jìn)行鑒別。

本發(fā)明涉及一種洋金花藥材的鑒定方法，其中包括：基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理鑒別法、HPLC，包括如下五個(gè)步驟：

(1)藥材的提取、

(2)用共振波導(dǎo)光柵傳感器檢測(cè)藥材提取液刺激CHO-M2細(xì)胞所產(chǎn)生的藥理表型、

(3)用共振波導(dǎo)光柵傳感器檢測(cè)乙酰膽堿和藥材提取液共同刺激CHO-M2細(xì)胞所產(chǎn)生的整合藥理表型、

(4)整合第2、3步的藥理表型，并與洋金花藥材表型進(jìn)行比對(duì)、

(5)藥材提取物的HPLC分析與譜效關(guān)聯(lián)。

本發(fā)明的洋金花藥材鑒別方法適用于茄科植物洋金花(包括干品、鮮品、不同產(chǎn)地藥材)與其它科同名異物洋金花的區(qū)分。本發(fā)明的洋金花藥材鑒別方法同樣也適用于含有茄科植物洋金花藥材的人用藥品、食品、保健品、化妝品、獸藥等各種制成品(包括單方、復(fù)方制成品)中是否含有洋金花藥材的鑒別。

本發(fā)明提供的洋金花藥材鑒別方法與現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中的顯微鑒別方法比較，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1.具有高通量，可同時(shí)對(duì)384個(gè)樣品進(jìn)行鑒定。避免了顯微鑒別單通道耗時(shí)長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大的弊端。

2.顯微鑒別的操作者通常需要具備關(guān)于藥材顯微特征的專業(yè)知識(shí)，且要對(duì)易混藥材的細(xì)微特征具有辨識(shí)能力。而本發(fā)明最終產(chǎn)生的表型只是簡(jiǎn)單類似(1,0)的數(shù)字，對(duì)經(jīng)驗(yàn)的依賴性更少，結(jié)果的辨識(shí)度更高，可以避免誤判。

3.該方法可以定量表征洋金花藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，而顯微鑒別只能辨別真?zhèn)巍?/p>

附圖說明：

圖1：共振波導(dǎo)光柵傳感器的原理圖

圖2：基于共振波導(dǎo)光柵傳感器產(chǎn)生的3種表型

圖3：從H9c2細(xì)胞(A)、HAVEC細(xì)胞(B)、CHO-M₂細(xì)胞(C)中篩選合適的細(xì)胞用于洋金花藥材的鑒別

圖4：共振波導(dǎo)光柵傳感器可以檢測(cè)莨菪堿(A)和東莨菪堿(B)濃度依賴性地拮抗乙酰膽堿對(duì)M₂受體的激動(dòng)作用

圖5：20批不同產(chǎn)區(qū)洋金花藥材的表型

圖6：共振波導(dǎo)光柵傳感器可以檢測(cè)洋金花提取液濃度依賴性地拮抗乙酰膽堿對(duì)M₂受體的激動(dòng)作用

圖7：基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理法對(duì)洋金花藥材及其易混偽品的鑒別

圖8：比較洋金花及其易混偽品的顯微鑒別特征(花粉粒和非腺毛)

圖9：20批不同產(chǎn)區(qū)洋金花藥材的高效液相色譜圖

圖10：127個(gè)峰組合與洋金花藥材活性相關(guān)性的聚類分析

圖11：東莨菪堿和莨菪堿的定量方程、線性范圍、檢測(cè)限以及定量限

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：洋金花鑒別法建立的方法學(xué)考查

1.實(shí)驗(yàn)儀器及材料

電子天平(Sartorius,0.01mg)、Corning Epic BT系統(tǒng)、CHO-M₂細(xì)胞、Epic 384孔細(xì)胞測(cè)試板(Corning 5040)。

2.合適細(xì)胞的選取

適用于共振波導(dǎo)光柵傳感器檢測(cè)的細(xì)胞需滿足兩個(gè)要求：(1)細(xì)胞膜上有豐富的靶標(biāo)受體；(2)激動(dòng)劑能夠刺激受體并引起細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布。在生理系統(tǒng)下，M₂受體主要分布在心臟和血管等部位。因此，心肌細(xì)胞系(H9c2)、人主動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HAVEC)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)M₂受體的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO-M₂)細(xì)胞被用于模型測(cè)試。結(jié)果如圖3所示，在加入10μL濃度為16μM乙酰膽堿后，H9c2和HAVEC沒有檢測(cè)到明顯的動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布信號(hào)。而在CHO-M₂細(xì)胞上，傳感器的信號(hào)響應(yīng)隨著乙酰膽堿濃度的增加而梯度增加，表明該細(xì)胞是理想的細(xì)胞模型。

3.標(biāo)志性化合物莨菪堿和東莨菪堿的藥效評(píng)價(jià)

莨菪堿和東莨菪堿是洋金花的標(biāo)志性成分。按照基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理法操作，可以觀察到莨菪堿或東莨菪堿濃度依賴性地拮抗乙酰膽堿引起的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布信號(hào)(圖4)。

按照如下公式：拮抗率％＝(A_乙酰膽堿－A_{待測(cè)液})/(A_乙酰膽堿－A_空白)。A_乙酰膽堿為用乙酰膽堿激動(dòng)受體時(shí)所檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度，A_空白為加空白溶液時(shí)傳感器所檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度，A_{待測(cè)液}為加入待測(cè)液和乙酰膽堿時(shí)傳感器所檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度。

通過對(duì)其活性曲線的擬合，可以計(jì)算出莨菪堿和東莨菪堿的半數(shù)有效濃度(EC₅₀)值分別為0.16μM和0.27μM，表明該發(fā)明可以定量表征莨菪堿和東莨菪堿的活性。

實(shí)施例2：對(duì)來自中國(guó)20個(gè)產(chǎn)區(qū)的洋金花表型進(jìn)行鑒別。

1.實(shí)驗(yàn)儀器及材料

電子天平(Sartorius,0.01mg)、Corning Epic BT系統(tǒng)、CHO-M₂細(xì)胞、Epic 384孔細(xì)胞測(cè)試板(Corning 5040)、20批洋金花。

2.方法和結(jié)果

取來自中國(guó)不同產(chǎn)區(qū)的20批藥材(過三號(hào)篩)約1g，精密稱定，置錐形瓶中，加入10mL濃度為2mol/L的鹽酸溶液，超聲處理(功率250W，頻率40kHz)30分鐘，放冷，濾過，濾渣和濾器用10mL的2mol/L鹽酸溶液分?jǐn)?shù)次洗滌，合并濾液和洗液，用濃氨試液調(diào)節(jié)pH值至9，用三氯甲烷振搖提取4次，每次10mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)肏ank's平衡鹽溶液溶解，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加Hank's平衡鹽溶液至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用于測(cè)試。

按照基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理法，在第一相加入相當(dāng)于原藥材濃度為0.625mg/mL的洋金花提取物溶液，第二相加入16μM乙酰膽堿溶液。結(jié)果如圖5所示，20批不同產(chǎn)區(qū)的洋金花呈現(xiàn)出非常一致的表型(1,0)，即在第一相洋金花提取液能引起動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布現(xiàn)象，這可能是由于其中包含黃酮類、內(nèi)酯類等多種成分對(duì)CHO-M₂細(xì)胞整體作用的結(jié)果；在第二相沒有動(dòng)態(tài)質(zhì)量再分布信號(hào)，這是由于洋金花提取液的拮抗作用抵消了乙酰膽堿的激動(dòng)作用。上述結(jié)果表明表型(1,0)可以做為不同產(chǎn)區(qū)洋金花的共同特征，這是Epic二相表型藥理法可以用做洋金花藥材鑒別的前提條件。

與莨菪堿和東莨菪堿類似，洋金花同樣濃度依賴性地拮抗乙酰膽堿對(duì)M₂受體的拮抗作用(圖6)。

按照如下公式：拮抗率％＝(A_乙酰膽堿－A_{待測(cè)液})/(A_乙酰膽堿－A_空白)。A_乙酰膽堿為用乙酰膽堿激動(dòng)受體時(shí)所獲得的信號(hào)強(qiáng)度，A_空白為加空白溶液時(shí)傳感器所檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度，A_{待測(cè)液}為加入待測(cè)液和乙酰膽堿時(shí)傳感器所檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度。通過對(duì)其活性曲線的擬合，可以計(jì)算出洋金花藥材的半數(shù)有效濃度(EC₅₀)。結(jié)果如表1所示，其中EC₅₀越小的樣品表示活性越好，其質(zhì)量也越好。

表1 20批洋金花藥材的來源以及半數(shù)有效濃度(EC₅₀)。

實(shí)施例3：本發(fā)明與中藥顯微鑒定的比較

1.實(shí)驗(yàn)儀器及材料

電子天平(Sartorius,0.01mg)、Corning Epic BT系統(tǒng)、CHO-M₂細(xì)胞、Epic 384孔細(xì)胞測(cè)試板(Corning 5040)、洋金花及其易混偽品。

2.方法和結(jié)果

收集洋金花的7種易混偽品包括泡桐花、金銀花、山銀花、凌霄花、百合花、木槿花、鬧羊花。按照實(shí)施例2的方法對(duì)藥材進(jìn)行提取，配制相當(dāng)于原藥材濃度為0.625mg/mL的測(cè)試液。按照基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理法，對(duì)其進(jìn)行表型測(cè)試。結(jié)果如圖7所示，洋金花的表型為(1,0)。而其他7種藥材因?yàn)闆]有拮抗M₂受體的作用，而在第二相表現(xiàn)出“1”的表型，例如(0,1)和(1,1)。通過本發(fā)明，洋金花藥材與其他混偽品的表型區(qū)別顯著，證明了該方法在洋金花鑒別方面的有效性。

為了體現(xiàn)該方法的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)典的顯微鑒別方法被用于對(duì)比。結(jié)果如圖8所示，洋金花的顯微特征主要在于：(1)花粉粒類球形或長(zhǎng)圓形，表面有條紋狀雕紋。(2)非腺毛1～3細(xì)胞，壁具疣突。

相比于顯微鑒別，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：a具有高通量，可同時(shí)對(duì)384個(gè)樣品進(jìn)行鑒定。避免了顯微鑒別單通道耗時(shí)長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大的弊端。b顯微鑒別的操作者通常需要具備關(guān)于藥材顯微特征的專業(yè)知識(shí)，且要對(duì)易混藥材的細(xì)微特征具有辨識(shí)能力。而本發(fā)明最終產(chǎn)生的表型只是簡(jiǎn)單類似(1,0)的數(shù)字，對(duì)經(jīng)驗(yàn)的依賴性更少，結(jié)果的辨識(shí)度更高，可以避免誤判。c該方法可以定量表征洋金花藥材質(zhì)量的優(yōu)劣，而顯微鑒別只能辨別真?zhèn)巍?/p>

實(shí)施例4：基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理鑒別法與HPLC的聯(lián)合用于鑒定洋金花藥材質(zhì)量

1.實(shí)驗(yàn)儀器及材料

Agilent 1100液相系統(tǒng)、Agilent C₁₈液相色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)、庚烷磺酸鈉(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)、乙腈(Merck)、Milli-Q水純化系統(tǒng)、磷酸二氫鉀(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)、磷酸(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)、中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版、IBM SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件19.0、PermutMatrixEN軟件。

2.方法和結(jié)果

樣品的制備：按照實(shí)施例2的方法對(duì)藥材進(jìn)行提取，采用如下色譜條件對(duì)20批不同產(chǎn)地的洋金花藥材進(jìn)行分析。

流動(dòng)相A:含有0.0025mol/L庚烷磺酸鈉的水溶液，用磷酸調(diào)至pH＝5；

流動(dòng)相B：乙腈。

分離條件為(以B％表示)：

0-13min，16-16％；

13-20min，16-18％；

20-28min，18-18％；

28-30min，18-20％；

30-42min，20-20％；

42-60min，20-25％。

流速為1.0mL/min。

檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。

在色譜分析之后，將“AIA”為后綴的數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版，在多點(diǎn)校正之后，從20批洋金花的色譜圖中識(shí)別了7個(gè)共有峰(圖9)?；谶@7個(gè)色譜峰，按照排列組合算法可以獲得127種組合

每個(gè)組合的色譜峰面積總和形成一個(gè)數(shù)據(jù)集。20批洋金花藥材的EC₅₀值構(gòu)成第128個(gè)數(shù)據(jù)集。

用IBM SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件19.0來計(jì)算127個(gè)組合與第128個(gè)活性值之間的皮爾森相關(guān)系數(shù)，并用PermutMatrixEN軟件的Hierarchical分析法對(duì)其進(jìn)行聚類排序。結(jié)果如圖10所示，對(duì)于每一個(gè)聚類分析，相關(guān)性從左到右依次減小。7個(gè)色譜峰與活性的相關(guān)性排序?yàn)?>2>1>7>6>4>5(圖10A)。

通過比較多個(gè)峰組合的皮爾森相關(guān)系數(shù)(圖10B-E)，可以發(fā)現(xiàn)包含色譜峰2或3的組合排序靠前，而不含峰2和3的組合排序靠后。同時(shí)包含峰2和3組合的相關(guān)性系數(shù)要大于僅包含峰2或3的組合(圖10F)。

上述結(jié)果表明色譜峰2和3是洋金花藥材中與活性密切相關(guān)的成分。高分辨質(zhì)譜分析結(jié)果表明峰2和3在正離子模式下的質(zhì)荷比為304.1548和290.1753，并被最終鑒定為東莨菪堿(C₁₇H₂₁NO₄)和莨菪堿(C₁₇H₂₃NO₃)。它們的定量方程、線性范圍、檢測(cè)限以及定量限如圖11所示。

20批不同產(chǎn)地洋金花中東莨菪堿和莨菪堿的含量檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 20批洋金花藥材中東莨菪堿和莨菪堿的含量(mg/mL)。

按照實(shí)施例2的方法對(duì)來自中國(guó)20個(gè)產(chǎn)區(qū)的洋金花表型進(jìn)行鑒別。

上述結(jié)果表明，基于共振波導(dǎo)光柵傳感器的二相表型藥理鑒別法與HPLC的聯(lián)合使用對(duì)建立藥材與活性之間的譜效關(guān)系具有積極意義。