本發(fā)明涉及三維發(fā)光圖像的生成方法和三維發(fā)光圖像生成用的攝像系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

近年來，來自ips細(xì)胞或es細(xì)胞這樣的干細(xì)胞的擬胚體或球體這樣的組織體作為新的研究材料而受到關(guān)注，使用它們進(jìn)行研究。一般情況下，來自干細(xì)胞的擬胚體或球體是在非接觸狀態(tài)下培養(yǎng)的干細(xì)胞集中凝集而構(gòu)筑球狀立體構(gòu)造而得到的細(xì)胞群。擬胚體或球體中包含的細(xì)胞具有根據(jù)培養(yǎng)條件而變化成各種細(xì)胞的分化能力。例如，在以臟器等的再生為目的的再生醫(yī)療、或評(píng)價(jià)新藥對(duì)人體的藥效/毒性的新藥研發(fā)的研究中，與此前使用的平面狀培養(yǎng)的細(xì)胞相比，優(yōu)選使用具有更加接近體內(nèi)環(huán)境的立體構(gòu)造的細(xì)胞。因此，特別是在近年來的再生醫(yī)療或新藥研發(fā)領(lǐng)域的研究中，來自干細(xì)胞的擬胚體或球體作為研究材料而受到關(guān)注。

在現(xiàn)有的二維培養(yǎng)細(xì)胞的評(píng)價(jià)中，作為細(xì)胞中引起的變化的檢測方法，公知利用發(fā)光蛋白質(zhì)或熒光蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)細(xì)胞來檢測發(fā)光或熒光的方法(例如日本特開2014-89193號(hào)公報(bào)、日本特開2006-320335號(hào)公報(bào))。在使用具有立體構(gòu)造的擬胚體等進(jìn)行研究時(shí)，優(yōu)選采用能夠高精度掌握分化程度這樣的擬胚體等的狀態(tài)的觀察方法。這里，優(yōu)選立體觀察擬胚體等的內(nèi)部的變化。

例如在日本特許第5424528號(hào)公報(bào)中公開了如下的解析方法和解析系統(tǒng)。即，該方法和系統(tǒng)將產(chǎn)生微弱光、并且具有多個(gè)應(yīng)該測定的部位的具有厚度的作為活樣本的胚或組織設(shè)為對(duì)象。在該方法和系統(tǒng)中，按照每個(gè)測定部位而從不同的位置取得微弱光信號(hào)，根據(jù)該信號(hào)進(jìn)行解析。并且，例如在日本特開2014-119762號(hào)公報(bào)中公開了使對(duì)焦位置變化來拍攝亮視野圖像和發(fā)光圖像或熒光圖像的顯微鏡系統(tǒng)。

并且，在立體的三維試樣的內(nèi)部的解析中，例如以一定間隔使焦點(diǎn)位置偏移并進(jìn)行拍攝，由此取得焦平面不同的多個(gè)二維圖像，通過基于這些二維圖像的重構(gòu)處理，能夠構(gòu)筑三維圖像。公知通過這種三維圖像的構(gòu)筑，能夠?qū)αⅢw樣本的內(nèi)部構(gòu)造及其變化進(jìn)行解析(例如日本特開2012-122829號(hào)公報(bào)、日本特表2010-532487號(hào)公報(bào))。該情況下，例如使用由發(fā)光蛋白質(zhì)或熒光蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)的細(xì)胞，能夠針對(duì)活狀態(tài)的細(xì)胞取得各種信息。

例如，在利用以往使用的熒光觀察法進(jìn)行擬胚體內(nèi)部的基因表達(dá)的解析的情況下，可能產(chǎn)生存在激勵(lì)光的光毒性或自身熒光、以及當(dāng)擬胚體大到某種程度時(shí)激勵(lì)光無法到達(dá)內(nèi)部這樣的不期望的事項(xiàng)。與此相對(duì)，如果采用使用發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光觀察法，則不會(huì)受到激勵(lì)光的光毒性或自身熒光的影響，能夠觀察到擬胚體這樣的具有厚度的樣本的內(nèi)部。

但是，一般情況下，發(fā)光蛋白質(zhì)的發(fā)光強(qiáng)度比熒光蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度弱，在一次拍攝中需要進(jìn)行長時(shí)間的曝光。因此，在通過重構(gòu)以一定間隔使焦點(diǎn)位置偏移并拍攝的發(fā)光圖像從而構(gòu)筑發(fā)光三維圖像的方法中，圖像構(gòu)筑需要時(shí)間。并且，在得到多個(gè)二維圖像時(shí)，如果縮短焦點(diǎn)位置的拍攝間隔，則三維圖像的信息量增多，成為高精細(xì)的圖像。另一方面，拍攝所需要的時(shí)間變長，數(shù)據(jù)尺寸也變大。相反，如果延長焦點(diǎn)位置的拍攝間隔，則數(shù)據(jù)尺寸減小，但是，三維圖像中包含的信息量減少，分辨率降低。

例如，在使用擬胚體調(diào)查新藥的藥效/毒性的情況下，根據(jù)希望評(píng)價(jià)的化合物的不同，有時(shí)在擬胚體中引起反應(yīng)需要時(shí)間，并且，所引起的反應(yīng)有時(shí)長時(shí)間變化。因此，需要進(jìn)行長時(shí)間的觀察。并且，在對(duì)擬胚體分化成心肌或肝細(xì)胞等各種細(xì)胞的分化過程進(jìn)行監(jiān)視的情況下，有時(shí)也需要進(jìn)行長時(shí)間的觀察。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

例如，在使用擬胚體這樣的三維試樣的解析中，通過進(jìn)行按照規(guī)定時(shí)間間隔取得上述三維重構(gòu)圖像的三維縮時(shí)觀察，能夠?qū)跁r(shí)間經(jīng)過的三維試樣的變化進(jìn)行解析。在這種解析中，所得到的數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)量可能成為龐大的量。并且，為了得到龐大的數(shù)據(jù)，需要較多的時(shí)間。另一方面，解析所需要的數(shù)據(jù)是一部分。并且，在活的試樣中，解析所需要的數(shù)據(jù)可能隨著時(shí)間經(jīng)過而變化。進(jìn)而，不僅來自干細(xì)胞的擬胚體或球體，構(gòu)成這些組織體的各個(gè)細(xì)胞有時(shí)示出不同的基因表達(dá)量。

本發(fā)明的目的在于，提供如下的三維發(fā)光圖像的生成方法和攝像系統(tǒng)：在包含被調(diào)制成進(jìn)行發(fā)光的多個(gè)細(xì)胞的具有三維形狀的三維試樣的觀察中，能夠取得充分必要的數(shù)據(jù)。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方式，三維發(fā)光圖像的生成方法包括以下步驟：針對(duì)包含被調(diào)制成進(jìn)行發(fā)光的多個(gè)細(xì)胞的具有三維形狀的三維試樣，根據(jù)所述三維試樣中的發(fā)光的局部存在，設(shè)定取得具有相互不同的合焦面的多個(gè)二維圖像時(shí)的所述多個(gè)二維圖像相互的間隔；通過在非照明條件下對(duì)所述三維試樣進(jìn)行拍攝，取得包含與所設(shè)定的所述間隔對(duì)應(yīng)的所述多個(gè)二維圖像的二維圖像組；以及對(duì)所述二維圖像組中包含的所述多個(gè)二維圖像進(jìn)行合成，生成三維發(fā)光圖像。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方式，攝像系統(tǒng)具有：物鏡光學(xué)系統(tǒng)；驅(qū)動(dòng)部，其使所述物鏡光學(xué)系統(tǒng)的合焦位置在光軸方向上移動(dòng)；攝像部，其經(jīng)由所述物鏡光學(xué)系統(tǒng)對(duì)包含被調(diào)制成進(jìn)行發(fā)光的多個(gè)細(xì)胞的具有三維形狀的三維試樣的發(fā)光圖像進(jìn)行攝像；間隔設(shè)定部，其根據(jù)所述三維試樣中的發(fā)光的局部存在，設(shè)定取得具有相互不同的合焦面的多個(gè)二維圖像時(shí)的所述多個(gè)二維圖像相互的間隔；攝像控制部，其在非照明條件下對(duì)所述驅(qū)動(dòng)部的動(dòng)作進(jìn)行控制，并且使所述攝像部拍攝所述三維試樣，由此取得包含與所設(shè)定的所述間隔對(duì)應(yīng)的所述多個(gè)二維圖像的二維圖像組；以及圖像合成部，其對(duì)所述二維圖像組中包含的所述多個(gè)二維圖像進(jìn)行合成，生成三維發(fā)光圖像。

根據(jù)本發(fā)明，能夠提供如下的三維發(fā)光圖像的生成方法和攝像系統(tǒng)：在包含被調(diào)制成進(jìn)行發(fā)光的多個(gè)細(xì)胞的具有三維形狀的三維試樣的觀察中，能夠取得充分必要的數(shù)據(jù)。

附圖說明

圖1是示出本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的攝像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)例的概略的框圖。

圖2是示出本發(fā)明的第1實(shí)施方式的三維發(fā)光圖像的生成方法的一例的流程圖。

圖3是示出本發(fā)明的第1實(shí)施方式的圖像取得處理的一例的流程圖。

圖4是示出本發(fā)明的第1實(shí)施方式的條件調(diào)整處理的一例的流程圖。

圖5是示出本發(fā)明的第1實(shí)施方式的自動(dòng)組合處理的一例的流程圖。

圖6是示出通過本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例取得的三維發(fā)光圖像的一例的圖。

圖7是示出通過本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例取得的三維發(fā)光圖像的一例的圖。

圖8是示出通過本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例取得的三維發(fā)光圖像的一例的圖。

圖9是用于說明第2實(shí)施方式中的三維試樣的圖像取得的示意圖，是示出攝影面的間隔比物鏡光學(xué)系統(tǒng)的焦深寬的情況的圖。

圖10是用于說明第2實(shí)施方式中得到的三維圖像的示意圖。

圖11是用于說明第2實(shí)施方式中的三維試樣的圖像取得的示意圖，是示出攝影面的間隔比物鏡光學(xué)系統(tǒng)的焦深窄的情況的圖。

圖12是用于說明第2實(shí)施方式中得到的三維圖像的示意圖。

圖13是用于說明第2實(shí)施方式中得到的三維圖像的示意圖。

圖14是用于說明第2實(shí)施方式的攝像系統(tǒng)的動(dòng)作的概略的示意圖。

圖15是示出第2實(shí)施方式的圖像取得處理的一例的流程圖。

圖16是示出第2實(shí)施方式的攝影面設(shè)定處理的一例的流程圖。

圖17是用于說明第2實(shí)施方式中將攝影面的間隔設(shè)定為較窄的條件的示意圖。

圖18是用于說明第2實(shí)施方式中將攝影面的間隔設(shè)定為較窄的條件的示意圖。

圖19是用于說明第2實(shí)施方式中的攝影面的間隔的設(shè)定的示意圖。

圖20是用于說明第2實(shí)施方式中的攝影面的間隔的設(shè)定的示意圖。

圖21是示出第2實(shí)施方式的二維圖像取得處理的一例的流程圖。

圖22是示出第2實(shí)施方式的第1變形例的攝影面設(shè)定處理的一例的流程圖。

具體實(shí)施方式

[第1實(shí)施方式]

參照附圖對(duì)本發(fā)明的第1實(shí)施方式進(jìn)行說明。圖1示出本實(shí)施方式的用于取得三維發(fā)光圖像的攝像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)例的概略。如圖1所示，攝像系統(tǒng)10具有保持三維試樣12的試樣保持部11、培養(yǎng)箱13、物鏡光學(xué)系統(tǒng)14、攝像部15、物鏡光學(xué)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)部16、試樣保持部驅(qū)動(dòng)部17、對(duì)攝像系統(tǒng)10的各部的動(dòng)作進(jìn)行控制的控制部18、顯示部19、輸入部20。

三維試樣12例如是來自ips細(xì)胞或es細(xì)胞這樣的干細(xì)胞的擬胚體或球體這樣的、包含多個(gè)細(xì)胞且具有厚度的試樣。三維試樣12被調(diào)制成在非照明條件下進(jìn)行自發(fā)光。三維試樣12例如包含導(dǎo)入了熒光素酶的基因的細(xì)胞，通過添加熒光素，熒光素酶表達(dá)的細(xì)胞發(fā)光。

培養(yǎng)箱13針對(duì)三維試樣12對(duì)溫度或co2濃度等維持細(xì)胞的環(huán)境條件進(jìn)行調(diào)節(jié)。物鏡光學(xué)系統(tǒng)14例如包含物鏡這樣的與一般顯微鏡相同的光學(xué)系統(tǒng)。攝像部15例如包含冷卻ccd照相機(jī)這樣的攝像裝置。攝像部15中包含的攝像元件不限于ccd圖像傳感器，也可以是cmos圖像傳感器等。攝像部15對(duì)由物鏡光學(xué)系統(tǒng)14放大的三維試樣12的像進(jìn)行攝像。通過在非照明條件下進(jìn)行攝像，攝像部15能夠取得三維試樣12發(fā)光的狀況的圖像。將這種發(fā)光的圖像稱為發(fā)光圖像。

也可以在物鏡光學(xué)系統(tǒng)14與攝像部15之間設(shè)置第1濾光片31。第1濾光片31例如能夠構(gòu)成為分光薄膜。作為為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的發(fā)光而使用的發(fā)光蛋白質(zhì)(例如熒光素酶)，在使用示出不同波長的發(fā)光的1種或2種以上的發(fā)光蛋白質(zhì)的情況下，有時(shí)按照每個(gè)波長進(jìn)行攝像。該情況下，為了按照每個(gè)波長對(duì)光進(jìn)行分離，使用第1濾光片31，一邊更換第1濾光片31一邊進(jìn)行攝像，或者按照每個(gè)波長在各個(gè)攝像部或攝像元件上的部分區(qū)域內(nèi)同時(shí)進(jìn)行攝像。由此，能夠取得多色的三維發(fā)光圖像。

試樣保持部11構(gòu)成為保持三維試樣12。試樣保持部11構(gòu)成為能夠在平面方向(x-y方向)上移動(dòng)。試樣保持部11例如由載物臺(tái)構(gòu)成。試樣保持部驅(qū)動(dòng)部17使試樣保持部11在平面方向(x-y方向)上移動(dòng)。通過試樣保持部11的平面方向(x-y方向)的移動(dòng)，攝像系統(tǒng)10能夠在平面內(nèi)變更攝像視野。

物鏡光學(xué)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)部16使物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的與所述平面方向(x-y方向)垂直的光軸方向(z方向)的合焦位置變化。物鏡光學(xué)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)部16例如使物鏡在光軸方向上移動(dòng)。另外，也可以代替物鏡光學(xué)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)部16，由試樣保持部驅(qū)動(dòng)部17使試樣保持部11在光軸方向上移動(dòng)。通過物鏡光學(xué)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)部16對(duì)合焦位置進(jìn)行變更，由此，能夠取得合焦于三維試樣12的厚度方向的不同位置的圖像。

并且，攝像系統(tǒng)10具有包含試樣保持部11和培養(yǎng)箱13的主體21、設(shè)置在主體21的外周部上的暗箱22、覆蓋暗箱22的蓋23、設(shè)置在蓋23上的第2濾光片30、經(jīng)由第2濾光片30對(duì)三維試樣12照射的照明光的光源即光源24。通過暗箱22和蓋23，主體21的內(nèi)部被遮擋外來光。因此，在斷開光源24的情況下，主體21的內(nèi)部成為非照明條件。由此，即使在設(shè)置在主體21的內(nèi)部的三維試樣12發(fā)出極微弱的光時(shí)，攝像系統(tǒng)10也能夠在良好的條件下對(duì)該光進(jìn)行攝像。另一方面，通過接通光源24，進(jìn)行三維試樣12的照明。例如，為了在發(fā)光的觀察和攝像之前確認(rèn)試樣的位置或者對(duì)焦于試樣表面等，進(jìn)行照明條件下的三維試樣的觀察。

并且，通過利用能夠構(gòu)成為分光薄膜的第2濾光片30、或者在光源24中使用激光光源，還能夠?qū)θS試樣12照射用于產(chǎn)生熒光的激勵(lì)光。如果進(jìn)行調(diào)制以使得三維試樣12產(chǎn)生熒光，則不僅是發(fā)光，還能夠取得三維試樣12的熒光的圖像。

控制部18例如由個(gè)人計(jì)算機(jī)構(gòu)成?？刂撇?8具有對(duì)攝像動(dòng)作進(jìn)行控制的攝像控制部181、對(duì)所拍攝的圖像進(jìn)行圖像處理而生成三維發(fā)光圖像的圖像合成部182、決定拍攝條件的拍攝條件決定部183、記錄各種數(shù)據(jù)的記錄部184。

攝像控制部181對(duì)取得一張圖像時(shí)的曝光時(shí)間進(jìn)行控制。并且，攝像控制部181進(jìn)行由物鏡光學(xué)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)部16調(diào)整的z軸方向的合焦位置的變化、即拍攝間距的控制。攝像控制部181使攝像部15取得由相互不同的多個(gè)合焦面的多個(gè)二維發(fā)光圖像構(gòu)成的一組二維發(fā)光圖像。并且，攝像控制部181對(duì)一組二維發(fā)光圖像的取得與另一組二維發(fā)光圖像的取得的間隔即拍攝間隔進(jìn)行控制。

圖像合成部182對(duì)一組二維發(fā)光圖像進(jìn)行合成而生成三維發(fā)光圖像。在三維發(fā)光圖像的生成中，進(jìn)行三維合成即三維重構(gòu)處理。即，圖像合成部182針對(duì)一組二維發(fā)光圖像，使用各個(gè)位置信息，三維地排列各圖像而進(jìn)行合成，由此生成三維發(fā)光圖像。

拍攝條件決定部183決定由攝像控制部181控制的攝像的條件。即，拍攝條件決定部183例如決定拍攝間隔、拍攝間距和曝光時(shí)間。

記錄部184記錄控制部18的動(dòng)作所需要的信息。在該信息中包含用于供控制部18的各部進(jìn)行動(dòng)作的程序。并且，記錄部184記錄通過攝像而得到的二維圖像、通過合成而生成的三維發(fā)光圖像。

這樣，根據(jù)本實(shí)施方式的攝像系統(tǒng)10，隔開所決定的拍攝間隔而取得多個(gè)三維發(fā)光圖像。即，根據(jù)攝像系統(tǒng)10，能夠進(jìn)行三維發(fā)光圖像的縮時(shí)拍攝。

控制部18包含centralprocessingunit(cpu)、applicationspecificintegratedcircuit(asic)或fieldprogrammablegatearray(fpga)等集成電路等，進(jìn)行各種運(yùn)算。攝像控制部181、圖像合成部182和拍攝條件決定部183可以分別由一個(gè)集成電路等構(gòu)成，也可以組合多個(gè)集成電路等而構(gòu)成。并且，攝像控制部181、圖像合成部182和拍攝條件決定部183中的2個(gè)以上也可以由一個(gè)集成電路等構(gòu)成。根據(jù)記錄部184或集成電路內(nèi)的存儲(chǔ)區(qū)域中記錄的程序進(jìn)行控制部18的動(dòng)作。并且，控制部18根據(jù)記錄部184中記錄的二維圖像和/或三維圖像，計(jì)算每個(gè)像素的發(fā)光的亮度值，由此，將與圖像整體或部分的發(fā)光量相當(dāng)?shù)牧炼戎档男畔⑺统龅脚臄z條件決定部183。

顯示部19例如包含液晶顯示器這樣的一般的顯示裝置。顯示部19例如顯示由圖像合成部182生成的三維發(fā)光圖像。顯示部19顯示發(fā)光二維圖像及其他圖像、基于控制部18的攝像系統(tǒng)10的控制信息。

輸入部20例如包含鍵盤、觸摸面板、開關(guān)、滾動(dòng)條等這樣的一般輸入裝置中的任意一方。輸入部20受理用戶的指示，將該指示傳遞到控制部18。

接著，參照?qǐng)D2所示的流程圖對(duì)本實(shí)施方式的三維發(fā)光圖像的生成方法進(jìn)行說明。

在步驟s101中，對(duì)三維試樣進(jìn)行調(diào)整。這里，三維試樣包含多個(gè)細(xì)胞，具有三維形狀。在三維試樣中，例如可以包含來自ips細(xì)胞或es細(xì)胞這樣的干細(xì)胞的擬胚體或球體、從擬胚體或球體分化的心肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞等各種細(xì)胞的集合體或菌落、或者多層化的細(xì)胞片等。并且，三維試樣被調(diào)整為不需要來自外部的激勵(lì)光而進(jìn)行自發(fā)光。例如，三維試樣的細(xì)胞能夠調(diào)整為表達(dá)熒光素酶，通過添加熒光素而產(chǎn)生生物發(fā)光。另外，三維試樣不限于此。例如，三維試樣也可以是在載體上分開配置細(xì)胞的試樣。

在步驟s102中，決定拍攝條件。在拍攝條件中，可以包括取得一組二維發(fā)光圖像的時(shí)間間隔即拍攝間隔、取得一張二維發(fā)光圖像時(shí)的曝光時(shí)間、作為使物鏡光學(xué)系統(tǒng)的合焦位置在光軸方向上移動(dòng)的量的合焦面的距離間隔即拍攝間距。在第1實(shí)施方式中，拍攝條件能夠作為這些條件的最優(yōu)組合來決定。例如，拍攝間距能夠根據(jù)三維試樣的尺寸和形狀來決定。曝光時(shí)間也可以根據(jù)拍攝間距和拍攝間隔來決定。并且，曝光時(shí)間能夠根據(jù)三維試樣的發(fā)光強(qiáng)度來決定。拍攝間距也可以根據(jù)曝光時(shí)間和拍攝間隔來決定。

在步驟s103中，在非照明條件下取得多個(gè)二維發(fā)光圖像。該二維發(fā)光圖像是對(duì)三維試樣的發(fā)光進(jìn)行攝像而得到的。這里，取得具有相互不同的多個(gè)合焦面的二維圖像作為一組二維圖像。在一組二維圖像中，可以包含三維試樣的高度方向上從端到端的全部位置的二維圖像，也可以包含三維試樣的高度方向的特定一部分區(qū)域的二維圖像。

在步驟s104中，可以在使用了照明光或激勵(lì)光的照明條件下取得透射圖像即二維圖像。該透射圖像例如可以用于決定拍攝條件。并且，該透射圖像也可以用于生成后述三維發(fā)光圖像。通過在三維發(fā)光圖像的生成中使用透射圖像，不僅是發(fā)光的信息，還容易識(shí)別發(fā)光的信息和透射圖像的信息的組合信息。

在步驟s105中，根據(jù)步驟s103中取得的一組二維發(fā)光圖像生成三維發(fā)光圖像。在三維發(fā)光圖像的生成中，通過根據(jù)其位置信息對(duì)二維發(fā)光圖像進(jìn)行合成，能夠生成三維發(fā)光圖像。在該三維發(fā)光圖像的生成中，也可以一并使用步驟s104中取得的、照明條件下得到的透射圖像。

在步驟s106中，在判斷為隔開拍攝間隔進(jìn)行下一個(gè)二維發(fā)光圖像和使用該二維發(fā)光圖像的三維發(fā)光圖像的生成時(shí)，反復(fù)進(jìn)行步驟s103～步驟s105。即，進(jìn)行三維發(fā)光圖像的縮時(shí)拍攝。

接著，說明使用第1實(shí)施方式的攝像系統(tǒng)10進(jìn)行的取得基于縮時(shí)的樣本的三維發(fā)光圖像的圖像取得處理。在用戶在試樣保持部11上設(shè)置試樣后、從輸入部20輸入了數(shù)據(jù)取得的開始指示時(shí)，開始進(jìn)行圖像取得處理。參照?qǐng)D3所示的流程圖對(duì)圖像取得處理進(jìn)行說明。在控制部18的控制下進(jìn)行該圖像取得處理。

在步驟s201中，控制部18根據(jù)用戶對(duì)輸入部20的輸入，設(shè)定拍攝間隔(interval)。這里，拍攝間隔例如根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容來決定。在細(xì)胞內(nèi)鈣測定等將以數(shù)秒～數(shù)分鐘間隔進(jìn)行變化的現(xiàn)象作為對(duì)象的測定中，要求將拍攝間隔設(shè)定為較短。另一方面，在干細(xì)胞的分化、產(chǎn)生研究、時(shí)鐘基因表達(dá)的解析等將以數(shù)小時(shí)～數(shù)日級(jí)別緩慢變化的現(xiàn)象作為對(duì)象的測定中，拍攝間隔也可以比較長。

在步驟s202中，控制部18取得作為樣本的明亮度而取得的發(fā)光量。例如，取得樣本的二維圖像，對(duì)所得到的圖像的亮度進(jìn)行解析，由此取得發(fā)光量。

在步驟s203中，控制部18根據(jù)步驟s202中得到的信息，計(jì)算曝光時(shí)間的候選。作為候選舉出的曝光時(shí)間設(shè)為能夠圖像化的曝光時(shí)間。例如在16位的圖像數(shù)據(jù)的情況下，使用0～65535的值作為像素值。例如可以選擇像素值不飽和的曝光時(shí)間。并且，作為實(shí)現(xiàn)圖像化的數(shù)值的目標(biāo)，也可以設(shè)定全部像素的像素值的平均值為5000左右的曝光時(shí)間。另外，關(guān)于曝光時(shí)間，可以任意設(shè)定閾值?？刂撇?8例如研究這些曝光時(shí)間的條件，確定適當(dāng)范圍作為曝光時(shí)間。

在步驟s204中，控制部18取得樣本的厚度(深度)。為了取得樣本的厚度，例如一邊變更z方向的對(duì)焦位置一邊取得樣本的圖像。根據(jù)所得到的圖像確定樣本的下限和上限，計(jì)算下限與上限的距離。此時(shí)，由于能夠在短時(shí)間內(nèi)可靠地取得圖像，所以，優(yōu)選要取得的圖像是照明條件下取得的亮視野圖像。但是，也可以代替亮視野圖像而使用發(fā)光圖像。

在步驟s205中，控制部18根據(jù)步驟s204中取得的樣本的厚度，計(jì)算拍攝間距的候選。

在步驟s206中，控制部18進(jìn)行用于決定拍攝條件的模式選擇。在本實(shí)施方式中，準(zhǔn)備深度優(yōu)先模式、分辨率優(yōu)先模式、自動(dòng)組合模式。用戶從這些模式中選擇希望的模式?？刂撇?8取得針對(duì)輸入部20的輸入，確定所選擇的模式。

在步驟s206中選擇了深度優(yōu)先模式時(shí)，處理進(jìn)入步驟s207。在步驟s207中，控制部18使深度優(yōu)先來決定圖像取得的臨時(shí)條件。即，在深度優(yōu)先模式中，縮窄拍攝間距，取得在深度方向上分辨率較高的數(shù)據(jù)。例如考慮如下情況：針對(duì)100μm厚的實(shí)驗(yàn)樣本，選擇30分鐘作為拍攝間隔，需要最低1分鐘作為曝光時(shí)間。該情況下，通過設(shè)曝光時(shí)間為1分鐘，在拍攝間隔即30分鐘內(nèi)，能夠以3.3μm間隔取得30張圖像。該情況下，作為臨時(shí)條件，決定曝光時(shí)間為1分鐘、拍攝間距為3.3μm的意思。決定圖像取得的臨時(shí)條件后，處理進(jìn)入步驟s208。這里，深度優(yōu)先模式中選擇的拍攝間距是至少能夠?qū)我患?xì)胞進(jìn)行2次以上的攝像的尺寸。這樣，在希望對(duì)單一細(xì)胞進(jìn)行n次攝像的情況下，能夠設(shè)為從作為對(duì)象的細(xì)胞的平均直徑m(μm)除以n而得到的值(m/n)中減去0.1以上(m-0.1)以下的值(μm)而得到的攝像間距。為了在深度優(yōu)先模式下拍攝平均直徑為6μm的單一細(xì)胞，將拍攝間距設(shè)定為1.4～2.9μm，由此能夠執(zhí)行2～4次拍攝。同樣，從2.4～4.9μm中選擇平均直徑為10μm的細(xì)胞的攝像間距。

在步驟s208中，控制部18進(jìn)行條件調(diào)整處理。參照?qǐng)D4所示的流程圖對(duì)條件調(diào)整處理進(jìn)行說明。

在步驟s301中，控制部18根據(jù)所決定的圖像取得的臨時(shí)條件、即曝光時(shí)間和拍攝間距，取得用于構(gòu)筑三維發(fā)光圖像的多個(gè)二維圖像。例如，反復(fù)進(jìn)行如下處理：在規(guī)定的焦點(diǎn)位置處以所決定的曝光時(shí)間取得二維圖像，接著，以所決定的拍攝間距變更焦點(diǎn)位置，再次以所決定的曝光時(shí)間取得二維圖像。

在步驟s302中，控制部18根據(jù)步驟s301中取得的圖像生成三維發(fā)光圖像。此時(shí)，對(duì)步驟s301中取得的圖像實(shí)施逆卷積處理，進(jìn)行抵消圖像模糊的處理。使用進(jìn)行了逆卷積處理后的圖像來進(jìn)行三維發(fā)光圖像的生成。

在步驟s303中，控制部18使顯示部19顯示所生成的三維發(fā)光圖像。

在步驟s304中，控制部18取得使用者對(duì)于拍攝條件是否適當(dāng)?shù)呐袛?。例如，在顯示部19中顯示曝光時(shí)間、拍攝間距和拍攝間隔的當(dāng)前設(shè)定值、以及用于對(duì)其進(jìn)行變更的圖標(biāo)。使用者通過選擇圖標(biāo)，能夠輸入自身的判斷結(jié)果。在取得了拍攝條件適當(dāng)?shù)囊馑嫉男畔r(shí)，處理進(jìn)入步驟s305。

在步驟s305中，控制部18決定當(dāng)前設(shè)定的圖像取得用的臨時(shí)條件作為最終的圖像取得用的條件。然后，條件調(diào)整處理結(jié)束，處理返回參照?qǐng)D3說明的圖像取得處理。

在步驟s304中取得了拍攝條件不適當(dāng)?shù)囊馑嫉男畔r(shí)，處理進(jìn)入步驟s306。在步驟s306中，控制部18從使用者取得曝光時(shí)間、拍攝間距和拍攝間隔的變更值，以對(duì)條件進(jìn)行變更。這里，例如根據(jù)與拍攝間隔之間的關(guān)系，在增加了曝光時(shí)間而必須擴(kuò)大拍攝間距時(shí)，在進(jìn)行了用于增加曝光時(shí)間的輸入時(shí)，計(jì)算與該變更對(duì)應(yīng)的拍攝間距并進(jìn)行提示，并且提示拍攝間隔的變更。再次設(shè)定圖像取得的條件后，處理返回步驟s301。然后，以再次設(shè)定的條件進(jìn)行二維圖像的取得和三維發(fā)光圖像的生成等。

返回圖3繼續(xù)進(jìn)行說明。在步驟s208中進(jìn)行條件調(diào)整處理后，處理進(jìn)入步驟s213。

在步驟s206中選擇了分辨率優(yōu)先模式時(shí)，處理進(jìn)入步驟s209。在步驟s209中，控制部18使分辨率優(yōu)先來決定圖像取得的臨時(shí)條件。即，在分辨率優(yōu)先模式中，延長曝光時(shí)間，取得s/n比較高的發(fā)光圖像。例如考慮如下情況：針對(duì)100μm厚的實(shí)驗(yàn)樣本，選擇30分鐘作為拍攝間隔，當(dāng)設(shè)曝光時(shí)間為4分鐘時(shí)，能夠取得分辨率較高的圖像。該情況下，通過設(shè)曝光時(shí)間為4分鐘，在拍攝間隔即30分鐘內(nèi)，能夠以14.3μm間隔取得7張圖像。該情況下，作為臨時(shí)條件，決定曝光時(shí)間為4分鐘、拍攝間距為14.3μm的意思。決定圖像取得的臨時(shí)條件后，處理進(jìn)入步驟s210。這里，分辨率優(yōu)先模式中選擇的拍攝間距例如能夠設(shè)為在2個(gè)以上的細(xì)胞在深度方向上相鄰的情況下能夠拍攝任意一個(gè)細(xì)胞的尺寸。這樣，在對(duì)n個(gè)(2個(gè)以上)細(xì)胞進(jìn)行一次攝像的情況下，能夠設(shè)為從作為對(duì)象的細(xì)胞的平均直徑m(μm)乘以n而得到的值(mn)中減去0.1以上且小于mn的一半值(mn/2)的值(μm)而得到的攝像間距。為了在分辨率優(yōu)先模式下拍攝平均直徑為6μm的單一細(xì)胞，將拍攝間距設(shè)定為6.1～23.9μm，由此能夠按照每2～4個(gè)細(xì)胞執(zhí)行一次拍攝。同樣，從10.1～39.9μm中選擇平均直徑為10μm的細(xì)胞的攝像間距。

在步驟s210中，控制部18進(jìn)行條件調(diào)整處理。條件調(diào)整處理與參照?qǐng)D4說明的步驟s208的條件調(diào)整處理相同。在條件調(diào)整處理之后，處理進(jìn)入步驟s213。

在步驟s206中選擇了自動(dòng)組合模式時(shí)，處理進(jìn)入步驟s211。在步驟s211中，控制部18進(jìn)行自動(dòng)組合處理。參照?qǐng)D5所示的流程圖對(duì)自動(dòng)組合處理進(jìn)行說明。

在步驟s401中，控制部18根據(jù)步驟s201中取得的拍攝間隔、步驟s203中取得的曝光時(shí)間的候選和步驟s205中取得的拍攝間距的候選，設(shè)定多個(gè)拍攝條件。

在步驟s402中，控制部18根據(jù)步驟s401中設(shè)定的條件，取得必要的多個(gè)二維圖像。

在步驟s403中，控制部18根據(jù)步驟s402中取得的二維圖像，生成多個(gè)三維發(fā)光圖像。

在步驟s404中，控制部18使顯示部19顯示步驟s403中生成的多個(gè)三維發(fā)光圖像和用于生成這些圖像的拍攝條件等。使用者確認(rèn)顯示部19中顯示的三維發(fā)光圖像和拍攝條件等，并且選擇優(yōu)選的拍攝條件。

在步驟s405中，控制部18取得使用者對(duì)拍攝條件的選擇。在步驟s406中，控制部18決定步驟s405中取得的條件作為臨時(shí)條件。然后，結(jié)束自動(dòng)組合處理，處理返回參照?qǐng)D3說明的圖像取得處理。

返回圖3繼續(xù)進(jìn)行說明。在步驟s212中，控制部18進(jìn)行條件調(diào)整處理。然后，處理進(jìn)入步驟s213。在步驟s213中，控制部18將條件調(diào)整處理中決定的圖像取得的條件保存在記錄部184中。在步驟s214中，控制部18判定是否輸入了數(shù)據(jù)取得開始的指示。在未輸入數(shù)據(jù)取得開始的指示時(shí)，處理返回步驟s214，等待數(shù)據(jù)取得開始的指示的輸入。在輸入了數(shù)據(jù)取得開始的指示時(shí)，處理進(jìn)入步驟s215。

在步驟s215中，控制部18進(jìn)行數(shù)據(jù)取得處理。在數(shù)據(jù)取得處理中，根據(jù)所決定的圖像取得的條件進(jìn)行數(shù)據(jù)取得處理。即，根據(jù)所決定的曝光時(shí)間，取得發(fā)光圖像。關(guān)于該圖像，根據(jù)所決定的拍攝間距使焦點(diǎn)位置變化，并且取得焦點(diǎn)位置不同的多個(gè)發(fā)光圖像。根據(jù)這些多個(gè)發(fā)光圖像，生成三維發(fā)光圖像。按照所決定的每個(gè)拍攝間隔進(jìn)行這樣得到的三維發(fā)光圖像的取得。以上，本處理結(jié)束。

另外，拍攝間隔、曝光時(shí)間和拍攝間距這樣的拍攝條件不需要在全部計(jì)測中恒定。例如，可以在觀察的前期使深度優(yōu)先、在后期使分辨率優(yōu)先，也可以在觀察的前期和后期設(shè)定為拍攝間隔不同。

并且，也可以根據(jù)透射圖像得到被攝體內(nèi)部的細(xì)胞的分布信息，確認(rèn)細(xì)胞的高度方向的分布后，決定應(yīng)該攝像的中間部位的高度方向的位置。這樣，例如在曝光時(shí)間較長的生物發(fā)光的圖像取得中，能夠使用于取得一張三維發(fā)光圖像的時(shí)間成為最小限度，能夠?qū)崿F(xiàn)高效的解析。

本實(shí)施方式中取得的三維發(fā)光圖像是對(duì)三維試樣的發(fā)光進(jìn)行攝像而得到的。因此，如果采用使用本實(shí)施方式的發(fā)光現(xiàn)象的觀察方法，則不存在由于熒光觀察的情況下產(chǎn)生的自身熒光而引起的問題。并且，在熒光觀察中，有時(shí)無法忽略激勵(lì)光對(duì)三維試樣造成的損害。如果采用使用本實(shí)施方式的發(fā)光現(xiàn)象的觀察方法，則不存在由于熒光觀察的情況下產(chǎn)生的激勵(lì)光而引起的問題。因此，本實(shí)施方式的觀察還能夠應(yīng)用于長期間的觀察。

并且，根據(jù)本實(shí)施方式，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮妥鳛橛^察對(duì)象的樣本，選擇最優(yōu)的拍攝間隔、曝光時(shí)間和拍攝間距。

例如，將再生醫(yī)療研究中廣泛使用的擬胚體或球體作為對(duì)象，除了高度方向的端部，還取得中間部位的三維發(fā)光圖像，由此，能夠立體地掌握構(gòu)造物整體的基因表達(dá)的狀況。這里，中間部位是接近活體狀態(tài)的部位，能夠取得該部分的數(shù)據(jù)的意義重大。根據(jù)三維發(fā)光圖像，能夠取得能夠與三維試樣的內(nèi)部構(gòu)造進(jìn)行比較(或核對(duì))的圖像。

并且，根據(jù)擬胚體或球體的尺寸和形狀來設(shè)定拍攝間距，由此，得到考慮了攝像范圍中包含的細(xì)胞的數(shù)量和密度的三維發(fā)光圖像。一般情況下，來自干細(xì)胞的擬胚體或球體的全長的平均直徑涉及50μm～1000μm的范圍，所以，在全長較長(例如500μm以上)的情況下，優(yōu)選通過采用分辨率優(yōu)先模式，擴(kuò)大攝像間距，由此執(zhí)行適當(dāng)次數(shù)的拍攝，并且，通過深度優(yōu)先模式，僅限定地、精密地拍攝包含截面最大的中間部位的狹窄的區(qū)域(例如與全長的三分之一～五分之一相當(dāng)?shù)纳疃?。并且，拍攝條件能夠適當(dāng)變更，所以，能夠決定拍攝條件，以使得進(jìn)行例如與分化進(jìn)度對(duì)應(yīng)的必要精度的立體觀察。并且，使合焦位置在光軸方向上變化來拍攝多個(gè)發(fā)光圖像，所以，不需要使作為被攝體的三維試樣移動(dòng)或旋轉(zhuǎn)。

并且，在用于理解干細(xì)胞的分化的誘導(dǎo)機(jī)構(gòu)的研究中，本實(shí)施方式的觀察方法能夠得到特別有益的信息。該方法例如能夠作為分化效率的評(píng)價(jià)、分化誘導(dǎo)藥劑的評(píng)價(jià)等解析工具而使用。并且，將再生醫(yī)療研究中廣泛使用的擬胚體作為對(duì)象來進(jìn)行立體的發(fā)光觀察，由此，能夠基于平面中無法檢測的高度和厚度的信息進(jìn)行高精度的解析。

<實(shí)施例>

<實(shí)施例1>

以下示出針對(duì)ips細(xì)胞的心肌誘導(dǎo)過程中的心肌特異的標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)行利用了發(fā)光的三維觀察而得到的結(jié)果。

心肌特異的肌鈣蛋白t(cardiactroponint；ctnt)是心肌中特異表達(dá)的蛋白質(zhì)，用作心肌分化的標(biāo)記基因。構(gòu)筑能夠?qū)⒗鲜骾ps細(xì)胞的基于擬胚體形成法的心肌分化過程中的ctnt的表達(dá)變化作為發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行解析的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，進(jìn)行該老鼠ips細(xì)胞的擬胚體的三維觀察。

[實(shí)驗(yàn)方法]

(1)導(dǎo)入了包含ctnt基因的啟動(dòng)子區(qū)域和熒光素酶基因的核酸的老鼠ips細(xì)胞的制作

將ctnt基因用的啟動(dòng)子區(qū)域組入新霉素耐性的pgl4.17熒光素酶報(bào)告載體(promega)中，制作了“ctnt基因表達(dá)特異的發(fā)光載體pctnt-gl4”。

在導(dǎo)入載體的老鼠ips細(xì)胞(ips-mef-ng-20d-17、京都大學(xué))的培養(yǎng)中使用kodmem培養(yǎng)基。在通過絲裂霉素c處理而停止分裂的mef細(xì)胞上培養(yǎng)該ips細(xì)胞。

使用核轉(zhuǎn)染(nucleofection)法，在老鼠ips細(xì)胞上轉(zhuǎn)染pctnt-gl4基因表達(dá)載體。利用kodmem培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞與新霉素耐性飼養(yǎng)細(xì)胞一起培養(yǎng)一晚上。然后，將培養(yǎng)基更換為添加了抗生物質(zhì)g418(invitrogen)而成為最終濃度250μg/ml的kodmem培養(yǎng)基，進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。這樣，取得了穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。下面，將該細(xì)胞稱為ctnt-gl4表達(dá)老鼠ips細(xì)胞。

(2)ctnt-gl4表達(dá)老鼠ips細(xì)胞的擬胚體的形成

利用pbs清洗所培養(yǎng)的ctnt-gl4表達(dá)老鼠ips細(xì)胞，利用0.25％胰蛋白酶edta進(jìn)行剝離后，添加kodmem培養(yǎng)基，在37℃下在培養(yǎng)箱內(nèi)培育4小時(shí)。通過使飼養(yǎng)細(xì)胞(mef)固定，從而僅老鼠ips細(xì)胞成為浮游的狀態(tài)。使包含老鼠ips細(xì)胞的培養(yǎng)基離心來回收細(xì)胞，在1ml的kodmem培養(yǎng)基或imdm培養(yǎng)基中再次混入細(xì)胞。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)溶液中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計(jì)測，在添加了imdm培養(yǎng)基的lipidure-coat培養(yǎng)基(96孔圓底；日油株式會(huì)社)的各孔中添加細(xì)胞混濁液，使得細(xì)胞數(shù)成為2500個(gè)或5000個(gè)，在3～7日內(nèi)在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)，形成擬胚體。

(3)ctnt-gl4表達(dá)老鼠ips細(xì)胞針對(duì)心肌的分化誘導(dǎo)

將所形成的擬胚體轉(zhuǎn)移到進(jìn)行了明膠涂層處理后的35mm培養(yǎng)皿，在37℃下培育一晩上，使擬胚體粘接在培養(yǎng)皿表面。然后，在37℃下培養(yǎng)5～14日左右，進(jìn)行針對(duì)脈動(dòng)的心肌細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。

(4)ctnt-gl4表達(dá)老鼠ips細(xì)胞的觀察和解析

在37℃下繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，針對(duì)一部分看到脈動(dòng)的心肌細(xì)胞的ctnt-gl4表達(dá)老鼠es細(xì)胞的擬胚體，添加d-luciferin(和光純藥制)以使得成為最終濃度1mm，使用搭載了解析軟件即cellsens(奧林巴斯株式會(huì)社)的發(fā)光顯微鏡lv200(奧林巴斯株式會(huì)社)對(duì)脈動(dòng)的細(xì)胞進(jìn)行發(fā)光三維觀察。作為此時(shí)的拍攝條件，物鏡設(shè)為20倍，ccd照相機(jī)設(shè)為imagem(注冊(cè)商標(biāo))(hamamatsuphotonics公司制)，合并(binning)設(shè)為1×1。

各焦點(diǎn)位置處的曝光時(shí)間設(shè)為3分鐘、5分鐘或10分鐘。拍攝間距設(shè)為10μm、50μm或100μm。

[實(shí)驗(yàn)結(jié)果和考察]

圖6示出設(shè)拍攝間距為10μm、使焦點(diǎn)位置變化并取得20張圖像(合計(jì)1000μm)的情況下的拍攝結(jié)果。在圖6中，左側(cè)的圖是各個(gè)二維圖像的曝光時(shí)間為5分鐘的情況下的三維重構(gòu)圖像，右側(cè)的圖是各個(gè)二維圖像的曝光時(shí)間為10分鐘的情況下的三維重構(gòu)圖像。

如圖6所示，在該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，可知在曝光時(shí)間為10分鐘時(shí)，曝光過多，曝光時(shí)間為5分鐘的情況下，分辨率優(yōu)良。

圖7示出設(shè)曝光時(shí)間為3分鐘或5分鐘、拍攝間距為10μm、50μm或100μm而拍攝了厚度400μm的區(qū)域的結(jié)果。在圖7中，上段是各個(gè)二維圖像的曝光時(shí)間為3分鐘的情況，下段是各個(gè)二維圖像的曝光時(shí)間為5分鐘的情況。并且，在圖7中，左列的圖像是拍攝間距為10μm、根據(jù)40張圖像重構(gòu)三維發(fā)光圖像的結(jié)果。中列的圖像是拍攝間距為50μm、根據(jù)8張圖像重構(gòu)三維發(fā)光圖像的結(jié)果。右列的圖像是拍攝間距為100μm、根據(jù)4張圖像重構(gòu)三維發(fā)光圖像的結(jié)果。

如圖7所示，在該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，可知與曝光時(shí)間為3分鐘的情況相比，在曝光時(shí)間為5分鐘的情況下，分辨率優(yōu)良。并且，在該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，可知拍攝間距越窄，則空間分辨率越高。這樣，通過區(qū)分使用上述深度優(yōu)先模式和分辨率優(yōu)先模式，能夠取得多樣的三維圖像。根據(jù)通過這些多個(gè)拍攝模式拍攝到的三維發(fā)光圖像，例如針對(duì)在三維試樣的內(nèi)部、基因表達(dá)的變化較大的部分應(yīng)用深度優(yōu)先模式，由此能夠在短時(shí)間內(nèi)得到較多的信息。其結(jié)果，在局部地表達(dá)量的變化較大的情況下，也能夠準(zhǔn)確地掌握表達(dá)量的變化。

圖8示出設(shè)曝光時(shí)間為3分鐘或5分鐘、拍攝間距為10μm或100μm而拍攝了厚度400μm的區(qū)域的結(jié)果。在圖8中，上段是各個(gè)二維圖像的曝光時(shí)間為3分鐘的情況，下段是各個(gè)二維圖像的曝光時(shí)間為5分鐘的情況。并且，在圖8中，左列的圖像是拍攝間距為10μm、根據(jù)40張圖像重構(gòu)三維發(fā)光圖像的結(jié)果。右列的圖像是拍攝間距為100μm、根據(jù)4張圖像重構(gòu)三維發(fā)光圖像的結(jié)果。

如圖8所示，在該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，可知與曝光時(shí)間為3分鐘的情況相比，在曝光時(shí)間為5分鐘的情況下，分辨率優(yōu)良。并且，在該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，可知拍攝間距越窄，則空間分辨率越高。

如上所述，顯而易見，根據(jù)拍攝條件，所生成的三維發(fā)光圖像不同。由此，顯而易見，適當(dāng)選擇拍攝條件是很重要的。

并且，利用從光源射出的規(guī)定波長的光對(duì)樣本進(jìn)行照明，取得基于亮視野或熒光的透射圖像。預(yù)先確認(rèn)三維試樣的內(nèi)部構(gòu)造，能夠適當(dāng)指定試樣的高度方向的攝像范圍。由于重力或吸附力等物理影響，來自三維試樣的高度的頂點(diǎn)附近或容器底面的粘接部附近的三維信息有時(shí)成為表達(dá)量的解析的噪聲。因此，盡可能選擇這些力學(xué)影響較少的中間部位作為攝像范圍是很重要的。進(jìn)而，在擬胚體或球體那樣根據(jù)試樣內(nèi)部的分化度而使細(xì)胞的數(shù)量和密度等變化的情況下，與培養(yǎng)時(shí)期無關(guān)，為了沒有遺漏地對(duì)試樣內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行解析，拍攝間距是很重要的。

顯而易見，如果能夠在適當(dāng)條件下進(jìn)行二維圖像的拍攝、并根據(jù)該二維圖像進(jìn)行三維發(fā)光圖像的構(gòu)筑，則能夠生成與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡葘?duì)應(yīng)的適當(dāng)?shù)陌l(fā)光三維發(fā)光圖像。

[實(shí)施例2]

通過進(jìn)行使用三維發(fā)光觀察法的縮時(shí)觀察，能夠立體且經(jīng)時(shí)地觀察實(shí)施例1中使用的ctnt-gl4老鼠ips細(xì)胞的心肌分化過程中的ctnt的表達(dá)。

[第2實(shí)施方式]

對(duì)本發(fā)明的第2實(shí)施方式進(jìn)行說明。這里，對(duì)與第1實(shí)施方式的不同之處進(jìn)行說明，對(duì)相同部分標(biāo)注相同標(biāo)號(hào)并省略其說明。在第2實(shí)施方式中，也進(jìn)行反復(fù)進(jìn)行根據(jù)多個(gè)二維圖像生成三維圖像的三維圖像取得的縮時(shí)觀察。這里，例如每隔一定時(shí)間反復(fù)進(jìn)行相同處理，由此能夠進(jìn)行三維圖像的取得。在第2實(shí)施方式中，在為了取得三維圖像而進(jìn)行的一組二維圖像的取得中，每次取得三維圖像時(shí)，適當(dāng)變更二維圖像與二維圖像之間的z軸方向的間隔即拍攝間距。

參照附圖對(duì)二維圖像的z軸方向的間隔(拍攝間距)進(jìn)行說明。圖9示出取得三維試樣300的圖像的情況的示意圖。在圖9中，在三維試樣300的內(nèi)部包含示出發(fā)光的區(qū)域即第1關(guān)注區(qū)域301和第2關(guān)注區(qū)域302。例如，考慮一邊使物鏡142移動(dòng)而使合焦位置變化、一邊觀察三維試樣300的情況。該情況下，利用虛線示出取得圖像時(shí)的合焦面。即，設(shè)為在第1合焦面401、第2合焦面402、第3合焦面403、第4合焦面404、第5合焦面405和第6合焦面406分別取得二維圖像。圖右側(cè)利用“i”型記號(hào)示出根據(jù)此時(shí)的物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深得到圖像的范圍。這里，i字的高度表示焦深、即合焦的范圍。即，在第1合焦面401的攝像中取得第1范圍411的圖像。同樣，在第2合焦面402、第3合焦面403、第4合焦面404、第5合焦面405和第6合焦面406各自的攝像中，分別取得第2范圍412、第3范圍413、第4范圍414、第5范圍415和第6范圍416的圖像。

其結(jié)果，得到圖10示出示意圖那樣的圖像。即，得到第1范圍411、第2范圍412、第3范圍413、第4范圍414、第5范圍415和第6范圍416的圖像。另一方面，未得到圖10中網(wǎng)格所示的第1范圍411與第2范圍412之間的第1缺失區(qū)域421、第2范圍412與第3范圍413之間的第2缺失區(qū)域422、第3范圍413與第4范圍414之間的第3缺失區(qū)域423、第4范圍414與第5范圍415之間的第4缺失區(qū)域424以及第5范圍415與第6范圍416之間的第5缺失區(qū)域425的圖像。即，針對(duì)三維試樣300及其關(guān)注區(qū)域即第1關(guān)注區(qū)域301和第2關(guān)注區(qū)域302，未得到完整的圖像。

與此相對(duì)，與圖9所示的情況相比，圖11示出增加攝像次數(shù)、縮窄進(jìn)行攝像的合焦面的間隔的情況的示意圖。如圖11所示，在第1合焦面431、第2合焦面432、第3合焦面433、第4合焦面434、第5合焦面435、第6合焦面436、第7合焦面437、第8合焦面438、第9合焦面439、第10合焦面440和第11合焦面441分別取得二維圖像。這里，圖11所示的例如第1合焦面431與第2合焦面432的間隔比圖9所示的情況下的第1合焦面401與第2合焦面402的間隔窄。其結(jié)果，在分別合焦于第1合焦面431、第2合焦面432、第3合焦面433、第4合焦面434、第5合焦面435、第6合焦面436、第7合焦面437、第8合焦面438、第9合焦面439、第10合焦面440和第11合焦面441時(shí)得到圖像的范圍即第1范圍451、第2范圍452、第3范圍453、第4范圍454、第5范圍455、第6范圍456、第7范圍457、第8范圍458、第9范圍459、第10范圍460和第11范圍461之間沒有間隙。例如，第1范圍451和第2范圍452重疊。

其結(jié)果，得到圖12所示的圖像。即，針對(duì)三維試樣300及其關(guān)注區(qū)域即第1關(guān)注區(qū)域301和第2關(guān)注區(qū)域302，得到完整的圖像。另外，這里，示出各拍攝范圍相互重疊的情況的例子，但是，只要在拍攝范圍之間沒有間隔地相鄰即可，各拍攝范圍也可以不重疊。

在圖10所示的焦平面的間隔較寬的條件下得到的三維圖像中，信息不完整而成為不清楚的圖像，但是，所取得的二維圖像的數(shù)量較少，數(shù)據(jù)尺寸較小。另一方面，在圖12所示的焦平面的間隔較窄的條件下得到的三維圖像中，包含觀察對(duì)象的全部信息，成為高精細(xì)的圖像，但是，所取得的二維圖像的數(shù)量較多，數(shù)據(jù)尺寸較大。

這里，如圖12中虛線的矩形所示，在既不是第1關(guān)注區(qū)域301也不是第2關(guān)注區(qū)域302的區(qū)域470中，不需要較高的分辨率。因此，在本實(shí)施方式中，考慮不進(jìn)行圖12所示的第5范圍455和第7范圍457內(nèi)的二維圖像的取得。即，在本實(shí)施方式中，如圖13所示，即使產(chǎn)生第1缺失區(qū)域471和第2缺失區(qū)域472，為了減小數(shù)據(jù)尺寸，取得第1范圍451、第2范圍452、第3范圍453、第4范圍454、第6范圍456、第8范圍458、第9范圍459、第10范圍460和第11范圍461的圖像。

參照?qǐng)D14對(duì)本實(shí)施方式的攝像系統(tǒng)10的動(dòng)作的概略進(jìn)行說明。圖14示出隨著時(shí)間經(jīng)過而在哪個(gè)合焦面進(jìn)行攝像。即，圖14按照左圖(a)、中圖(b)、右圖(c)的順序示出時(shí)間經(jīng)過的情況。各圖中的水平的直線480分別示出進(jìn)行各拍攝時(shí)的合焦面。將進(jìn)行該拍攝時(shí)的合焦面稱為攝影面480。

首先，如圖14的左圖(a)那樣，在三維試樣300中不存在示出發(fā)光的應(yīng)該關(guān)注的區(qū)域的情況下，在三維試樣300的整體范圍內(nèi)將攝影面480的間隔設(shè)定為較寬。這里，攝影面480的間隔比物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深寬。

從這種狀態(tài)起，如圖14的中圖(b)那樣，在產(chǎn)生了第1關(guān)注區(qū)域301和第2關(guān)注區(qū)域302時(shí)，檢測到產(chǎn)生了第1關(guān)注區(qū)域301和第2關(guān)注區(qū)域302的區(qū)域。針對(duì)包含第1關(guān)注區(qū)域301和第2關(guān)注區(qū)域302的區(qū)域，將攝影面480的間隔設(shè)定為較窄，針對(duì)除此以外的區(qū)域，將攝影面480的間隔設(shè)定為較寬。這里設(shè)定為較窄的攝影面480的間隔與物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深相等、或比物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深窄。以后，將該焦深以下的間隔稱為第1間隔，將比焦深寬的間隔稱為第2間隔。

進(jìn)而，如圖14的右圖(c)那樣，在除了第1關(guān)注區(qū)域301和第2關(guān)注區(qū)域302以外還產(chǎn)生了第3關(guān)注區(qū)域時(shí)，檢測到包含第1關(guān)注區(qū)域301、第2關(guān)注區(qū)域302和第3關(guān)注區(qū)域303的區(qū)域。針對(duì)包含第1關(guān)注區(qū)域301、第2關(guān)注區(qū)域302和第3關(guān)注區(qū)域303的區(qū)域，將攝影面480的間隔設(shè)定為較窄的第1間隔，針對(duì)除此以外的區(qū)域，將攝影面480的間隔設(shè)定為較寬的第2間隔。并且，在關(guān)注區(qū)域消失時(shí)，針對(duì)該關(guān)注區(qū)域，將攝影面480的間隔從第1間隔變更為第2間隔。這樣，在本實(shí)施方式中，根據(jù)有無辨認(rèn)發(fā)光的關(guān)注區(qū)域，適當(dāng)變更攝影面的間隔。

參照流程圖對(duì)第2實(shí)施方式的攝像系統(tǒng)10的動(dòng)作進(jìn)行說明。圖15示出本實(shí)施方式的圖像取得處理的一例的概略。

在步驟s501中，控制部18進(jìn)行圖像取得的初始設(shè)定。在該初始設(shè)定中，例如包含取得圖像的z軸方向的范圍即圖像取得區(qū)域的設(shè)定、包含縮時(shí)拍攝中的圖像取得的時(shí)間間隔(拍攝間隔)的拍攝定時(shí)有關(guān)的設(shè)定等。

在步驟s502中，控制部18的拍攝條件決定部183進(jìn)行攝影面設(shè)定處理。攝影面設(shè)定處理是用于根據(jù)三維試樣中的發(fā)光的局部存在來設(shè)定取得二維圖像時(shí)的合焦面即攝影面的處理。即，拍攝條件決定部183設(shè)定攝影面的間隔。這樣，例如，拍攝條件決定部183作為如下的間隔設(shè)定部發(fā)揮功能：根據(jù)三維試樣中的發(fā)光的局部存在，設(shè)定取得具有相互不同的合焦面的多個(gè)二維圖像時(shí)的多個(gè)二維圖像相互的間隔。參照?qǐng)D16所示的流程圖對(duì)攝影面設(shè)定處理進(jìn)行說明。

在步驟s601中，拍攝條件決定部183針對(duì)該拍攝的上一次拍攝所取得的二維圖像，對(duì)亮度分布進(jìn)行解析。

在步驟s602中，拍攝條件決定部183根據(jù)步驟s601中得到的亮度分布，確定三維的關(guān)注區(qū)域的分布。

在步驟s603中，拍攝條件決定部183根據(jù)步驟s602中確定的關(guān)注區(qū)域的分布，設(shè)定圖像取得區(qū)域內(nèi)的攝影面。

另外，在初次的攝影面設(shè)定處理中，不存在作為上次的拍攝結(jié)果的二維圖像，所以，例如，在圖像取得區(qū)域整體范圍內(nèi)均等地以較寬的第2間隔設(shè)定攝影面。

這里，舉出攝影面的間隔設(shè)定為物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深以下即第1間隔的條件的例子。

例如如圖17所示，考慮某個(gè)攝影面中、一個(gè)較大區(qū)域305發(fā)光的情況。這里，設(shè)該發(fā)光的亮度值高于規(guī)定閾值的區(qū)域?yàn)槭境霭l(fā)光的區(qū)域，設(shè)該區(qū)域?yàn)楦吡炼葏^(qū)域。在高亮度區(qū)域的面積大于規(guī)定閾值時(shí)，針對(duì)該攝影面存在關(guān)注區(qū)域，攝像系統(tǒng)10能夠構(gòu)成為在該攝影面的附近使攝影面的間隔成為物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深以下的第1間隔。

并且，與上述情況不同，也可以如下構(gòu)成。即，例如如圖18所示，考慮某個(gè)攝影面中多個(gè)較小區(qū)域306發(fā)光的情況。設(shè)該發(fā)光的亮度值中的最高的亮度值為示出發(fā)光的亮度值，在該示出發(fā)光的亮度值高于規(guī)定閾值時(shí)，設(shè)為針對(duì)該攝影面存在關(guān)注區(qū)域。即，攝像系統(tǒng)10能夠構(gòu)成為在該攝影面的附近使攝影面的間隔成為物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深以下的第1間隔。

并且，也可以如下所述。即，在某個(gè)攝影面中，確定規(guī)定的區(qū)域作為關(guān)心區(qū)域，在該關(guān)心區(qū)域內(nèi)的亮度值的變化大于規(guī)定閾值時(shí)，針對(duì)該攝影面存在關(guān)注區(qū)域，攝像系統(tǒng)10能夠構(gòu)成為在該攝影面的附近使攝影面的間隔成為物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深以下的第1間隔。同樣，也可以在某個(gè)攝影面的整體的亮度值的變化大于規(guī)定閾值時(shí)，設(shè)為第1間隔。

進(jìn)一步參照?qǐng)D19和圖20對(duì)攝影面的設(shè)定進(jìn)行說明。在圖19和圖20中，左圖示出三維試樣300中的攝影面510的位置關(guān)系。圖19和圖20的左圖中的水平方向的多個(gè)虛線表示攝影面510。并且，在這些圖中示出在三維試樣300內(nèi)存在關(guān)注區(qū)域308的狀態(tài)。在圖19和圖20中，右圖示意地示出針對(duì)各攝影面480得到的二維圖像540。

圖19例如示出以第2間隔均等地配置在最初的圖像取得中設(shè)定的攝影面510的情況。即，在圖19中，等間隔地設(shè)定第1攝影面511、第2攝影面512、第3攝影面513、第4攝影面514、第5攝影面515。將第1攝影面511、第2攝影面512、第3攝影面513、第4攝影面514和第5攝影面515中得到的圖像分別設(shè)為第1圖像541、第2圖像542、第3圖像543、第4圖像544、第5圖像545。第3攝影面包含關(guān)注區(qū)域308，所以，第3圖像543包含使發(fā)光圖像化的亮區(qū)域549。

在圖19所示的例子中，拍攝條件決定部183通過步驟s601的圖像的亮度解析，確定第3圖像543包含亮區(qū)域549，在步驟s602中確定在攝影面510中的第3攝影面513的附近存在關(guān)注區(qū)域，在步驟s603中，在第3攝影面513的附近以較窄的間隔設(shè)定較多的攝影面。圖20示出這樣設(shè)定的攝影面510和這些攝影面510中得到的二維圖像540。

即，在圖20所示的例子中，除了第1攝影面511、第2攝影面512、第3攝影面513、第4攝影面514和第5攝影面515以外，還在第3攝影面513的附近設(shè)定第6攝影面516、第7攝影面517、第8攝影面518、第9攝影面519、第10攝影面520和第11攝影面521。這里，第6攝影面516、第7攝影面517、第8攝影面518、第3攝影面513、第9攝影面519、第10攝影面520和第11攝影面521的分別相鄰的攝影面的間隔例如比第1攝影面511與第2攝影面512的間隔即第2間隔窄，是比焦深窄的第1間隔。

其結(jié)果，在第1攝影面511、第2攝影面512、第6攝影面516、第7攝影面517、第8攝影面518、第3攝影面513、第9攝影面519、第10攝影面520、第11攝影面521、第4攝影面514和第5攝影面515中分別得到第1圖像551、第2圖像552、第3圖像553、第4圖像554、第5圖像555、第6圖像556、第7圖像557、第8圖像558、第9圖像559、第10圖像560和第11圖像561。這樣，得到與關(guān)注區(qū)域308有關(guān)的詳細(xì)的圖像數(shù)據(jù)。

另外，在圖20的例子中，在第3圖像553和第9圖像559中，關(guān)注區(qū)域308的發(fā)光未被拍攝。因此，也可以在下一次拍攝中，進(jìn)行攝影面的設(shè)定，以使得針對(duì)第3圖像553和第9圖像559的第6攝影面516和第11攝影面521不進(jìn)行圖像取得。

返回圖15繼續(xù)進(jìn)行圖像取得處理的說明。在步驟s502的攝影面設(shè)定處理之后，處理進(jìn)入步驟s503。在步驟s503中，控制部18考慮步驟s501中設(shè)定的縮時(shí)拍攝的定時(shí)，待機(jī)到拍攝開始為止。

在步驟s504中，控制部18的攝像控制部181進(jìn)行二維圖像取得處理。在二維圖像取得處理中，在步驟s502中設(shè)定的攝影面中取得一組二維圖像作為二維圖像組。參照?qǐng)D21所示的流程圖對(duì)二維圖像取得處理進(jìn)行說明。

在步驟701中，攝像控制部181將變量n設(shè)定為1。

在步驟702中，攝像控制部181在步驟s502的攝影面設(shè)定處理中設(shè)定的第n攝影面中設(shè)定合焦位置。即，攝像控制部181對(duì)物鏡光學(xué)系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)部16的動(dòng)作進(jìn)行控制，對(duì)物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的位置、例如物鏡142的位置進(jìn)行調(diào)整，調(diào)整為取得第n攝影面的圖像的狀態(tài)。

在步驟703中，攝像控制部181使攝像部15進(jìn)行攝像動(dòng)作，取得二維圖像。

在步驟704中，攝像控制部181將變量n設(shè)定為n+1。

在步驟705中，攝像控制部181判定步驟s502的攝影面設(shè)定處理中設(shè)定的全部攝影面中的圖像取得是否完成。在全部圖像取得未完成時(shí)，處理返回步驟s702。即，變更攝影面進(jìn)行二維圖像的取得。另一方面，在全部圖像取得完成時(shí)，二維圖像處理結(jié)束，處理返回參照?qǐng)D15說明的圖像取得處理。

在步驟s505中，控制部18的圖像合成部182根據(jù)步驟s504的二維圖像取得處理中取得的二維圖像，進(jìn)行三維圖像的生成。

在步驟s506中，控制部18根據(jù)步驟s501中設(shè)定的初始設(shè)定，判定是否需要進(jìn)行縮時(shí)拍攝的下一次的圖像取得。在需要進(jìn)行下一次的圖像取得時(shí)，處理返回步驟s502。即，在縮時(shí)拍攝的下一次的圖像取得的定時(shí)取得重新設(shè)定的攝影面的二維圖像，根據(jù)所得到的二維圖像取得三維圖像。另一方面，在步驟s506中判定為不需要進(jìn)行下一次的圖像取得時(shí)，圖像取得處理結(jié)束。

這樣，在設(shè)檢測到發(fā)光的關(guān)注區(qū)域的二維圖像為第1二維圖像、設(shè)其他二維圖像為第2二維圖像、設(shè)第1二維圖像和與該第1二維圖像相鄰的二維圖像之間的間隔為第1間隔、設(shè)第2二維圖像和與該第2二維圖像相鄰的第2二維圖像之間的間隔為第2間隔時(shí)，第1間隔比第2間隔窄。特別地，第1間隔為物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的景深以下。

另外，在本實(shí)施方式中，根據(jù)三維試樣300的發(fā)光的狀況，所取得的二維圖像的數(shù)量變化。因此，取得所設(shè)定的數(shù)量的二維圖像所需要的時(shí)間在進(jìn)行縮時(shí)拍攝的圖像取得處理中變化。因此，可能產(chǎn)生取得一組二維圖像所需要的時(shí)間比從該一組二維圖像的取得開始到下一組二維圖像的取得開始的時(shí)間長的情況。因此，優(yōu)選從一組二維圖像的取得開始到下一組二維圖像的取得開始的時(shí)間比在圖像取得區(qū)域的整個(gè)區(qū)域內(nèi)將攝影面與攝影面的間隔設(shè)定為比物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深窄的第1間隔時(shí)取得一組二維圖像所需要的時(shí)間長。

根據(jù)本實(shí)施方式，在未檢測到發(fā)光的狀態(tài)、即三維試樣300的內(nèi)部未引起應(yīng)該關(guān)注的事項(xiàng)的狀態(tài)下，將攝影面的間隔設(shè)定為比物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深大的第2間隔，重構(gòu)一個(gè)三維圖像所使用的二維圖像的數(shù)量減少。其結(jié)果，削減了數(shù)據(jù)尺寸。

在檢測到發(fā)光的狀態(tài)、即三維試樣300的內(nèi)部發(fā)生應(yīng)該關(guān)注的事項(xiàng)的狀態(tài)下，將攝影面的間隔設(shè)定為物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深以下的第1間隔，得到高精細(xì)的三維圖像。此時(shí)，針對(duì)未檢測到發(fā)光的區(qū)域、即三維試樣300的內(nèi)部未引起應(yīng)該關(guān)注的事項(xiàng)的區(qū)域，將攝影面的間隔設(shè)定為比物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深大的第2間隔，重構(gòu)一個(gè)三維圖像所使用的二維圖像的數(shù)量減少。其結(jié)果，削減了數(shù)據(jù)尺寸。

如上所述，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)尺寸的削減和充分必要的高精細(xì)數(shù)據(jù)雙方。其結(jié)果，能夠?qū)崿F(xiàn)快速且準(zhǔn)確的三維試樣的解析。

通過削減不必要數(shù)據(jù)而僅取得必要數(shù)據(jù)，能夠削減數(shù)據(jù)取得和此后的數(shù)據(jù)解析的時(shí)間。由此，例如在使用來自干細(xì)胞的擬胚體或球體的新藥研發(fā)中的藥效/毒性的評(píng)價(jià)以及來自干細(xì)胞的擬胚體針對(duì)各種細(xì)胞的分化過程的評(píng)價(jià)/監(jiān)視中，能夠順暢地進(jìn)行數(shù)據(jù)取得和數(shù)據(jù)解析，能夠執(zhí)行迅速的評(píng)價(jià)。特別地，在某個(gè)攝影面中指定的關(guān)注區(qū)域(roi)或攝影面整體的發(fā)光亮度的變化大于規(guī)定閾值的情況下，通過縮窄攝影面的間隔，能夠選擇性地增加與基因表達(dá)有關(guān)的信息。

[第2實(shí)施方式的第1變形例]

對(duì)第2實(shí)施方式的第1變形例進(jìn)行說明。這里，對(duì)與第2實(shí)施方式的不同之處進(jìn)行說明，對(duì)相同部分標(biāo)注相同標(biāo)號(hào)并省略其說明。在上述實(shí)施方式中，示出根據(jù)之前的圖像取得中得到的二維圖像來確定關(guān)注區(qū)域的分布的例子。但是不限于此。例如，如圖22所示的流程圖那樣，也可以以比針對(duì)關(guān)注區(qū)域以外的區(qū)域應(yīng)用的攝影面的間隔寬的間隔進(jìn)行二維圖像的取得，根據(jù)這里得到的二維圖像來確定關(guān)注區(qū)域的分布。

即，在步驟s801中，拍攝條件決定部183待機(jī)，以使得攝影面的設(shè)定在下一次二維圖像取得處理的開始之前結(jié)束，調(diào)整進(jìn)行下一次處理的定時(shí)。在步驟s802中，拍攝條件決定部183與攝像控制部181協(xié)作，在攝影面的間隔較寬的條件下取得二維圖像。該間隔例如可以是比第2間隔寬的第3間隔。將這里得到的一組二維圖像稱為評(píng)價(jià)用圖像組。拍攝條件決定部183對(duì)步驟s803中得到的評(píng)價(jià)用圖像組的二維圖像的亮度進(jìn)行解析，在步驟s804中確定關(guān)注區(qū)域的分布。在步驟s805中，拍攝條件決定部183根據(jù)關(guān)注區(qū)域的分布來設(shè)定攝影面。

根據(jù)本變形例，例如在縮時(shí)拍攝的間隔較長的情況下，也能夠進(jìn)行與當(dāng)前的三維試樣300的狀態(tài)對(duì)應(yīng)的攝影面的設(shè)定。

[第2實(shí)施方式的第2變形例]

對(duì)第2實(shí)施方式的第2變形例進(jìn)行說明。這里，對(duì)與第2實(shí)施方式的不同之處進(jìn)行說明，省略相同部分的說明。在上述實(shí)施方式中，根據(jù)關(guān)注區(qū)域的變化，所設(shè)定的攝影面的數(shù)量變化。但是，當(dāng)攝影面的數(shù)量變化時(shí)，一組二維圖像中包含的二維圖像的數(shù)量變化。與此相對(duì)，在本變形例中，預(yù)先決定攝影面的數(shù)量。即，在攝影面設(shè)定處理中，根據(jù)關(guān)注區(qū)域設(shè)定攝影面，以使得攝影面的總數(shù)稱為預(yù)先決定的數(shù)量。

根據(jù)本變形例，取得一組二維圖像所需要的曝光時(shí)間的合計(jì)沒有變化。其結(jié)果，防止縮時(shí)拍攝的間隔比取得一組二維圖像的時(shí)間短。

[第2實(shí)施方式的第3變形例]

對(duì)第2實(shí)施方式的第3變形例進(jìn)行說明。這里，對(duì)與第2實(shí)施方式的不同之處進(jìn)行說明，對(duì)相同部分標(biāo)注相同標(biāo)號(hào)并省略其說明。在上述實(shí)施方式中，示出如下的例子：攝影面的間隔在關(guān)注區(qū)域和除此以外的區(qū)域中，分別設(shè)定為物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深以下的第1間隔和比焦深寬的第2間隔。但是不限于此。攝影面的間隔也可以是多種，能夠適當(dāng)變更。但是，針對(duì)要觀察的亮度較高的區(qū)域、亮度的變化較大的區(qū)域等關(guān)注度較高的區(qū)域，攝影面的間隔設(shè)定為較窄，針對(duì)關(guān)注度較低的區(qū)域，攝影面的間隔設(shè)定為較寬。無論哪種情況下，攝影面的間隔可以比物鏡光學(xué)系統(tǒng)14的焦深窄。在本變形例中，能夠取得具有必要精細(xì)度且抑制了數(shù)據(jù)尺寸的三維圖像。

在以上的說明中，也可以對(duì)第1實(shí)施方式所述的拍攝間距和第2實(shí)施方式所述的拍攝間隔的調(diào)節(jié)進(jìn)行組合。并且，本發(fā)明不限于面向再生醫(yī)療的試樣，也可以應(yīng)用于要求縮時(shí)觀察每個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)的變化的各種試樣、例如invivo的試樣。進(jìn)而，由上述拍攝系統(tǒng)執(zhí)行的拍攝間距和/或拍攝間隔的調(diào)節(jié)也可以設(shè)計(jì)成，使用者一邊觀察上述拍攝系統(tǒng)的顯示畫面，一邊手動(dòng)變更拍攝條件。