本發(fā)明涉及一種油脂摻雜檢測的方法，更具體地說，涉及植物油摻雜檢測的方法。
背景技術：
：食用油是大眾日常飲食中的必需品，近年來相關的摻雜摻假、以次充好等食品安全事件時有發(fā)生，該類事件的惡劣性不僅在于為了經濟利益的食品欺詐，對于兒童還可能存在嚴重的食物過敏問題，食用油品種繁多，特征成分不統(tǒng)一，對其進行摻假鑒別具有一定的挑戰(zhàn)性。生活中，人們往往通過食用油的氣味來判斷其種類。食用油氣味是由濃度極低、種類繁多且結構復雜的各種揮發(fā)性風味物質組成，而這些揮發(fā)性風味物質主要來自原料本身、加工過程產生以及非法添加。感官評價法具有主觀性，且面對各式各樣的摻偽手段，主觀嗅覺根本無法判別真?zhèn)?，必須借助現代儀器分析技術對食用油的風味物質進行客觀、系統(tǒng)的研究與分析。研究多集中在理化檢驗法、光譜法和色譜法，理化檢驗法主要為冷凍法；光譜法通過不同植物油對不同波長的光譜吸光度不同進行快速鑒別；色譜法主要是通過植物油脂肪酸組成來鑒別植物油摻假。現有的各種方法都存在特征指標專一性不強，或者檢測靈敏度不高，或者檢測準確度不高，僅能在一定范圍內適用特定類型的植物油摻假測定。因此業(yè)界急需建立一套快速、高效、通用性好的食用油摻假定性定量檢測方法，以推進食用油行業(yè)健康發(fā)展，維護消費者利益。理論上，要研究建立一個完善的植物油摻假定性定量方法，有兩個關鍵。第一、尋找一種摻假組份的特征標記物，該標記物最好只有在摻假組份中存在，在被摻假的植物油和其他植物油中不存在，或者含量差距非常明顯；第二、該標記物在摻假組份中含量相對穩(wěn)定，不同來源，不同加工工藝對其含量影響不大。技術實現要素：本發(fā)明的目的在于提供一種頂空氣相色譜質譜聯用定性定量測定植物油摻假的方法，解決上述存在的問題，其特征在于，包括以下步驟：S1收集單一品種合格植物油；S2使用頂空氣相色譜質譜聯用法采集樣品信息；S3用數據分析軟件對采集的數據進行分析，獲得各品種植物油的化合物信息；S4使用化學計量學軟件，找出每一種植物油的標記化合物；S5通過方法學驗證確定植物油摻假測定的定性定量標記物；S6通過確定的標記物對樣品進行定性定量測定；其中S1所述的單一品種合格植物油，優(yōu)選為各種品牌的花生油，玉米油，芝麻油，大豆油，棕櫚油、菜籽油、棉籽油，每一品種一般為5-10個不同品牌，最少不低于3個；S2所述的頂空氣相色譜質譜聯用法，所用儀器為氣相色譜質譜聯用儀帶頂空進樣器，儀器條件如下：a.頂空進樣條件：樣品量：0.05-10g，進樣加熱箱溫度：80-280℃，樣品加熱同時振搖頻率：100-700rpm，平衡時間：600-3000S，進樣量：50-2500μL；b.色譜條件：色譜柱：毛細管柱，程序升溫，進樣口溫度：200-300℃，進樣模式：分流或不分流進樣，載氣：高純氦氣，恒流流速：0.5-3.0mL/min；c.質譜條件：傳輸線溫度：200-300℃，電離模式：EI源，數據采集方式：全掃描，質量掃描范圍：20～1000amu，溶劑延遲時間：1-10min；S3所述的數據分析軟件為AMDIS自動質譜解卷積和鑒定軟件（美國國家標準與技術研究院）、安捷倫Masshunter定性及定量分析軟件，所述的AMDIS自動質譜解卷積和鑒定軟件使用方法為利用NIST自動質譜解卷積和鑒定軟件（AMDIS）結合自帶譜庫（NISTFF香料香精庫），在SIMPLE模式處理所得GC-MS數據文件，解卷積參數峰寬（Componentwidth）設置為15，相鄰峰差減（Adjacentpeaksubtraction）設置為one，分辨率（Resolution）、靈敏度（Sensitivity）和峰形要求（Shaperequirements）均設置為medium，保留匹配因子（matchfactor）大于70的組分；S4所述的化學計量學軟件為MassProfilerProfessional差異化分析軟件（美國安捷倫公司），方法為：分別采用按標志篩選，頻率篩選，樣品差異篩選、單因素方差分析，逐級篩選不同類型植物油的最具特征性標志化合物，通過逐級篩查，化合物數量降低，繼續(xù)使用PCA（主成分分析）和PLS-DA（最小二乘法分析）方法前對數據作降維處理，建立分類預測模型，對分類模型訓練和模型驗證準確率均達到100%后，在構建的植物油分類預測模型中鑒定出每種植物油相關的主要標志化合物，每一種植物油包含多個標記化合物；S5所述通過方法學驗證確定植物油摻假測定的定性定量標記物，包括以下步驟：S51將被摻假植物油與摻假植物油進行不同比例混合，混合比例為0%、1%、5%、10%、20%、50%、70%、90%、100%，具體比例可根據實際情況進行調整，以混合比例為橫坐標，以所選取的特征標記物峰面積為縱坐標，制作標準曲線，將待測樣品的峰面積帶入標準曲線進行計算，得到摻假植物油在被摻假植物油中的摻假比例；S52將多種植物油油按一定比例混合在一起，驗證特征標記物的定量準確性和抗干擾能力；S53選取不同混合比例的模擬摻假植物油，分別重復測定，計算變異系數，驗證方法的精密度；S54將單一品種不同品牌的被摻假的合格植物油重復測定20次，計算特征標記物空白值的標準偏差，按公式三倍空白值的標準偏差除以標準曲線斜率得出檢出限；S55按上述步驟每種植物油確定2-4個特征標記物，選取其中1個響應強度高、線性好、變異系數小、抗干擾能力強的特征標記物作定量用，其他的作為定性用，也可以只使用一個特征標記物同時做定性定量用；S6所述通過確定的標記物對樣品進行定性定量測定的采集方式為選擇離子掃描，以S51所述的標準曲線進行定性定量分析。進一步，S2所述的頂空氣相色譜質譜聯用法，所用儀器為6890/5975氣相色譜質譜聯用儀（美國安捷倫公司）帶COMBIPAL型全自動三位一體進樣器，儀器條件如下：a.頂空進樣條件：樣品量：0.5g，進樣加熱箱溫度：180℃，樣品加熱同時振搖頻率：500rpm，平衡時間：2700S，進樣量：500μL，b.色譜條件：色譜柱：HP-5MS毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm），升溫程序:初始溫度40℃，保持3min，以5℃/min升溫至120℃，再以10℃/min升溫至300℃，進樣口溫度260℃，進樣模式：脈沖不分流進樣，脈沖壓力15psi，持續(xù)1min，載氣：高純氦氣，恒流流速：1.0mL/min；c.質譜條件：傳輸線溫度：280℃，電離模式：EI源，數據采集方式：全掃描，質量掃描范圍：20～400amu，溶劑延遲時間：3min。進一步，S2所述的頂空氣相色譜質譜聯用法，所用儀器為6890/5975氣相色譜質譜聯用儀（美國安捷倫公司）帶COMBIPAL型全自動三位一體進樣器，儀器條件如下：a.頂空進樣條件：樣品量：0.5g，進樣加熱箱溫度：180℃，樣品加熱同時振搖頻率：500rpm，平衡時間：3000S，進樣量：1000μL；b.色譜條件：色譜柱：HP-88毛細管柱（100m×0.25mm×0.20μm），升溫程序:初始溫度40℃，保持5min，以5℃/min升溫至245℃，保持5min，進樣口溫度250℃，進樣模式：脈沖不分流進樣，脈沖壓力15psi，持續(xù)1min，載氣：高純氦氣，恒流流速：1.0mL/min；c.質譜條件：傳輸線溫度：250℃，電離模式：EI源，數據采集方式：全掃描，質量掃描范圍：20～400amu，溶劑延遲時間：8.3min。進一步，所采用的儀器為頂空氣相色譜配FID檢測器。進一步，S6所述通過確定的標記物對樣品進行定性定量測定，以2,3-辛二酮為特征標記物，以99.1為定量離子，定性定量測定花生油中摻假大豆油，將大豆油與花生油進行不同比例混合，混合比例為0%、1%、5%、10%、20%、50%、70%、90%、100%，以混合比例為橫坐標，以所選取的特征標記物峰面積為縱坐標，制作標準曲線，將待測樣品的峰面積帶入標準曲線進行計算，得到大豆油在花生油中的摻假比例，線性方程為y=2774.6x+43467，相關系數R2>0.99，在玉米油、菜籽油、棕櫚油、棉籽油存在的多元體系下，回收率在72.2-105.3%，精密度在13%以內，檢出限為3.8%。本發(fā)明的有益效果在于：通過靜態(tài)頂空高溫加熱，使植物油尤其是精煉后的植物油產生豐富的揮發(fā)性物質，通過氣相色譜質譜全掃描采集到全面的化合物信息，通過化學計量學方法找出標志物，通過方法學方法確定定性定量標志物。本發(fā)明確定的植物油摻假定性定量測定方法具有操作簡單方便、快速、準確、無需化學試劑、綠色環(huán)保、省時省力等優(yōu)點，且所需儀器設備少、成本低、效率高，克服了傳統(tǒng)方法操作復雜繁瑣、費用昂貴且定性定量不準等缺點，不僅僅適用于植物油摻假的檢測，也可以非常方便地應用于各種不同樣品中摻假得快速測定，在食品安全監(jiān)測方面具有很大的推廣應用價值。附圖說明圖1三維主成份分析得分圖；圖2PCA載荷圖；圖3MPP化合物查看器查看甲基吡嗪94.0@5.650775在不同植物油中的分布圖；圖4化學工作站提取特征離子查看甲基吡嗪94.0@5.650775在不同品種植物油中的分布圖；圖5偏最小二乘判別分析（PLS-DA）3D圖；圖6花生油中摻入大豆油比例線性方程。具體實施方式下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。1.儀器、試劑與材料6890/5975氣相色譜質譜聯用儀（美國安捷倫公司）；COMBIPAL型全自動三位一體進樣器(美國安捷倫公司)；20mL頂空瓶（美國安捷倫公司）；AMDIS自動質譜解卷積和鑒定軟件（美國國家標準與技術研究院）；MassProfilerProfessional差異化分析軟件（美國安捷倫公司）。從市場或者生產廠家收集食用植物油樣品54個，包括大豆油（Soybeanoil）13個，花生油（Peanutoil）9個，芝麻油（Sesameoil）10個，菜籽油（Colzaoil）5個，棕櫚油（Palmoil）5個，棉籽油（Cottonseedoil）6個，玉米油（Maizeoil）6個（見表1）。表1植物油樣品數量統(tǒng)計Table1quantitystatisticsofVegetableoilsamples種類英文名稱樣品總數模型訓練數模型驗證數菜籽油Colzaoil541大豆油Soybeanoil1394花生油Peanutoil963棉籽油Cottonseedoil651玉米油Maizeoil651芝麻油Sesameoil1082棕櫚油Palmoil541合計5441132實驗方法2.1頂空進樣條件樣品量：0.5g；進樣加熱箱溫度：180℃，樣品加熱同時振搖頻率：500rpm，平衡時間：2700S，進樣量：500μL。2.2色譜條件色譜柱：HP-5MS毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。升溫程序:初始溫度40℃，保持3min，以5℃/min升溫至120℃，再以10℃/min升溫至300℃；進樣口溫度260℃，進樣模式：脈沖不分流進樣，脈沖壓力15psi，持續(xù)1min；載氣：高純氦氣，恒流流速：1.0mL/min。2.3質譜條件傳輸線溫度：280℃；電離模式：EI源；數據采集方式：全掃描，質量掃描范圍：20～400amu，溶劑延遲時間：1min。2.4數據分析條件利用NIST自動質譜解卷積和鑒定軟件（AMDIS）結合自帶譜庫（NISTFF香料香精庫），在SIMPLE模式處理所得GC-MS數據文件，解卷積參數峰寬（Componentwidth）設置為15，相鄰峰差減（Adjacentpeaksubtraction）設置為one，分辨率（Resolution）、靈敏度（Sensitivity）和峰形要求（Shaperequirements）均設置為medium，保留匹配因子（matchfactor）大于70的組分。結果與討論3.1數據采集優(yōu)化由于事先不知各種植物油的特征化合物，因此采用全掃描模式進行非靶向分析，盡可能獲得豐富的化合物信息，為進行下一步的差異化分析打好基礎。頂空進樣加熱箱溫度優(yōu)化，分別進行了60℃，80℃，100℃，120℃，140℃，160℃，180℃實驗，結果表明180℃得到的化合物最豐富，尤其一級植物油（一級大豆油、一級玉米油和一級菜籽油）在生產過程中進行了脫臭處理，如果溫度較低揮發(fā)性成分極少，隨著加熱溫度增加，植物油成份在高溫下氧化分解，重新生成揮發(fā)性風味物質，主要為醛、酮、醇、酚、酯、烴類物質。但是考慮到儀器的耐受性和安全性，所以選擇180℃作為頂空進樣加熱箱溫度。進樣口模式脈沖不分流，如果采用不分流模式，得到的色譜峰（尤其是3分鐘之前的峰）較寬，采用脈沖不分流模式，在進樣時，通過增加進樣口壓力，讓進入的頂空氣體快速進入色譜柱，避免了流失的同時生成的色譜峰也較尖銳。數據處理應用AMDIS技術可以有效解決GC-MS分析時基質效應和共洗脫對植物油中揮發(fā)性化合物的干擾。將AMDIS軟件創(chuàng)建的FIN（已鑒定化合物）和ELU（未鑒定化合物）文件，導入MassProfilerProfessional(MPP)軟件對數據進行分析。MPP共得到2486個化合物（強度閾值為5000）。分別采用按標志篩選，頻率篩選，樣品差異篩選、單因素方差分析，逐級篩選不同類型植物油的最具特征性標志化合物，通過逐級篩查，化合物數量降到63個，繼續(xù)使用PCA（主成分分析）和PLS-DA（最小二乘法分析）方法前對數據作降維處理。通過對數據進行降維，消除了眾多信息中重復的部分，保留了數據中具有判別能力的化合物。主成份分析主成份分析（PCA）是一種非監(jiān)督方法，可以用于發(fā)現樣品間的差異。利用MPP軟件對各種植物油質譜數據進行主成份分析，主成份分析3維得分圖如圖1顯示，41個訓練用植物油，明顯分為兩大類，芝麻油的在X軸上與其他植物油明顯分開，有一個很高的正得分。在2維主成份分析圖上，主成份1（PC1）可以闡明數據58.03%（圖2）的差異性，專屬于芝麻油的組分位于主成份1的正載荷位置。根據主成份1中化合物的得分情況，可以鑒定出區(qū)分芝麻油的主要標志成份（表2），不同成份的相對峰強度也表征了該組樣品的特征。以化合物94.0@5.650775為例，查看確認其是否具有特征性，一種方式為通過MPP化合物查看器查看，化合物94.0@5.650775在不同植物油中的分布見圖3；另一種方式為通過化學工作站，提取特征離子方式查看，見圖4。無論是MPP化合物查看器查看還是化學工作站提取特征離子，都能看出該化合物具有很強的特征性，可以作為芝麻油的標記物，經NIST譜庫檢索該化合物為甲基吡嗪。表2通過PCA分析得到的芝麻油的主要標志成份Table2ThemainingredientsofSesameoilbyPCAanalysisCompoundComponent1Component2Component3Component4MassRetentionTime94.0@5.6507750.96976790.1910080.0125650.142868945.65077580.0@3.29472280.96976790.1910080.0125650.142868803.294723122.0@12.1711830.96976790.1910080.0125650.14286812212.17118122.0@11.5518560.969767870.1910070.0125650.14286812211.5518660.0@0.88189040.969767870.1910070.0125650.142868600.8818984.0@2.16710880.969767870.1910070.0125650.142868842.16710999.0@5.4819370.969767870.1910080.0125650.142868995.48193796.0@2.76893690.969767870.1910080.0125650.142868962.768937109.0@14.3523310.969767870.1910080.0125650.14286810914.35233121.0@11.4596650.96976780.1910070.0125650.14286812111.4596794.0@3.5556350.96008850.25673-0.003070.089225943.5556353.4偏最小二乘判別分析（PLS-DA）從圖1可以看出，除芝麻油外，其他植物油沒有在無監(jiān)督的主成份分析上得到很好區(qū)分。必須使用有監(jiān)督的方法進行分析，來發(fā)現樣品間的差異。PLS-DA是一種成熟的基于回歸的方法，特別適用于包含的樣品數少于被測變量的情況。它常用于加大觀測組之間的區(qū)別，最大程度區(qū)分不同的類別。使用41個訓練樣品建立PLS-DA類別分析模型，使用13個預測樣品進行模型驗證，從PLS-DA法三維圖（圖5）中可以看出七種植物油可以有效的分開，對分類模型訓練和模型驗證準確率均為100%，結果見表3，表明了創(chuàng)建的模型用于區(qū)分辨別預測植物油類別是可行的。同時，在構建的植物油分類預測模型中鑒定出每種植物油相關的主要標志化合物，見表4。表3植物油分類模型訓練和驗證結果Table3Classificationmodeltrainingandvalidationresultsofvegetableoils　菜籽油大豆油花生油棉籽油玉米油芝麻油棕櫚油準確度（%）模型訓練　　　　　　　菜籽油4000000100大豆油0900000100花生油0060000100棉籽油0005000100玉米油0000500100芝麻油0000080100棕櫚油0000004100模型驗證菜籽油1000000100大豆油0400000100花生油0030000100棉籽油0001000100玉米油0000100100芝麻油0000020100棕櫚油0000001100表4構建的植物油分類預測模型中鑒定出的主要標志化合物Table4themainmarkerofcompoundswereidentificatedinthevegetableoilclassificationpredictionmodel標志化合物菜籽油大豆油花生油棉籽油玉米油芝麻油棕櫚油14-戊烯-1-醇正己酸乙烯酯2,4-二甲基環(huán)己醇糠醛(反式)-4-壬烯醛芝麻酚巴豆醛2醋酸乙烯酯己酸反1,2-環(huán)戊二醇庚烷1-戊烯-3-醇2,6-二甲基吡嗪1-辛烯32-甲基-1,3-丁二烯1,1-二甲基環(huán)丙烷戊醛3-甲基-1-丁烯(E,E)-2,4-庚二烯醛2-乙基-6-甲基吡嗪2-十一烯醛4甲酸乙烯酯戊基環(huán)丙烷4-乙基環(huán)己醇異美汀2,4-二甲基環(huán)己醇4-甲基噻唑1-庚烯5反式-2-癸烯醛4-乙基環(huán)己醇正己醛乙酰胺正己醛5-甲基呋喃醛正己酸乙烯酯6反,反-2,4-庚二烯醛順式-4-庚烯醛2,4-二甲基環(huán)己醇甲酸巴豆醛2-乙基吡嗪環(huán)丙烷7正丁基環(huán)戊烷1,4-二羥基-2-丁烯2-十一烯醛對苯二酚甲酸甲酯愈創(chuàng)木酚1-十六烷醇81,3-戊二烯2,4-二甲基環(huán)己醇硝基環(huán)己烷羥基脲4-乙基環(huán)己醇2-甲氧基乙酸乙稀酯9二甲基環(huán)己醇丁烯酮丁烯酮2,3-辛二酮順式-3-己烯醇苯甲酸酯3-乙基-2,5-甲基吡嗪己酸102-丁酮巴豆醛CIS-4-庚烯醇4-乙基環(huán)己醇丁烯酮二甲二硫醚3-蒈烯112-十一碳烯醛正戊烷正己醛甲醛正丁基環(huán)戊烷甲酰肼1,4-丁炔二醇12長葉烯2-丁烯醛1-丁醇(反式)-4-壬烯醛2-庚酮2,5-二甲基吡嗪反式-2-癸烯醛13N-丁基苯磺酰胺丙酸　丁酰胺酸(Z)-4-庚醛噻吩正丁醇化學計量學方法為建立植物油類別分析提供了強有力的手段，實驗證明根據植物油揮發(fā)性物質對不同種類的植物油進行分類和判別是可行的，從而對控制提高植物油產品質量，植物油摻假鑒別奠定了科學基礎。3.5基于特征標記物摻假比例的定性定量測定3.5.1將被摻假植物油與摻假植物油進行不同比例混合，混合比例為0%、1%、5%、10%、20%、50%、70%、90%、100%，具體比例可根據實際情況進行調整，以混合比例為橫坐標，以所選取的特征標記物峰面積為縱坐標，制作標準曲線，將待測樣品的峰面積帶入標準曲線進行計算，得到摻假植物油在被摻假植物油中的摻假比例；3.5.2將多種植物油油按一定比例混合在一起，驗證特征標記物的定量準確性和抗干擾能力；3.5.3選取5%、10%、20%混合比例的模擬摻假植物油，分別重復測定6次，計算變異系數，驗證方法的精密度；3.5.4將單一品種不同品牌的被摻假的合格植物油重復測定20次，計算特征標記物空白值的標準偏差，按公式三倍空白值的標準偏差除以標準曲線斜率得出檢出限；3.5.5按上述步驟每種植物油確定2-4個特征標記物，選取其中1個響應強度高、線性好、變異系數小、抗干擾能力強的特征標記物作定量用，其他的作為定性用，也可以只使用一個特征標記物同時做定性定量用。具體實施例：花生油中摻假大豆油的定性定量測定花生油風味獨特、營養(yǎng)豐富，是中國百姓理想的烹飪用油。近年來，由于花生油價格不斷升高，一些不法商販為了牟取暴利，在花生油經營、銷售過程中摻入價格低廉的油脂，如大豆油等油脂。本試驗擬采用頂空氣相色譜質譜法對花生油中摻入的大豆油進行定性定量測定，旨為食用油質量安全控制提供一種準確快速的檢測方法。儀器為6890/5975氣相色譜質譜聯用儀（美國安捷倫公司）帶COMBIPAL型全自動三位一體進樣器，儀器條件如下：a.頂空進樣條件：樣品量：0.5g；進樣加熱箱溫度：180℃，樣品加熱同時振搖頻率：500rpm，平衡時間：3000S，進樣量：1000μL。b.色譜條件：色譜柱：HP-88毛細管柱（100m×0.25mm×0.20μm）。升溫程序:初始溫度40℃，保持5min，以5℃/min升溫至245℃，保持5min；進樣口溫度250℃，進樣模式：脈沖不分流進樣，脈沖壓力15psi，持續(xù)1min；載氣：高純氦氣，恒流流速：1.0mL/min。c.質譜條件：傳輸線溫度：250℃；電離模式：EI源；數據采集方式：全掃描，質量掃描范圍：20～400amu，溶劑延遲時間：8.3min。通過計量學和方法學方法確定特征標記物，本實驗以2,3-辛二酮為特征標記物，以99.1為定量離子，定性定量測定花生油中摻假大豆油。將大豆油與花生油進行不同比例混合，混合比例為0%、1%、5%、10%、20%、50%、70%、90%、100%，以混合比例為橫坐標，以所選取的特征標記物峰面積為縱坐標，制作標準曲線，將待測樣品的峰面積帶入標準曲線進行計算，得到大豆油在花生油中的摻假比例，線性方程為y=2774.6x+43467，相關系數R2=0.9944，見圖6，在玉米油、菜籽油、棕櫚油、棉籽油存在的多元體系下，回收率在72.2-105.3%，精密度在13%以內，檢出限為3.8%。以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，如改變頂空、氣相及質譜條件，改變稱樣量，改變標準曲線范圍，改變特征標記物，改變摻假、被摻假及干擾植物油品種等，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3