本發(fā)明涉及一種同位素稀釋超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用快速靈敏測定維生素K₁的方法。

背景技術(shù)：

維生素K₁又稱植物甲萘醌，是一種脂溶性維生素，為人體肝內(nèi)合成凝血酶原的必需物質(zhì)，可促進(jìn)凝血酶原(II因子)及其它凝血因子(VIII、IX、X因子)的前體物質(zhì)羧化反應(yīng)，進(jìn)而轉(zhuǎn)變成凝血酶原和相應(yīng)的凝血因子。臨床常用于皮膚黏膜出血、內(nèi)臟出血、外傷手術(shù)后出血、新生兒出血及其他深部組織出血等的治療。此外，維生素K₁還參與骨代謝和細(xì)胞生長，具有鎮(zhèn)痛、緩解支氣管痙攣的作用。維生素K₁的檢測方法可應(yīng)用于多個方面，比如科研研究，單純性數(shù)據(jù)檢測等，并非限定于診斷，而且臨床疾病診斷是一個綜合評價，本指標(biāo)不能完全反映某種疾病的診斷情況，僅作為一種輔助參考。

維生素K₁對維系人體健康十分重要，因此，需要建立一種簡單快速、準(zhǔn)確靈敏測定維生素K₁的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種簡單快速、靈敏準(zhǔn)確的測定維生素K₁含量的同位素稀釋超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定維生素K₁的方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的方案為：

一種同位素稀釋超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定維生素K₁的方法，該方法包括以下步驟：

S1：配制維生素K₁對照品溶液和維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液的步驟；

用甲醇分別溶解維生素K₁和維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)，制成已知濃度的維生素K₁對照品儲備液和已知濃度的維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)儲備液；

用甲醇將已知濃度的維生素K₁對照品儲備液分別稀釋成一系列具有不同已知濃度的維生素K₁對照品溶液；

用甲醇將已知濃度的維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)儲備液稀釋成已知濃度的維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液；

S2：建立維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟：

分別吸取一定體積(V₁)的具有不同已知濃度的維生素K₁對照品溶液，加入1～5倍于體積(V₁)的維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，加入1～10倍于體積(V₁)的萃取溶液，渦旋混勻，離心，取一定體積(V₂)的上清液，室溫下氮?dú)獯蹈?，加入一定體積(V₃)的復(fù)溶劑，渦旋混勻，離心，得到一系列具有不同已知濃度的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液；

在相同的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，將一定體積(V₄)的具有不同已知濃度的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液分別注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得一系列具有不同已知濃度的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的色譜圖(LC-MS/MS色譜圖)；

以維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的色譜圖中維生素K₁色譜峰峰面積與維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值為縱坐標(biāo)或橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的維生素K₁濃度為橫坐標(biāo)或縱坐標(biāo)，建立維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線；

S3：采集待測樣品溶液的總離子色譜圖的步驟；

吸取一定體積(V₁)的待測樣品，加入1～5倍于體積(V₁)的維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，加入1～10倍于體積(V₁)的萃取溶液，渦旋混勻，離心，取一定體積(V₂)的上清液，室溫下氮?dú)獯蹈?，加入一定體積(V₃)的復(fù)溶劑，渦旋混勻，離心，得待測樣品溶液；

在與S2步驟中相同的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，取一定體積(V₄)的待測樣品溶液注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得待測樣品溶液的色譜圖；

S4：計算待測樣品中維生素K₁濃度的步驟；

將待測樣品溶液色譜圖中維生素K₁色譜峰峰面積與維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值帶入已建立的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出待測樣品中維生素K₁的濃度。

該方案的測定方法簡單快速、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、精密度高、靈敏度好，可用于不同類型樣品中的維生素K₁含量的測定，特別是維生素K₁含量較少的樣品，如血清的測定。

當(dāng)上述方案適用于不同樣品時，隨著待測樣品中維生素K₁含量的變化，有可能認(rèn)為其測試結(jié)果不一定準(zhǔn)確；為了提高測試結(jié)果的證明力，所述方法還包括：

S5：采集加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品溶液的色譜圖的步驟；

吸取一定體積(mV₁，0<m<1)的待測樣品，加入若干體積((1-m)V₁)的不同已知濃度的維生素K₁對照品溶液，并使兩者體積之和與S3步驟待測樣品體積相同(mV₁+(1-m)V₁＝V₁)；加入1～5倍于前述總體積(V₁)的維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻，加入1～10倍于待測樣品和對照品總體積(V₁)的萃取溶液，渦旋混勻，離心，取一定體積的上清液，室溫下氮?dú)獯蹈桑尤胍欢w積的復(fù)溶劑，渦旋混勻，離心，得到不同濃度的加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品溶液；

在與S2步驟中相同超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，取一定體積的加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品溶液注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品溶液的色譜圖；

將加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品溶液色譜圖中維生素K₁色譜峰峰面積與維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值帶入已建立的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品中維生素K₁的濃度；

S6：計算加標(biāo)回收率的步驟：

回收率％＝(測得濃度-待測樣品平均濃度)/加標(biāo)濃度×100％。

通過加標(biāo)回收率的計算，可以明顯、直觀地看出該測試方法的測量精度，從而可以使測量結(jié)果更具說服力。另外，為了使加標(biāo)回收率樣品的測試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液和待測樣品溶液的測量條件更為接近，可使各對應(yīng)步驟的溶液體積是相同的；例如，當(dāng)獲得加標(biāo)回收率樣品溶液的色譜圖的步驟中吸取的待測樣品和對照品溶液的體積分別為mV₁(0<m<1)和(1-m)V₁，此時的加標(biāo)回收率的計算公式則為：

回收率％＝(測得濃度-待測樣品平均濃度*m)/[加標(biāo)濃度*(1-m)]×100％

此外，在待測樣品檢測過程中均勻加入不同濃度的質(zhì)控樣品，通過評價質(zhì)控樣品的精密度和準(zhǔn)確度，來評價待測樣品檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)而確保待測樣品檢測結(jié)果的可靠性。

優(yōu)選地，所述超高效液相色譜質(zhì)譜條件包括：

色譜條件：

色譜柱：采用十八烷基硅烷鍵合的固定相；流動相：酸水溶液-酸/鹽有機(jī)相溶液；流動相的流速：0.3～0.5mL/min；柱溫：30～60℃；進(jìn)樣量：2～20μL；

質(zhì)譜條件：

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正離子模式；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：5500V；離子源溫度：550℃；離子源霧化氣：40psi；離子源加熱輔助氣：60psi；氣簾氣：30psi；碰撞氣：4psi。

更佳地，掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測，多反應(yīng)監(jiān)測條件如下

優(yōu)選地，所述流動相為甲酸水溶液-甲酸甲酸銨甲醇溶液或0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸2mM甲酸銨甲醇溶液。

優(yōu)選地，所述離子源霧化氣、離子源加熱輔助氣、氣簾氣和碰撞氣中的氣體均為氮?dú)狻?/p>

優(yōu)選地，所述萃取溶劑為正己烷、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷等中的至少一種；

優(yōu)選地，所述復(fù)溶劑為純水、甲醇、乙腈、乙醇等中的至少一種。

優(yōu)選地，所述維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)為²H₇-維生素K₁。

優(yōu)選地，所述維生素K₁對照品溶液的一系列具有不同已知濃度范圍為0.1～20ng/mL。

優(yōu)選地，所述渦旋混勻的時間為0.5～5min；

優(yōu)選地，所述離心條件為：4℃、10000～15000r/min、10～20min。

本發(fā)明的測定維生素K₁的同位素稀釋超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法用于維生素K₁的測定時，簡單靈敏、快速準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、精密度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高；并且適用范圍廣泛，對于維生素K₁含量少的血清等樣品的檢測尤其合適。

附圖說明

圖1濃度均為1ng/mL的維生素K₁及²H₇-維生素K₁的典型UPLC-MS/MS色譜圖；

圖2維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖3加標(biāo)回收率樣品溶液的典型UPLC-MS/MS色譜圖；

圖4血清樣品溶液中維生素K₁及²H₇-維生素K₁的典型UPLC-MS/MS色譜圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

儀器與試劑：

API 4000三重四級桿質(zhì)譜儀(美國，Applied Biosystem公司)配有電噴霧離子源；Waters超高效液相色譜儀(美國，Waters公司)配有二元高壓泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱；H1650R臺式高速冷凍離心機(jī)(中國，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；BT125D電子天平(德國，賽多利斯股份公司)；G560E渦旋混合器(美國，Scientific Industries公司)；MTN-2800W氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

維生素K₁、維生素K₁-[²H₇]購自IsoSciences公司(美國)；色譜甲醇、乙腈購自默克公司(德國)；色譜純甲酸銨購自上海麥克林生化科技有限公司(中國)；屈臣氏蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司(中國)；方法學(xué)研究實驗的血清樣本來自于杭州佰辰醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司送檢的血清樣本。

本實施例的一種同位素稀釋超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定血清中維生素K₁的方法，包括以下步驟：

(1)維生素K₁對照品溶液和維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液配制：

取維生素K₁ 1.0mg，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，定容至刻度，制成每1mL溶液中含20μg維生素K₁對照品儲備液；

取同位素內(nèi)標(biāo)維生素K₁-[²H₇]1.0mg，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶，定容至刻度，制成每1mL溶液中含有20μg ²H₇-維生素K₁的同位素內(nèi)標(biāo)儲備液；

用甲醇倍比稀釋維生素K₁對照品儲備液，得到濃度分別為20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL的維生素K₁對照品溶液；

用甲醇將²H₇-維生素K₁的同位素內(nèi)標(biāo)儲備液稀釋成5ng/mL的維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)溶液；

(2)建立維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線：

分別精密吸取維生素K₁對照品溶液100μL，加入100μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻1min，加入600μL正己烷，渦旋萃取3min，于4℃條件11000r/min離心15min，取400μL上清液，室溫下氮?dú)獯蹈?，加?50μL乙腈復(fù)溶，渦旋震蕩1min，于4℃條件11000r/min離心3min，得到維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液；

在相同的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，將10μL的一系列具有不同已知濃度的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液分別注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得一系列具有不同已知濃度的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的色譜圖；

以維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的色譜圖中維生素K₁色譜峰峰面積與維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的維生素K₁濃度為橫坐標(biāo)，建立維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線；

色譜條件：

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18(2.1mm×50mm,1.7μm)；流動相：0.1％甲酸水溶液(A)-0.1％甲酸2mM甲酸銨甲醇溶液(B)，梯度洗脫，洗脫程序：0.0～2.0min：70～90％B；2～2.5min：90～100％B；2.5～4.0min：100％B；4.0～4.2min：100～70％B；4.2～5.5min：70％B；流速：0.4mL/min；柱溫：50℃；進(jìn)樣量：10μL；

質(zhì)譜條件：

離子源：電噴霧離子源；掃描模式：正離子模式；毛細(xì)管電壓：5500V；離子源溫度：550℃；離子源霧化氣：40psi；離子源加熱輔助氣：60psi；氣簾氣：30psi；碰撞氣：4psi；氣體均為氮?dú)猓粧呙枘Ｊ剑憾喾磻?yīng)監(jiān)測，多反應(yīng)監(jiān)測條件如下表1所示：

表1維生素K₁及²H₇-維生素K₁的多反應(yīng)監(jiān)測條件

(3)采集血清樣品溶液的色譜圖：

精密吸取血清樣品100μL，加入100μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻1min，加入600μL正己烷，渦旋萃取3min，于4℃條件11000r/min離心15min，取400μL上清液，室溫下氮?dú)獯蹈桑尤?50μL乙腈復(fù)溶，渦旋震蕩1min，于4℃條件11000r/min離心3min，得到血清樣品溶液；

在與(2)步驟中相同的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，取體積10μL的血清樣品溶液注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得血清樣品溶液的色譜圖；

(4)血清樣品中維生素K₁濃度的確定：

將血清樣品溶液色譜圖中維生素K₁色譜峰峰面積與維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值帶入已建立的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出血清樣品中維生素K₁的濃度；

(5)采集加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品溶液的色譜圖：

精密吸取血清樣品體積80μL，加入20μL不同已知濃度的維生素K₁對照品溶液，加入100μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混勻1min，加入600μL正己烷，渦旋萃取3min，于4℃條件11000r/min離心15min，取400μL上清液，室溫下氮?dú)獯蹈?，加?50μL乙腈復(fù)溶，渦旋震蕩1min，于4℃條件11000r/min離心3min，得到不同濃度的加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品溶液；

在與(2)步驟中相同的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，取體積10μL的加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品溶液注入超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，獲得加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品溶液的色譜圖；

將加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品溶液色譜圖中維生素K₁色譜峰峰面積與維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值帶入已建立的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出加標(biāo)回收率樣品/質(zhì)控樣品中維生素K₁的濃度；

(6)加標(biāo)回收率計算：

回收率％＝(測得濃度-血清平均濃度×0.8)/加標(biāo)濃度×0.2×100％；

(7)線性關(guān)系、最低檢測限和最低定量限：

在與(2)步驟中相同的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，精密吸取10μL不同濃度的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液分別注入超高效液相色譜儀，每個濃度平行分析3次；記錄各濃度工作液中維生素K₁及²H₇-維生素K₁峰面積(如圖1，圖1為濃度均為1ng/mL的維生素K₁及²H₇-維生素K₁的典型UPLC-MS/MS色譜圖)，以維生素K₁色譜峰峰面積與維生素K₁同位素內(nèi)標(biāo)色譜峰峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的維生素K₁標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的維生素K₁濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程y＝0.112x-0.00488，相關(guān)系數(shù)r＝0.9992，如圖2，表明本實施例所建方法在預(yù)設(shè)的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；

以線性最低點濃度(0.1ng/mL)作為最低定量限(LLOQ)，以低于LLOQ兩倍濃度(0.05ng/mL)作為最低檢測限(LLOD)，每個濃度樣品平行分析6次考察所建方法靈敏度，結(jié)果表明，本實施例所建方法LLOD的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為8.15％，LLOQ的RSD為7.58％，表明本實施例所建方法的靈敏度高；

(8)精密度試驗：

按照質(zhì)控樣品處理方法制備低濃度(0.6667ng/mL)、高濃度(2.667ng/mL)質(zhì)控樣品，分別標(biāo)記為QCL、QCH，每個濃度質(zhì)控樣品連續(xù)檢測6次作為日內(nèi)精密度，連續(xù)檢測三天作為日間精密度；結(jié)果：不同濃度質(zhì)控樣品中維生素K₁的日內(nèi)和日間精密度的RSD均小于14.25％，表明本實施例所建方法精密度良好，結(jié)果見表2；

表2維生素K₁的精密度試驗結(jié)果(n＝6,RSD)

(9)穩(wěn)定性試驗：

按照質(zhì)控樣品處理方法制備QCH，置于8℃自動進(jìn)樣器，于0、2、4、8、12、16、24h測定，考察血樣品中維生素K₁存放自動進(jìn)樣器24小時的穩(wěn)定性，在與(2)步驟中相同的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，測定上述不同濃度質(zhì)控樣品，每個濃度質(zhì)控樣品平行制備6份；結(jié)果：不同濃度質(zhì)控樣品中維生素K₁穩(wěn)定性的RSD均小于3.93％，表明血樣品中維生素K₁的穩(wěn)定性良好；

(10)加標(biāo)回收率試驗：

按照加標(biāo)回收率樣品處理方法制備低濃度、高濃度加標(biāo)回收率樣品，分別標(biāo)記為RL、RH，每個濃度樣品平行制備6份，考察本實施例所建方法測定血樣品中維生素K₁的準(zhǔn)確度；結(jié)果：不同濃度加標(biāo)回收率樣品的平均回收率在95.20～99.32％，RSD均小于5.34％，表明本實施例所建方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表3；獲得的加標(biāo)回收率樣品溶液的典型UPLC-MS/MS色譜圖，如圖3所示；

表3維生素K₁加標(biāo)回收率結(jié)果(n＝3)

(11)血清樣品中維生素K₁的測定：

按照血清樣品處理方法制備血樣品，在與(2)步驟中相同的超高效液相色譜質(zhì)譜條件下，精密吸取10μL分別注入超高效液相色譜質(zhì)譜儀，獲得血清樣品色譜圖，如圖4；結(jié)果見表4；

表4血清樣品測定結(jié)果(ng/mL)

上述結(jié)果可以看出，本實施例所構(gòu)建的一種同位素稀釋超液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定維生素K₁的方法，用于血清中維生素K₁的測定中時，簡單快速、準(zhǔn)確度高、專屬性強(qiáng)、精密度高、靈敏度好。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。