本發(fā)明涉及醫(yī)學檢驗
技術領域：
，尤其涉及一種糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法及其質(zhì)控品。
背景技術：
：目前臨床上測定糖化血紅蛋白(HbA1c)含量的方法按照理化性質(zhì)不同，可分為兩大類：一類是基于糖化與非糖化血紅蛋白所帶電荷不同，如離子交換色譜法、電泳法；另一類是基于糖化與非糖化血紅蛋白的結(jié)構(gòu)不同，如免疫法、親和層析法及酶法等。采用不同測定方法或者同一測定方法而選用不同廠家生產(chǎn)的試劑，進行檢測前，需要用質(zhì)控品進行質(zhì)量控制或校準品進行校準。目前，自制新鮮冰凍全血是HbA1c檢測的良好質(zhì)控物或校準品。然而，正常人的HbA1c的濃度在5％～6％之間，不同濃度值的獲得具有隨機性，且不可控，不利于產(chǎn)業(yè)化；其中HbA1c濃度值為3％～5％的臨床紅細胞樣本很稀有，不易獲得。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的在于提供一種糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法，旨在提供一種批量生產(chǎn)HbA1c值為3～5％的糖化血紅蛋白質(zhì)控品的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法，其包括以下步驟：采集非糖尿病患者的血液樣本，進行離心、去漿處理，得到紅細胞；向所述紅細胞中加入紅細胞保存液，制得紅細胞樣本；配制密度不同的細胞分離液，根據(jù)密度由大到小，將細胞分離液依次加入至一離心管內(nèi)，得到分層液；將所述紅細胞樣本緩慢加入到分層液，離心得到分層的紅細胞，每一密度的細胞分離液中均分散有與其適配的紅細胞；將所述分層的的紅細胞分裝于不同的試管內(nèi)，向每一試管內(nèi)加入生理鹽水，得到紅細胞懸浮液，調(diào)節(jié)所述紅細胞懸浮液的血紅蛋白濃度為120g/L，篩選出HbA1c值為3～5％的紅細胞懸浮液，獲得糖化血紅蛋白質(zhì)控品。優(yōu)選地，篩選出HbA1c值為3～5％的紅細胞懸浮液后，所述糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法還包括：向HbA1c值為3～5％的紅細胞懸浮液添加緩沖液，進行溶血處理，獲得HbA1c值為3～5％的溶液和分散于所述溶液的紅細胞膜；離心，去除紅細胞膜；向HbA1c值為3～5％的溶液加入凍干保護劑或穩(wěn)定劑中的至少一種、并進行凍干或液體冰凍保存處理，獲得所述糖化血紅蛋白質(zhì)控品。優(yōu)選地，所述緩沖液中添加有表面活性劑。優(yōu)選地，所述細胞分離液的密度范圍為1.085～1.127g/mL。優(yōu)選地，所述血液樣本的血紅蛋白濃度為120～160g/L，單位體積內(nèi)紅細胞的個數(shù)為4×1012～5.5×1012個/L，HbA1c的濃度為4～6％。優(yōu)選地，得到細胞混合物后，向所述細胞混合物中加入紅細胞保存液前，還包括對所述細胞混合物進行洗滌處理的步驟，所述洗滌處理為：向所述細胞混合物中加入2～8℃的磷酸鹽緩沖液，離心2～5次，并去除上清液及白膜層。優(yōu)選地，所述紅細胞保存液的紅細胞的容積比與所述細胞混合物中的紅細胞的容積比相等。優(yōu)選地，所述將所述紅細胞樣本緩慢加入到分層液，離心得到分層的紅細胞，每一密度的細胞分離液中均分散有與其適配的紅細胞的步驟中，離心溫度為0～20℃，離心力為1500～4000g。優(yōu)選地，在將所述分層的紅細胞分裝于不同的試管內(nèi)之后，向每一試管內(nèi)加入生理鹽水之前，還包括用磷酸鹽緩沖液洗滌所述紅細胞，并去除上清液的步驟。本發(fā)明還提出一種由所述的糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法所制得的質(zhì)控品。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明技術方案采集非糖尿病患者的正常人的血液，最終獲得的糖化血紅蛋白質(zhì)控品來自健康紅細胞，消除了基質(zhì)效應問題，提高采用該糖化血紅蛋白質(zhì)控品的分析儀器的測量準確性，同時也擴大了原料的來源；在紅細胞中加入紅細胞保存液，模擬血液的環(huán)境，從而維持紅細胞的生理活性。本發(fā)明采用非連續(xù)密度梯度離心法獲得不同HbA1c值的糖化血紅蛋白質(zhì)控品，方法簡便，便于進行工業(yè)化生產(chǎn)。此外，制得的糖化血紅蛋白質(zhì)控品呈液態(tài)，能夠消除瓶間差，提高采用該質(zhì)控品的分析儀器的測量精度。具體實施方式下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。另外，各個實施例之間的技術方案可以相互結(jié)合，但是必須是以本領域普通技術人員能夠?qū)崿F(xiàn)為基礎，當技術方案的結(jié)合出現(xiàn)相互矛盾或無法實現(xiàn)時應當認為這種技術方案的結(jié)合不存在，也不在本發(fā)明要求的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明提供一種糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法，其包括以下步驟：采集非糖尿病患者的血液樣本，進行離心、去漿處理，得到紅細胞；向所述紅細胞中加入紅細胞保存液，制得紅細胞樣本；配制密度不同的細胞分離液，根據(jù)密度由大到小，將細胞分離液依次加入至一離心管內(nèi)，得到分層液；將所述紅細胞樣本緩慢加入到分層液的表層，離心得到分層的紅細胞，每一密度的細胞分離液中均分散有與其適配的紅細胞；將所述分層的的紅細胞分裝于不同的試管內(nèi)，向每一試管內(nèi)加入生理鹽水，得到紅細胞懸浮液，調(diào)節(jié)所述紅細胞懸浮液的血紅蛋白濃度為120g/L，篩選出HbA1c值為3～5％的紅細胞懸浮液，獲得糖化血紅蛋白質(zhì)控品。本發(fā)明采用非連續(xù)密度梯度離心法將正常人的健康新鮮全血紅細胞樣本離心分離為2～6個不同密度層次，從而篩選出不同日齡的紅細胞。而糖化血紅蛋白(HbA1c)的百分比濃度和紅細胞的壽命有關，紅細胞的壽命越長，HbA1c的百分比濃度越大，反之濃度越小。據(jù)此可以得到不同HbA1c值的糖化血紅蛋白質(zhì)控品。優(yōu)選地，紅細胞保存液為含枸櫞酸鈉、枸櫞酸、葡萄糖、腺嘌呤與磷酸二氫鈉混合制成的滅菌水溶液。本發(fā)明技術方案對采集到的正常人的健康血液樣本進行離心處理，將血漿和細胞分離，去除血漿后得到細胞混合物；在細胞混合物中加入紅細胞保存液，模擬血液的環(huán)境，從而維持紅細胞的生理活性；制備具有不同密度梯度的細胞分離液的分層液，將紅細胞樣本緩慢加入到分層液中，優(yōu)選地，紅細胞樣本位于分層液的表層；離心后使得具有不同糖化血紅蛋白濃度的紅細胞分層，而后將其分裝，加入生理鹽水，調(diào)節(jié)血紅蛋白濃度為120g/L，即正常人血液中血紅蛋白的濃度，而后用日本愛科萊公司HA-8180全自動糖化血紅蛋白分析儀進行檢測，篩選得到HbA1c值為3～5％的紅細胞懸浮液。本發(fā)明采用非連續(xù)密度梯度離心法獲得不同HbA1c值的糖化血紅蛋白質(zhì)控品，方法簡便，便于進行工業(yè)化生產(chǎn)。此外，制得的糖化血紅蛋白質(zhì)控品呈液態(tài)，能夠消除瓶間差，提高采用該質(zhì)控品的分析儀器的測量精度。篩選出HbA1c值為3～5％的紅細胞懸浮液后，所述糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法還包括：向HbA1c值為3～5％的紅細胞懸浮液添加緩沖液，進行溶血處理，獲得HbA1c值為3～5％的溶液和分散于所述溶液的紅細胞膜；離心，去除紅細胞膜；向HbA1c值為3～5％的溶液加入凍干保護劑或穩(wěn)定劑中的至少一種、并進行凍干或液體冰凍保存處理，獲得所述糖化血紅蛋白質(zhì)控品。優(yōu)選地，凍干保護劑或穩(wěn)定劑為海藻糖、蔗糖、酪蛋白或動物血清白蛋白。本發(fā)明技術方案對紅細胞懸浮液添加緩沖液進行溶血處理、加入凍干保護劑或穩(wěn)定劑并進行凍干或液體冰凍保存，相較于紅細胞懸浮液在2～8℃條件下僅能保存7天，有效延長液態(tài)糖化血紅蛋白質(zhì)控物或凍干復溶后的糖化血紅蛋白質(zhì)控物保存時間，方便用戶使用。所述緩沖液中添加有表面活性劑。優(yōu)選地，所述表面活性劑為TritonX-100(曲拉通X-100)、Tween-20(聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯)。本發(fā)明技術方案的緩沖液中添加有表面活性劑，表面活性劑吸附于紅細胞膜表面并插入到紅細胞膜中，引起紅細胞膜上的物質(zhì)重排，進而導致紅細胞膜破裂，有效提高溶血處理的效率。所述細胞分離液的密度范圍為1.085～1.127g/mL。優(yōu)選地，細胞分離液的密度可為1.085、1.0893、1.0905、1.092、1.094、1.098、1.127g/mL。分層液由至少兩種不同密度的細胞分離液組成，優(yōu)選地，分層液包括2、3、4、5、6層細胞分離液。本發(fā)明技術方案的細胞分離液具有與血液中紅細胞相同的密度范圍，使得不同密度的紅細胞在相應密度的細胞分離液中處于漂浮狀態(tài)，便于不同密度紅細胞的分層。所述血液樣本的血紅蛋白濃度為120～160g/L，單位體積內(nèi)紅細胞的個數(shù)為4×1012～5.5×1012個/L，HbA1c的濃度為4～6％。本發(fā)明技術方案采集非糖尿病患者的正常人的血液，最終獲得的糖化血紅蛋白質(zhì)控品來自健康紅細胞，消除了基質(zhì)效應問題，提高采用該糖化血紅蛋白質(zhì)控品的分析儀器的測量準確性，同時也擴大了原料的來源。得到細胞混合物后，向所述細胞混合物中加入紅細胞保存液前，還包括對所述細胞混合物進行洗滌處理的步驟，所述洗滌處理為：向所述細胞混合物中加入2～8℃的磷酸鹽緩沖液，離心2～5次，并去除上清液及白膜層。本發(fā)明技術方案在向所述細胞混合物中加入紅細胞保存液前，用磷酸鹽緩沖液洗滌該細胞混合物，有效去除細胞上附著的雜質(zhì)。其中磷酸鹽緩沖液的溫度為2～8℃，保證細胞處于活性狀態(tài)。所述紅細胞保存液的紅細胞的容積比與所述細胞混合物中的紅細胞的容積比相等。本發(fā)明技術方案紅細胞保存液的紅細胞的容積比與所述細胞混合物相等，模擬血液環(huán)境，從而維持紅細胞的生理活性。所述將所述紅細胞樣本緩慢加入到分層液，離心得到分層的紅細胞，每一密度的細胞分離液中均分散有與其適配的紅細胞的步驟中，離心的溫度為0～20℃，離心力為1500～4000g。本發(fā)明技術方案對添加有紅細胞的細胞分離液，置于低溫離心機進行離心處理，維持紅細胞的穩(wěn)定狀態(tài)，同時使得不同日齡的紅細胞分層。離心力大于1500g，有效提高離心分離速率，小于4000g，防止離心力過大，導致紅細胞破損。離心的溫度為0～20℃，離心力為1500～4000g，各分層層次分明，層與層之間離散的細胞數(shù)較少，分離效果較好。在將所述分層的紅細胞分裝于不同的試管內(nèi)之后，向每一試管內(nèi)加入生理鹽水之前，還包括用磷酸鹽緩沖液洗滌所述紅細胞，并去除上清液的步驟。本發(fā)明技術方案在將紅細胞分層并分裝后，用磷酸鹽緩沖液洗滌，去除紅細胞表面附著的雜質(zhì)。本發(fā)明還提出一種由所述的糖化血紅蛋白質(zhì)控品的制備方法所制得的質(zhì)控品。實施例一收集正常人的健康血液樣本，其中：血紅蛋白濃度為120g/L，單位體積紅細胞的個數(shù)為4×1012個/L，HbA1c：5～6％；將血液樣本先于離心機中以2000r/min離心5min，去漿，再加入4℃的PBS洗滌2次，轉(zhuǎn)速也為2000r/min。用吸管小心吸棄上清液及白膜層后，得到紅細胞。在紅細胞中加入等紅細胞容積比的紅細胞保存液，充分混勻后得到紅細胞樣本，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。設置4個Percoll細胞分離液密度梯度，依次為1.120、1.1193、1.1180、1.117g/mL，分別盛裝于4個離心管內(nèi)，分別取4份400μL上述紅細胞樣本沿離心管壁緩慢疊加于Percoll細胞分離液的最上層，設置離心機溫度為4℃、離心力為3500g，離心20min，得到分為2層的紅細胞。將離心管內(nèi)的不同層次的紅細胞用吸管精細吸取，分別裝于已編號的2根試管內(nèi)，每管加入4℃的磷酸鹽緩沖液于離心機中，以1000r/min，離心5min，洗滌2次。而后，去上清液，向各試管內(nèi)各加入生理鹽水，得到紅細胞懸浮液，測血紅蛋白濃度，調(diào)節(jié)最終濃度為120g/L。用日本愛科萊公司HA-8180全自動糖化血紅蛋白分析儀檢測HbA1c值，選取最上層的紅細胞作為樣本，將Percoll細胞分離液密度的密度為1.120、1.1193、1.1180、1.117g/mL分別處理得到低HbA1c值樣本編號為1、2、3、4組，其中未經(jīng)處理的原始血液樣本為0號。由表1可以看出，Percoll細胞分離液密度的密度為1.117g/mL時，可以分離得到HbA1c值較低的紅細胞。表1不同實驗組別上層紅細胞HA-8180檢測結(jié)果組別HbA1c值和原始值偏倚05.3％——15.3％0％25.3％0％35.2％-0.1％44.8％-0.5％在分層后的紅細胞中添加含有表面活性劑的緩沖液，進行溶血處理，用離心去除雜質(zhì)，加入凍干保護劑/穩(wěn)定劑后，凍干或液體冰凍保存。實施例二收集正常人的健康血液樣本，其中：血紅蛋白濃度為120g/L，單位體積紅細胞的個數(shù)為4×1012個/L，HbA1c：5～6％；將血液樣本先于離心機中以2000r/min離心5min，去漿，再加入2℃的PBS洗滌5次，轉(zhuǎn)速也為2000r/min。用吸管小心吸棄上清液及白膜層后，得到紅細胞。在紅細胞中加入等紅細胞容積比的紅細胞保存液，充分混勻后得到紅細胞樣本，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。Percoll細胞分離原液為一種低滲性介質(zhì)，進行配制時需加入1.5mol/L的NaCl溶液，才能使配制后的Percoll細胞分離液的滲透壓達到紅細胞的所需要的大小(280-320mOsm/kg·H2O)。按照如下公式：V0—未稀釋的Percoll細胞分離液原液的體積，單位為mLV—稀釋后的Percoll細胞分離液的體積，單位為mLρ0—未稀釋的Percoll細胞分離液的密度，為1.130g/mLρ—稀釋后的Percoll細胞分離液的密度ρ10—1.5mol/L的NaCl溶液的密度，為1.058g/mL計算配制不同密度分離液時3種液體(Percoll細胞分離液原液、0.9％生理鹽水、1.5mol/L的NaCl溶液)的配比。用Percoll細胞分離液原液和0.9％的生理鹽水、1.5mol/L的NaCl溶液配制6種不同密度的分離液，密度由低至高分別為1.085、1.0893、1.0905、1.092、1.094、1.098g/mL(依次記為1、2、3、4、5、6，未處理的全血記為0)。將上述分離液按照密度由大到小，依次加入到一離心管中，最后將紅細胞樣本加入到離心管中，此時紅細胞樣本位于分層液的表層。離心條件設置為3500g、10℃，離心20min，紅細胞位于相應密度的細胞分離液中。將離心后離心管內(nèi)的不同層次的紅細胞用吸管精細吸取，分別裝于已編號的6根試管內(nèi)，去上清液，向各管內(nèi)各加入1mL的生理鹽水，制得紅細胞懸浮液，調(diào)節(jié)紅細胞懸浮液的血紅蛋白濃度為120g/L。用日本愛科萊公司HA-8180全自動糖化血紅蛋白分析儀進行檢測，測得該六層紅細胞的HbA1c值，如表2所示，從上到下依次為：3.5％、3.8％、4.2％、4.5％、4.8％、5.3％。說明用此方法可以獲得6個HbA1c水平的產(chǎn)品，其中HbA1c值為3.5％、3.8％、4.2％、4.5％、4.8％的紅細胞懸浮液，是較理想的低糖化血紅蛋白質(zhì)控品。表2不同層紅細胞HA-8180檢測結(jié)果層別HbA1c值和原始值偏倚05.2％——13.5％-1.7％23.8％-1.4％34.2％-1.0％44.5％-0.7％54.8％-0.4％65.3％0.1％將上述HbA1c值為3.5％、3.8％、4.2％、4.5％、4.8％的紅細胞懸浮液放置于冰箱中備用，在2～8℃條件下可保存7天。采用添加有TritonX-100的0.05％的NaCl溶液，對紅細胞懸浮液進行溶血處理，離心去除雜質(zhì)，向離心得到的溶液中加入動物血清白蛋白，進行液體冰凍處理，得到的糖化血紅蛋白質(zhì)控品可保存3個月。實施例三收集正常人的健康血液樣本，其中：血紅蛋白濃度為160g/L，單位體積紅細胞的個數(shù)為5.5×1012個/L，HbA1c：6％；將血液樣本先于離心機中以2000r/min離心5min，去漿，再加入8℃的PBS洗滌5次，轉(zhuǎn)速也為2000r/min。用吸管小心吸棄上清液及白膜層后，得到紅細胞。在紅細胞中加入等紅細胞容積比的紅細胞保存液，充分混勻后得到紅細胞樣本，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ肞ercoll細胞分離液原液和0.9％的生理鹽水、1.5mol/L的NaCl溶液配制6種不同密度的分離液，密度由低至高分別為1.085、1.0893、1.0905、1.092、1.094、1.098g/mL(依次記為1、2、3、4、5、6，未處理的全血記為0)。將上述分離液按照密度由大到小，依次加入到一離心管中，最后將紅細胞樣本加入到離心管中，此時紅細胞樣本位于分層液的表層。離心條件設置為4000g、20℃，離心20min，紅細胞位于相應密度的細胞分離液中。將離心后離心管內(nèi)的不同層次的紅細胞用吸管精細吸取，分別裝于已編號的6根試管內(nèi)，去上清液，向各管內(nèi)各加入1mL的生理鹽水，制得紅細胞懸浮液，調(diào)節(jié)紅細胞懸浮液的血紅蛋白濃度為120g/L。用日本愛科萊公司HA-8180全自動糖化血紅蛋白分析儀進行檢測HbA1c值，篩選出HbA1c值為3～5％的紅細胞懸浮液，在2～8℃條件下保存?zhèn)溆?。以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的
技術領域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。當前第1頁1 2 3