本發(fā)明屬中藥材鑒別領(lǐng)域，涉及一種冬蟲夏草的鑒別方法，具體涉及一種紅外光譜技術(shù)鑒別冬蟲夏草的品質(zhì)或真?zhèn)蔚姆椒ā?/p>
背景技術(shù)：
冬蟲夏草為麥角菌科蟲草屬真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis Sacc.的子座及其寄主蝙蝠蛾科昆蟲蟲草蝙蝠蛾Hepialus armoricanus Oberthuk的幼蟲尸體的復(fù)合物,為我國名貴中藥材。主產(chǎn)于西藏、青海、四川、云南等海拔4000～5000m的高山草甸土中，系我國特產(chǎn)名貴中藥。冬蟲夏草中含有的化學(xué)成分有甾醇類、核苷類、多糖類、甘露醇、氨基酸等[1-2]，其中的核苷類具有明顯的藥理活性，具有改善心腦血液循環(huán)[3]、防止心律失常[4]、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性等作用。
目前市售的亞香棒蟲草、涼山蟲草、新疆蟲草、地蠶、霍克斯蟲草、白僵蠶、壓?！跋x草”冬蟲夏草的質(zhì)量并沒有得到保證，甚至出現(xiàn)了“假蟲草”，壓?！跋x草”，對人民群眾的健康造成了嚴(yán)重威脅。尋找一種簡便快速的鑒別手段顯得非常重要。
化學(xué)研究表明冬蟲夏草和蟲草代用品中含核苷類、多醇類、多糖,另外還含有機(jī)酸、維生素、無機(jī)元素及其它化合物,其中核苷類和醇類合物被認(rèn)為是冬蟲夏草及蟲草代用品中的活性化合物,被用來作用評價(jià)其質(zhì)量優(yōu)劣的指標(biāo)。
測定冬蟲夏草中蟲草素等核苷類物質(zhì)的含量,主要采用紫外分光光度法、薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)和毛細(xì)管電泳法。這些方法只能測定蟲草中的某一成份，測定速度慢。
紅外光譜分析技術(shù)近年來已成功應(yīng)用于食品、煙草、藥品及化工等諸多行業(yè)產(chǎn)品的分析測定，特別在農(nóng)副產(chǎn)品的定性分析上，因其快速、無需前處理、非破壞性及多組分同時(shí)定量分析等優(yōu)勢而得到廣泛的應(yīng)用。日本早在70年代就已將紅外光譜分析技術(shù)應(yīng)用于茶葉多種組分的定量分析，如茶多酚、咖啡堿、全氮量、粗纖維等的定量分析，并取得了良好的效果。
傅里葉變換紅外光譜技術(shù)在鑒別蟲草的真?zhèn)?、評判蟲草品質(zhì)方面，具有綜合、客觀、科學(xué)的特點(diǎn)。首先這種技術(shù)在分析鑒定時(shí)，無需對樣品進(jìn)行特別的處理，直接取樣測定，做到了不失樣品的原本性，也不破壞其組分；其次，測定的光譜圖中的峰位、峰形、峰強(qiáng)代表著體系中所含相應(yīng)各種基團(tuán)的譜峰，它反映的是一個(gè)混合物中各種成分的疊加譜圖，是測試樣品本質(zhì)的特征?；旌衔镏械慕M成、含量等因素的變化都會引起光譜整體譜圖的變化，根據(jù)這些宏觀特征，可以實(shí)現(xiàn)蟲草的快速鑒定與質(zhì)量控制。
D1公開了一種鑒別冬蟲夏草的方法，其核心思路是用多批次的冬蟲夏草建立紅外光譜模型，然后比較其他其他冬蟲夏草或混有不同雜質(zhì)的冬蟲夏草的紅外光譜，根據(jù)連續(xù)區(qū)間的紅外光譜的區(qū)別進(jìn)行鑒別冬蟲夏草。該發(fā)明能夠區(qū)分其所用各個(gè)測試樣本與標(biāo)準(zhǔn)曲線之間的差別，但是還不能夠進(jìn)行定量研究與定量判定。
D2公開了冬蟲夏草子座的紅外光譜分析鑒定方法，其核心思路是以過個(gè)產(chǎn)地各多份蟲草樣品的平均光譜繪制冬蟲夏草子座標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜，然后比較其他樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線中若干個(gè)峰值的差別，用以鑒別冬蟲夏草子座。該發(fā)明至少有如下不足之處：
(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線是混合樣品制備的，就必然會淹沒地區(qū)間與地區(qū)內(nèi)蟲草紅外光譜的差別。
(2)比較的是若干個(gè)點(diǎn)，就必然會忽略了更大波長范圍內(nèi)的吸光度。
(3)兩個(gè)樣品在不同波長下的光吸收差別往往是不一樣的，不同波長的光吸收差別用同一個(gè)比較標(biāo)準(zhǔn)也不客觀，樣本間離散程度最大的波長與樣本間離散程度最小的波長下均用平均值，則大大掩蓋了真實(shí)的差異程度。特別是，“在選取若干個(gè)峰位置中，通過判斷被測樣品光譜與冬蟲夏草子座標(biāo)準(zhǔn)光譜之間的顯著性水平為0.01時(shí)它們的相關(guān)系數(shù)在下限閾值0.95以上，則該被測樣品是真品冬蟲夏草子座”這樣的標(biāo)準(zhǔn)很不客觀。
D3與D4的核心與D2相同，技術(shù)構(gòu)思的主要差別在于測試的蟲草部位不同，也具有與D2相同的不足之處。
D5公開了一種快速鑒別蟲草菌絲體真?zhèn)蔚姆椒?，其核心?gòu)思路是比較待測樣品與空白的溴化鉀壓片的光譜差別，不能夠良好地比較不同的蟲草菌絲體，更不能良好地鑒定蟲草菌絲體真?zhèn)巍?/p>
本部分引用現(xiàn)有技術(shù)中的期刊：
[1]李進(jìn)，張文生，杜樹山，等.RP-HPLC法測定青海不同產(chǎn)地冬蟲夏草中核苷類成分的含量.中國藥房，2010年第21卷第3期,234-236
[2]金道山，江朝光，梅世昌，等.比色法測定冬蟲夏草中甘露醇的含量.藥物分析雜志，1998,18:120-122
[3]石巖，王鋼力，秦文杰，等.冬蟲夏草的化學(xué)成分綜述.中醫(yī)研究，2006,19(7):54-56
[4]周惠燕，陳鈺，等.冬蟲夏草中核苷類化學(xué)成分的含量測定研究進(jìn)展.中成藥，2011，11(33):1955-1958
本部分引用現(xiàn)有技術(shù)中的專利文獻(xiàn)：
D1：中國專利文獻(xiàn)，公開號：103499553公開日：2014.01.08；
D2：中國專利文獻(xiàn)，公開號：103698296公開日：2014.04.02；
D3：中國專利文獻(xiàn)，公開號：103760126公開日：2014.04.30；
D4：中國專利文獻(xiàn)，公開號：103674887公開日：2014.03.26；
D5：中國專利文獻(xiàn)，公開號：103105374公開日：2013.05.15；
總之，現(xiàn)有技術(shù)中標(biāo)準(zhǔn)品曲線方法中不能定量鑒定，用代表性點(diǎn)光吸收度進(jìn)行鑒定具有片面性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決至少上述技術(shù)問題，為了能夠定量鑒定多個(gè)冬蟲夏草樣品，獲知不同測試樣品與優(yōu)質(zhì)品之間通過關(guān)聯(lián)度來衡量的差別大小，本發(fā)明提供一種冬蟲夏草的鑒別方法，包括：
針對一種冬蟲夏草部位進(jìn)行如下步驟的處理：
步驟1)：對m種冬蟲夏草樣本進(jìn)行紅外光譜測定，測定的波數(shù)數(shù)量為n，記錄每個(gè)波數(shù)下的吸光度值，樣本的吸光度值稱樣本序列，其中m≥2，n≥10；
步驟2)：對于每個(gè)波數(shù)，比較不同冬蟲夏草樣本的吸光度值，將吸光度值的最大值定義為參考序列；
步驟3)：計(jì)算每個(gè)波數(shù)下，所述樣本序列和所述參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)；
步驟4)：計(jì)算所述樣本序列和所述參考序列的關(guān)聯(lián)度，所述關(guān)聯(lián)度為每個(gè)波數(shù)下所述樣本序列和所述參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)的算術(shù)平均數(shù)。
通過該方法，將多個(gè)波數(shù)下的吸光值進(jìn)行定量分析，就能夠克服基于光譜曲線分析方法中不能定量比較的缺點(diǎn)。
由于兩種冬蟲夏草樣品在不同波長下，其吸光度值的差別有明顯的不同，通過關(guān)聯(lián)度的計(jì)算，就能夠反映出兩個(gè)樣本的整體區(qū)別，而不是現(xiàn)有技術(shù)中片面地分析幾個(gè)典型波長下的吸光度值，這更有利于全面比較吸光度值的差別進(jìn)而更準(zhǔn)確地判斷所測試樣品的品質(zhì)。
在一些實(shí)施方案中，所用各個(gè)冬蟲夏草樣品的品質(zhì)鑒定方法如下：
所述關(guān)聯(lián)度為第一數(shù)值范圍r1，該冬蟲夏草樣本為優(yōu)質(zhì)冬蟲夏草；
所述關(guān)聯(lián)度為第二數(shù)值范圍r2，該冬蟲夏草樣本為劣質(zhì)冬蟲夏草；
所述關(guān)聯(lián)度為第三數(shù)值范圍r3，該冬蟲夏草樣本為假冬蟲夏草。
由于關(guān)聯(lián)度可以客觀地全面地反應(yīng)冬蟲夏草質(zhì)量與參考序列的差別，因此，根據(jù)冬蟲夏草的差別以及假冬蟲夏草的特性，可以通過不同關(guān)聯(lián)度范圍來判定優(yōu)質(zhì)冬蟲夏草、劣質(zhì)冬蟲夏草、假冬蟲夏草。
在一些實(shí)施方案中：
所述第一數(shù)值范圍為：0.7＜r1≤1；
所述第二數(shù)值范圍為：0.35＜r2≤0.7；
所述第三數(shù)值范圍為：r3≤0.35。
根據(jù)所用冬蟲夏草的部位不同，治療或保健等目的不同，上述數(shù)值范圍時(shí)可以調(diào)整的。
在一些實(shí)施方案中：
所述步驟2)中參考序列{Mir}的計(jì)算方法為：其中：
樣本序列矩陣為{Mij}，其中i＝1,2,…,n；j＝1,2,…,m；
參考序列為{Mir}，其中i＝1,2,…,n；
所述步驟3)中樣本序列{Mij}和參考序列{Mir}的關(guān)聯(lián)系數(shù)s(Mir,Mij)按下式計(jì)算：
其中，i＝1,2,…,n；j＝1,2,…,m；α為分辨系數(shù)，取0.5；
所述步驟4)中樣本序列{Mij}和參考序列{Mir}的關(guān)聯(lián)度計(jì)算式為：
在一些實(shí)施方案中：
所述冬蟲夏草部位為冬蟲夏草子座。
根據(jù)需要可以選用冬蟲夏草的其他部位或整株。
在一些實(shí)施方案中：
m＝3；n＝341。
根據(jù)需要，可以測定更多種冬蟲夏草，也可選擇其他波數(shù)范圍來測量。
在一些實(shí)施方案中：
選用果洛冬蟲夏草子座、剛察冬蟲夏草子座、祁連冬蟲夏草子座進(jìn)行紅外光測定。
根據(jù)需要，可以選用前提地區(qū)冬蟲夏草，也可選用假蟲草來測定。
在一些實(shí)施方案中：
所述步驟1)中：
待測品與KBr的比例為1∶100混合，研磨充分均勻，壓片測定；
采用Spectrum BXⅡ紅外光譜儀，掃描的波數(shù)范圍為4000～400cm-1，中紅外DGTS檢測器，掃描次數(shù)累加16次，分辨率4cm-1。
在一些實(shí)施方案中：
選取波數(shù)范圍850cm-1～1190cm-1進(jìn)行計(jì)算。
根據(jù)具體條件和測定目的，可以選用其他紅外光譜儀，采用其他測定條件。
在一些實(shí)施方案中：
針對第m+1種待測冬蟲夏草樣本，按照前m種冬蟲夏草樣本相同的處理方法，將所述第m+1種待測冬蟲夏草樣本的測試數(shù)據(jù)與所述前m種冬蟲夏草樣本的測試數(shù)據(jù)合并進(jìn)行計(jì)算與鑒別判斷。
本方法鑒別冬蟲夏草克服了現(xiàn)有技術(shù)中標(biāo)準(zhǔn)品曲線方法中不能定量鑒定的缺點(diǎn)以及用代表性點(diǎn)光吸收度的片面性。
具體實(shí)施方式
為了更好的解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，下面詳細(xì)介紹本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施例。以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的固定或限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)特征可以替換為具有在不背離發(fā)明構(gòu)思前提下等同或相似功能或效果的其他本領(lǐng)域已知的技術(shù)特征，本發(fā)明的不同模塊的任意組合均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)驗(yàn)材料
冬蟲夏草，采集自青海省果洛、剛察，祁連等不同地區(qū)。
實(shí)驗(yàn)儀器
Spectrum BXⅡ紅外光譜儀，PerkinElmer公司；
YP－2壓片機(jī)，上海山岳科學(xué)儀器有限公司。
試驗(yàn)方法
(1)壓片的制備
KBr壓片法制樣，待測品與KBr的比例為1∶100混合(1mg待測品和100mgKBr混合)研磨充分均勻，壓片測定。
(2)測試條件
光譜范圍(掃描的波數(shù)范圍)4000～400cm-1，中紅外DGTS檢測器，掃描次數(shù)累加16次，分辨率4cm-1。
(3)數(shù)據(jù)分析
分析軟件:采用Perkin－Elmer公司的定性分析軟件。
對比實(shí)施例與模型建立
1.吸光度值數(shù)據(jù)的測量
選用果洛蟲草子座、剛察蟲草子座、祁連蟲草子座，分別制作KBr壓片，測定波數(shù)范圍是400cm-1-4000cm-1,選取建模的波數(shù)范圍為850cm-1-1190cm-1，記錄該范圍內(nèi)每整數(shù)波數(shù)下的吸光度值。具體數(shù)值如表1所示。
2參考序列的選擇
為了使計(jì)算出的關(guān)聯(lián)度能夠評價(jià)不同地區(qū)冬蟲夏草的質(zhì)量，必須先選擇參考序列。假設(shè)有樣本序列矩陣{Mij}(i＝1,2,…,n；j＝1,2,…,m)。i代表某種蟲草樣品的波數(shù)數(shù)值的序列號，一共比較n個(gè)波數(shù)數(shù)值，j代表樣品的序列號，一共使用m種蟲草樣品。
其中參考序列的選擇是根據(jù)理論制高點(diǎn)的原理確定的，對于每個(gè)波數(shù)，比較不同蟲草樣品的吸光度值，吸光度值的最大值定義為參考序列，設(shè)參考序列為{Mir}，(i＝1,2,…,n)，其中
所以樣本和參考序列的關(guān)聯(lián)度越大，質(zhì)量越好。
其中：m＝3；n＝341。
3計(jì)算關(guān)聯(lián)系數(shù)
樣本序列{Mij}和參考序列{Mir}的關(guān)聯(lián)系數(shù)s(Mir,Mij)按下式計(jì)算：
其中(i＝1,2,…,n；j＝1,2,…,m)；α為分辨系數(shù)，取0.5。
4計(jì)算關(guān)聯(lián)度
樣本序列{Mij}和參考序列{Mir}的關(guān)聯(lián)度計(jì)算式為三種冬蟲夏草樣本和參考序列的關(guān)聯(lián)度參見表2。
5.樣本品質(zhì)的鑒定
所用各個(gè)冬蟲夏草樣品的品質(zhì)鑒定方法如下：所述關(guān)聯(lián)度為第一數(shù)值范圍r1，該冬蟲夏草樣本為優(yōu)質(zhì)冬蟲夏草；所述關(guān)聯(lián)度為第二數(shù)值范圍r2，該冬蟲夏草樣本為劣質(zhì)冬蟲夏草；所述關(guān)聯(lián)度為第三數(shù)值范圍r3，該冬蟲夏草樣本為假冬蟲夏草。
所述第一數(shù)值范圍為：0.7＜r1≤1；所述第二數(shù)值范圍為：0.35＜r2≤0.7；所述第三數(shù)值范圍為：r3≤0.35。
通過表1的2-4列的數(shù)據(jù)可以看出，在所列波數(shù)范圍內(nèi)，每種樣本的光吸收度值呈中間大兩端小的特點(diǎn)。7-8列的數(shù)據(jù)可以看出，在所列波數(shù)范圍內(nèi)，非參考序列與參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)呈中間小兩端大的特點(diǎn)，將上述五列數(shù)據(jù)中的端點(diǎn)和極值的典型數(shù)據(jù)摘抄出來，形成表3，更方便地看出所有數(shù)據(jù)的宏觀趨勢。
特定樣本在該波數(shù)范圍內(nèi)的吸光度值的最大值與最小值差別可以達(dá)到約零點(diǎn)五倍到一倍。非參考序列與參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)中最大值與最小值的差別也高達(dá)約零點(diǎn)五倍。
這可以說明，不同波長(或用波數(shù)來表示)下冬蟲夏草樣本的吸光度值差別很大，關(guān)聯(lián)系數(shù)也差別較大，所以不同波長下的吸光值用相同的判斷標(biāo)準(zhǔn)來區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)品與待測品是不夠客觀的，有必要用定量的方法研究與檢測蟲草。計(jì)算每個(gè)波數(shù)下的關(guān)聯(lián)系數(shù)可以定量研究。
為了更方便地表征測試的樣本與參考序列的差異，用關(guān)聯(lián)度可以綜合評價(jià)差異，進(jìn)而對測量樣本進(jìn)行品質(zhì)鑒定。
而本發(fā)明所用關(guān)聯(lián)度的概念可以從總體上對所測波長范圍內(nèi)的吸光度差別進(jìn)行衡量，克服了不同波長下一個(gè)樣本的吸光值的差別以及不同波長下樣本間吸光值的差別所帶來的比較的標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一?？梢钥朔萌舾蓚€(gè)點(diǎn)吸光度差值判斷冬蟲夏草質(zhì)量的片面性。另外，也能夠克服曲線法肉眼觀察的誤差和不能定量研究與測試的缺點(diǎn)。
表1樣本的吸光度值以及樣本和參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)
表2樣本和參考序列的關(guān)聯(lián)度
表3樣本的吸光度值以及樣本和參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)的典型數(shù)值
以上各個(gè)實(shí)施例只是用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，并不是用來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是基于本發(fā)明的構(gòu)思所作出的等同變換及對本發(fā)明的各個(gè)技術(shù)方案顯而易見的改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。