本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種用于富含脂滴組織快速完全透明化的方法，所述的方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)所有器官和組織，包括整個(gè)動(dòng)物身體的完整透明化，從而獲得三維高分辨率結(jié)構(gòu)信息。

背景技術(shù)：

研究生物醫(yī)學(xué)組織在細(xì)胞和亞細(xì)胞尺度的三維空間結(jié)構(gòu)，是理解其正常功能機(jī)制的基礎(chǔ)，也能為掌握器官疾病的發(fā)生和發(fā)展過程提供基礎(chǔ)依據(jù)。以前對(duì)人和其它動(dòng)物組織的研究主要為解剖學(xué)尺度的研究，而在細(xì)胞和亞細(xì)胞尺度的研究則受限于解析能力的限制，通常只能研究組織切片的二維結(jié)構(gòu)信息?；诮M織連續(xù)切片的三維重構(gòu)技術(shù)研究組織則非常耗時(shí)和費(fèi)力。近年來(lái)組織透明化技術(shù)的迅猛發(fā)展使人們獲得完整生物組織和器官的高分辨率三維結(jié)構(gòu)成為可能。斯坦福大學(xué)Deisseroth教授實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的CLARITY技術(shù)最早應(yīng)用于腦組織的透明化和三維結(jié)構(gòu)研究，并逐步拓展到其它主要器官，如腎臟，小腸等，展示了這種技術(shù)在獲取生物組織完整三維高分辨率結(jié)構(gòu)信息方面的巨大潛在價(jià)值。

然而，將CLARITY技術(shù)拓展到所有器官的透明化時(shí)，發(fā)現(xiàn)有些器官即使用表面活性劑進(jìn)行很長(zhǎng)的時(shí)間的處理，也很難被完全的透明化，從而大大限制了三維結(jié)構(gòu)研究所能到達(dá)的組織深度。這些很難被完全透明的組織主要包括脂肪組織，肝臟組織和肌肉組織等。這些組織的一個(gè)共同特點(diǎn)是它們的組織中都富含脂滴。由于這些脂滴的高度疏水性和致密性，CLARITY技術(shù)中用來(lái)去脂的方法很難將其從組織中去除。這些致密的脂滴的折射率通常高于周圍的其它分子，折射率的不匹配會(huì)引起光子的散射增加，從而降低組織的透明度和光學(xué)成像的深度。

因此，本領(lǐng)域迫切需要一種快速、有效的用于富含脂滴組織透明化的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速有效地使富含脂滴組織透明化的處理方法和相應(yīng)的試劑盒。

本發(fā)明的第一方面提供了一種用于富含脂滴組織快速完全透明化的方法，所述的方法包括以下步驟：

(i)提供一水凝膠固定處理后的富含脂滴的組織樣品；

(ii)對(duì)所述的組織樣品進(jìn)行透明化預(yù)處理，得到預(yù)處理樣品；

(iii)對(duì)所述的預(yù)處理樣品進(jìn)行透明化處理，得到透明化樣品；和

(iv)對(duì)所述的透明化樣品進(jìn)行透明化后處理，得到透明化終樣品。

在另一優(yōu)選例中，還包括步驟：

(v)對(duì)所述的透明化終樣品進(jìn)行染色和封片處理，得到測(cè)試樣品。

在另一優(yōu)選例中，所述的富含脂滴的組織包括：肝臟組織、脂肪組織和骨骼肌組織。

在另一優(yōu)選例中，所述的富含脂滴的組織為切片形式。

在另一優(yōu)選例中，所述的富含脂滴的組織為厚度0.5-1mm的切片。

在另一優(yōu)選例中，所述的透明化預(yù)處理為使用表面活性劑溶液清洗所述的富含脂滴的組織樣品。

在另一優(yōu)選例中，所述的表面活性劑選自下組：十二烷基硫酸鈉(SDS)、Triton X-100、或其組合，較佳地，所述的表面活性劑為SDS。

在另一優(yōu)選例中，所述的SDS濃度為4％-8％。

在另一優(yōu)選例中，所述的表面活性劑清洗所述的富含脂滴的組織樣品的時(shí)間為7-11天。

在另一優(yōu)選例中，所述的透明化處理為使用脂肪酶混合液消化所述的預(yù)處理樣品。

在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪酶混合液為含有脂肪酶、膽酸和氯鹽的混合液，其中，所述的膽酸選自下組：牛黃膽酸、?；敲撗跄懰帷⒒蚱浣M合。

在另一優(yōu)選例中，所述的膽酸還包括牛黃膽酸和牛磺脫氧膽酸的鹽，或鹽水合物。

在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪酶混合液中脂肪酶濃度為2000unit/mL-6000unit/mL。

在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪酶混合液中膽酸濃度為3mM-11mM。

在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪酶混合液中包括選自下組的氯鹽：

300-500mM的NaCl，和/或

2-10mM的CaCl₂。

在另一優(yōu)選例中，所述的脂肪酶混合液消化預(yù)處理樣品的時(shí)間為3天-7天。

在另一優(yōu)選例中，所述的透明化后處理為使用表面活性劑溶液清洗所述的透明化樣品。

在另一優(yōu)選例中，使用表面活性劑溶液清洗所述的透明化樣品的時(shí)間為1-3天。

在另一優(yōu)選例中，所述的步驟(i)和(ii)之間，和/或步驟(ii)和(iii)之間，和/或步驟(iii)和(iv)之間，和/或步驟(iv)和(v)之間，還包括使用緩沖液進(jìn)行清洗。

在另一優(yōu)選例中，所述的緩沖液選自下組：PBS緩沖液、PBST緩沖液、硼酸緩沖液、或其組合。

在另一優(yōu)選例中，使用選自下組的組織染液對(duì)所述的透明化終樣品進(jìn)行染色：Hoechst染液、DAPI染液、Tomato-Lectin染液。

本發(fā)明的第二方面提供了一種試劑盒，所述的試劑盒用于富含脂滴組織的透明化，并且，所述的試劑盒包括：

(1)第一容器，以及位于所述容器內(nèi)的第一試劑組合物，所述的第一試劑組合物含有表面活性劑；

(2)第二容器，以及位于所述容器內(nèi)的第二試劑組合物，所述的第二試劑組合物含有膽酸和脂肪酶；

(3)任選的第三容器，以及位于所述容器內(nèi)的第三試劑組合物，所述的第三試劑組合物含有氯鹽溶液、緩沖液，和/或組織染液；

以及(4)任選的使用說(shuō)明書。

本發(fā)明的第三方面提供了一種透明化組織的測(cè)試樣品，包括：

(a)通過如本發(fā)明第一方面所述的方法制備得到的透明化終樣品；

(b)組織染液；

(c)載玻片；

(d)蓋玻片；和

(e)粘合劑。

在另一優(yōu)選例中，所述的粘合劑為藍(lán)丁膠。

在另一優(yōu)選例中，所述的透明化終樣品的脂滴含量≤10％。

在另一優(yōu)選例中，所述的透明化組織的測(cè)試樣品的衰減深度為0.5-1mm。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明的用于富含脂滴組織透明化的方法的基本原理示意圖

11：未透明組織

12：脂滴

21：脂肪酶

22：表面活性劑

31：透明化后的組織

圖2樣品的封裝

圖3(a)實(shí)驗(yàn)組肝片封片

圖3(b)對(duì)照組肝片封片

圖4 4％SDS處理后小鼠肝片(1mm厚)的透明效果

圖5脂肪酶消化液處理后小鼠肝片(1mm厚)的透明效果

圖6不同去脂方式后組織的成像深度比較

圖7熒光信號(hào)隨成像深度增加的衰減比較

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)了一種用于富含脂滴組織的透明化試劑組合以及透明化方法。實(shí)驗(yàn)表明，采用脂肪酶消化高度疏水和致密脂滴，并與表面活性劑(如SDS)結(jié)合使用，可以將高度疏水和致密的脂滴完全從組織中清除出去，從而大幅度減少組織中高度散光的物質(zhì)，并獲得完全透明化的完整組織。所述方法可以大幅增加富含脂滴組織的光學(xué)成像深度，使得完整組織的三維光學(xué)成像和在細(xì)胞和亞細(xì)胞尺度的結(jié)構(gòu)解析成為可能。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

術(shù)語(yǔ)

透明化

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“透明化”是指通過化學(xué)或者物理的方法對(duì)組織樣品進(jìn)行必要的處理，使得不透明的組織轉(zhuǎn)變成完全透明的組織，其核心是減少了光線在組織中傳播時(shí)的散射。透明化后的組織可以用光學(xué)儀器，比如光學(xué)顯微鏡，直接觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

脂滴(lipid droplets)

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脂滴”是重要的能量存儲(chǔ)細(xì)胞器，在大多數(shù)真核生物細(xì)胞中存在，其尺寸分布從非脂肪細(xì)胞中的幾十納米到脂肪細(xì)胞中的100微米不等。脂滴的結(jié)構(gòu)由兩部分組成，包括一個(gè)極度疏水和致密的內(nèi)核，內(nèi)核外面由單層磷脂膜包裹。疏水內(nèi)核的主要化學(xué)成分是甘油三脂(triacylglycerol)和甾醇酯(sterol ester)。

脂肪酶(lipase)

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脂肪酶”也叫甘油脂水解酶，是一類具有催化脂肪分解反應(yīng)的酶，能夠催化甘油三脂的水解反應(yīng)，將甘油三脂分解成甘油和脂肪酸。

衰減深度

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“衰減深度”定義為熒光信號(hào)衰減到起始信號(hào)的一半時(shí)的深度定義為衰減深度。

本發(fā)明的用于富含脂滴組織透明化的方法

對(duì)于用水凝膠固定好的富含脂滴組織，此處采用的水凝膠固定處理方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)手段。在本發(fā)明的方法中，首先用表面活性劑進(jìn)行初步的透明化，然后加入脂肪酶(如豬胰脂肪酶)水解掉組織中富含的脂滴。脂肪酶是一種催化脂肪水解的酶，它可以將三鏈的甘油三酯上的一條甚至兩條脂肪酸鏈消化下來(lái)。消化后的產(chǎn)物(如脂質(zhì)小分子)進(jìn)一步通過結(jié)合表面活性劑(如SDS)，以SDS微囊的形式離開組織，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)富含脂滴樣品的快速和完全透明化。圖1為本發(fā)明的用于富含脂滴組織透明化的方法的基本原理示意圖。

衰減深度測(cè)試方法

本發(fā)明用熒光標(biāo)記的樣品作為測(cè)試衰減深度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，測(cè)量熒光信號(hào)隨著成像深度的增加而減少的衰減曲線，基于歸一化后衰減曲線，熒光信號(hào)從原始信號(hào)強(qiáng)度衰減到一半信號(hào)強(qiáng)度時(shí)的成像深度即為衰減深度。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。

實(shí)施例1：富含脂滴的肝臟組織的完全透明化(以肝臟組織的透明化為例)

1.1溶液的制備

1)SDS清洗液的制備

5L濃度為4％的SDS(十二烷基硫酸鈉)清洗液的配方如下：

2)脂肪酶消化液的制備

1)先分別配置3M氯化鈉(NaCl)，1.5％(w/v)牛黃膽酸(Taurocholic)，75mM氯化鈣(CaCl₂)。

2)配置15mL的混合液的配方如下：

3)再調(diào)節(jié)pH到7.7左右。將60000unit的脂肪酶lipase溶于該混合液中。

1.2脂質(zhì)的去除

1)去除肝臟樣品表面多余凝膠后，用振蕩切片機(jī)(VT1200s，Leica)將樣品切成1mm厚的肝片。

2)將第一步中切好的肝片孵育在50mL 4％SDS清洗液中，在37℃下清洗7天，期間每天換一次液。

3)將處理好的肝片隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，拍照記錄此時(shí)肝片的透明程度。

4)將實(shí)驗(yàn)組肝片從SDS清洗液中取出，用1×PBS洗去SDS清洗液后，將肝片放入配好的脂肪酶消化液中，在37℃條件下孵育4天；對(duì)照組中的肝片則繼續(xù)在4％SDS清洗液中清洗4天。拍照，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中肝片的透明程度。

5)將實(shí)驗(yàn)組的肝片從脂肪酶消化液中取出，用1×PBS洗去脂肪酶消化液后，再次放入50mL的4％SDS清洗液中清洗1天；對(duì)照組繼續(xù)在4％SDS清洗液中清洗1天。拍照，記錄實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中肝片的透明程度。

1.3Hoechst染色及成像

1)將Hoechst33342以1:1000稀釋，配成Hoechst染液。

2)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肝片室溫靜置孵育在Hoechst染液中12小時(shí)。

3)再將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組肝片分別轉(zhuǎn)入15mL PBST中，清洗Hoechst33342染料，室溫，靜置，12小時(shí)(每隔6小時(shí)換一次PBST)，避光。

4)將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的肝片從染液中取出，放入折射率匹配液FocusClear中匹配折射率12小時(shí)后。

5)如圖2所示，用藍(lán)丁膠作為粘合劑將肝片連同折射率均勻化液體(如FocusClear，RIMS)一起水平地封在載玻片和蓋玻片之間。實(shí)驗(yàn)組肝片封片后如圖3(a)所示，對(duì)照組肝片封片后如圖3(b)所示。

6)用激光掃描共聚焦顯微鏡(Nikon A1Si Confocal microscope),CFI Plan Apo 10×Objective(NA＝0.45,W.D.＝4.0mm))拍攝3D熒光圖像。

1.4圖像的處理與分析

使用NIS-Elements(Nikon Instruments)圖像獲取軟件，獲得3D圖像中垂直于拍攝面的切面(XZ or YZ)熒光圖像。熒光圖像在減去背景后，將位于同一成像深度處的像素值相加并歸一化。用歸一化后不同深度處的像素值和的變化展示肝片中的熒光信號(hào)隨著成像深度的增加而衰減的趨勢(shì)。所有圖像和數(shù)據(jù)處理在MATLAB中完成。

結(jié)果分析

2.1SDS去脂效果及其局限性

圖4(B)為4％SDS清洗液處理7天后的肝片，與處理前(圖4(A))相比，肝片的顏色變淺，表明肝片中的一部分脂質(zhì)確實(shí)被SDS帶走了。但是比較SDS處理7天(圖4(B))和11天(圖4(C))的效果，可以看出，單純的延長(zhǎng)SDS處理肝片的時(shí)間，并不能達(dá)到明顯的完全除去脂質(zhì)，使得肝片完全透明化的效果。

2.2脂肪酶的去脂效果

圖5(A)為未處理樣品，將已在SDS中清洗了7天的肝片(圖5(B))放入脂肪酶消化液中孵育4天后(圖5(C))，比較肝片在脂肪酶消化液處理前后的照片，發(fā)現(xiàn)肝片的透明度有了明顯的提高。而將脂肪酶處理好的肝片放回4％SDS清洗液中的處理1天，發(fā)現(xiàn)整個(gè)肝片幾近透明(圖5(D))，同僅僅孵育在4％SDS中11天的肝片(圖4(C))相比，脂肪酶處理的肝片的去脂效果更徹底。

2.3不同處理方式的Hoechst染色成像結(jié)果比較

使用脂肪酶去脂法得到的小鼠肝片Hoechst染色結(jié)果如圖6(B)所示，脂肪酶實(shí)驗(yàn)組中肝片內(nèi)不同深度處的細(xì)胞核均得到了良好的標(biāo)記及成像。而SDS對(duì)照組(圖6(A))中，在同樣的折射率匹配條件下，隨著成像深度的增加，熒光信號(hào)發(fā)生了迅速的衰減(圖7)。如果以熒光信號(hào)降低到峰值一半的時(shí)的厚度計(jì)算，脂肪酶去脂法的成像深度為475μm，是SDS去脂法成像深度95μm的5倍。說(shuō)明脂肪酶的處理確實(shí)能夠幫助提高肝臟樣品透明化程度，實(shí)現(xiàn)肝臟樣品的深度成像。需要說(shuō)明的是，由于使用空氣鏡頭成像，空氣(折射率為1)和透明化樣品的折射率(約為1.45)會(huì)造成獲得圖像的厚度小于樣品厚度的情況。此處，成像深度475μm相當(dāng)于樣品的厚度為679μm。

本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)包括：

(1)顯著提高富含脂滴組織的透明化程度和光學(xué)成像深度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所述方法與傳統(tǒng)單純依靠表面活性劑的透明化方法相比，可以將光學(xué)成像的深度增加5倍。

(2)不對(duì)生物組織的結(jié)構(gòu)形成任何破壞。所述方法不會(huì)對(duì)生物組織的精細(xì)結(jié)果造成破壞。

(3)將組織透明化技術(shù)的應(yīng)用范圍大幅度擴(kuò)展。采用所述方法并結(jié)合已有的組織透明化方法，將能實(shí)現(xiàn)對(duì)所有器官和組織，包括整個(gè)動(dòng)物身體的完整透明化，從而獲得三維高分辨率結(jié)構(gòu)信息。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。