專利名稱：鑒別冬蟲夏草的特征性核苷酸序列和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法檢測中藥材的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是涉及一種用于鑒別冬蟲夏草的核苷酸序列以及核酸分子探針和用其鑒別冬蟲夏草的方法。
冬蟲夏草Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.是一種蟲生真菌，為我國傳統(tǒng)的珍貴藥材，具有很高的藥用價(jià)值。人們?cè)谒幍昀锍Ｒ姷降氖沁@種真菌的有性階段成熟的子實(shí)體，由真菌寄生于鱗翅目蝙蝠蛾Hepialus spp.幼蟲后所形成。主要分布于四川、云南、青海、甘肅、西藏等高海拔地區(qū)。由于冬蟲夏草分布海拔高，生長期長，對(duì)現(xiàn)有蟲草資源保護(hù)不利，因而貨源短缺，目前出現(xiàn)偽品較多，常見的有蛹蟲草，亞香棒蟲草等。冬蟲夏草性的溫、味甘、滋肺補(bǔ)腎、益精氣，《中國藥典》收載僅為冬蟲夏草一種；蛹草有抗菌作用，與冬蟲夏草功效完全不同。另外，迫于需求的壓力和自然資源的衰竭，目前有不少以冬蟲夏草或其它蟲草的無性發(fā)酵菌絲體代替其有性子實(shí)體階段生產(chǎn)各種“蟲草”成藥或保健品。但是，人們?cè)谂囵B(yǎng)冬蟲夏草菌時(shí)常常獲得種類完全不同的無性型種，有中國擬青霉，中國被毛孢，中國彎頸霉等，對(duì)冬蟲夏草無性型種的確定不同的學(xué)者持有不同的觀點(diǎn)，造成了冬蟲夏草藥材或成藥的混亂。
迄今為止，國際上有關(guān)冬蟲夏草人工培養(yǎng)及工業(yè)化生產(chǎn)方法等方面的研究和專利已有不少報(bào)道，但是尚未見有關(guān)于冬蟲夏草基因甑別的技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)的研究報(bào)道。隨著人們回歸大自然的潮流日益高漲，越來越多的人們關(guān)注傳統(tǒng)中醫(yī)藥。中藥要發(fā)展，就必須面向現(xiàn)代化和產(chǎn)業(yè)化，中藥現(xiàn)代化的核心內(nèi)容是中藥質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化。鑒于冬蟲夏草目前存在的問題及市場需求，采用新方法新技術(shù)快速準(zhǔn)確鑒定冬蟲夏草真?zhèn)?，指?dǎo)開發(fā)冬蟲夏草菌的工業(yè)化生產(chǎn)，對(duì)我國傳統(tǒng)中藥現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化和走向國際市場有著重要的意義。
本發(fā)明的目的是提供一種冬蟲夏草基因甄別標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)，它可以從遺傳本質(zhì)上客觀準(zhǔn)確地鑒別冬蟲夏草的真?zhèn)?。具體包括1、提供可作為基因甄別標(biāo)準(zhǔn)的用于鑒別冬蟲夏草的核苷酸序列；2、提供來源于上述核苷酸序列的冬蟲夏草專一性核酸分子探針；3、提供包含該核酸分子探針的用于鑒別冬蟲夏草的試劑盒；4、提供利用上述核苷酸序列、核酸分子探針或試劑盒鑒別冬蟲夏草的方法。
本發(fā)明的發(fā)明人在對(duì)冬蟲夏草及其它蟲草和相關(guān)真菌的研究中發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草的rDNA間隔區(qū)(非編碼區(qū))具有與其它蟲草及相關(guān)真菌完全不同的核苷酸序列，可作為冬蟲夏草特征性核苷酸序列，用于鑒別冬蟲夏草的真?zhèn)?。根?jù)該特征性核苷酸序列，可以設(shè)計(jì)制備出冬蟲夏草rDNA間隔區(qū)的專一性核酸分子探針，建立快速、準(zhǔn)確鑒別冬蟲夏草的分子生物學(xué)方法。
本發(fā)明提供的用于鑒別冬蟲夏草的核苷酸序列來源于冬蟲夏草的rDNA間隔區(qū)(即冬蟲夏草核糖體rRNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列，該序列的位置及結(jié)構(gòu)特征如


圖1和序列表1所示。
該序列(SEQ ID No 1)可通過如實(shí)施例1所述方法得到，或者按已知的該序列的核苷酸組成和排列，在商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀上按常規(guī)方法合成而得到。
本發(fā)明的冬蟲夏草專一性核酸分子探針是以上述的冬蟲夏草rDNA間隔區(qū)核苷酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)出來的。該核酸分子探針可以是來源于該冬蟲夏草rDNA間隔區(qū)核苷酸序列的全序列(即序列表1所示的序列)，或者是該序列中一段不少于18個(gè)核苷組成的寡核苷酸序列，或者是上述這些序列再經(jīng)修飾、變化，且其核苷酸變化量不超過總核苷酸量的5％的序列。
本發(fā)明特別優(yōu)選的冬蟲夏草專一性核酸分子探針為序列表2和序列表3所示的兩個(gè)序列(以下分別簡稱為probe1和probe2)。
本發(fā)明的上述冬蟲夏草專一性核酸分子探針，可按照預(yù)先根據(jù)冬蟲夏草rDNA間隔區(qū)序列設(shè)計(jì)好的序列，通過常規(guī)的DNA合成方法合成而得到(例如可以使用商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀進(jìn)行合成)。這些探針可以通過放射性同位素、酶、生物素、熒光劑或化學(xué)熒光素結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明上述的冬蟲夏草專一性核酸分子探針，具有極高的冬蟲夏草專一性，能與冬蟲夏草專一性反應(yīng)，但不與其它蟲草或相關(guān)真菌的DNA發(fā)生反應(yīng)。所以，利用該核酸分子探針，通過PCR方法或核酸分子雜交法可以快速、準(zhǔn)確的鑒別冬蟲夏草(包括冬蟲夏草蟲體、菌絲體、蟲草中成藥及系列保鍵品的甄別)。
另外，由于rDNA間隔區(qū)高變的特性，不同產(chǎn)地的冬蟲夏草在其rDNA間隔區(qū)核苷酸序列上也表現(xiàn)出差異，即rDNA間隔區(qū)的核苷酸序列的差別可以反映出不同冬蟲夏草菌之間的親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近(即親緣關(guān)系越近，這種差別越小，道地性也越高，反之亦然)。因此，本發(fā)明所提供的冬蟲夏草rDNA間隔區(qū)序列和專一性核酸分子探針還可用于冬蟲夏草道地性的檢測。
本發(fā)明還提供一種由冬蟲夏草專一性核酸分子探針和相關(guān)的PCR引物及試劑組成的冬蟲夏草鑒定試劑盒，可用于方便快速地鑒別冬蟲夏草的真?zhèn)?。該試劑盒具體包括a、二個(gè)如前所述的冬蟲夏草專一性核酸分子探針(同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)；b、三對(duì)PCR引物以上述二個(gè)核酸分子探針為一對(duì)引物，上述二個(gè)核酸探針分別與另一個(gè)真菌通用PCR引物配對(duì)為另二對(duì)引物；c、冬蟲夏草微量樣品DNA制備試劑包括提取緩沖液、玻璃粉、碘化鈉和洗液。
上述試劑盒中的二個(gè)核酸分子探針最好為probe1和probe2；與該二個(gè)核酸分子探針配對(duì)的真菌通用PCR引物可以是LH2(5’TAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA 3’)和D1a(5’TTCCCTGTTCACTCGCCGTTACT3’)；樣品DNA制備試劑中的提取緩沖液成分為0.5～3％SDS、5～10mM EDTA(pH7.5～8.5)、10mM Tris-HCl(pH7.5～8.5)、10mM NaCl，洗液成分為84mM Tris-HCl、40μM EDTA、60％乙醇、80mM KAc。
利用上述試劑盒，按照常規(guī)的PCR方法即可方便快速地鑒別冬蟲夏草。
本發(fā)明所提供的冬蟲夏草鑒別方法，可采用核酸分子雜交法或PCR方法，分述如下核酸分子雜交法采用前面所述的本發(fā)明的核酸分子探針，以通用的核酸分子雜交方式(例如Southern雜交或點(diǎn)雜交)，對(duì)冬蟲夏草進(jìn)行檢驗(yàn)鑒定。具體步驟和過程(包括探針的標(biāo)記和待測樣品的預(yù)處理)，按常規(guī)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行。
該方法可以對(duì)冬蟲夏草商品干藥材、工業(yè)化發(fā)酵的冬蟲夏草菌、中成藥制品或保健品樣品直接檢測，也可以先將樣品中的冬蟲夏草DNA提取擴(kuò)增，再加以檢驗(yàn)。
PCR方法以二個(gè)前面所述的本發(fā)明的核酸分子探針為一組PCR引物，或者以該二個(gè)核酸分子探針分別與另一個(gè)真菌通用PCR引物配對(duì)，進(jìn)行PCR反應(yīng)。具體步驟、過程按常規(guī)PCR方法的操作過程進(jìn)行。
上述PCR方法中的PCR引物可以按如下選擇設(shè)置①以真菌18S rRNA編碼區(qū)3’末端保守區(qū)設(shè)置一個(gè)真菌通用PCR引物L(fēng)H2，然后以rDNA間隔區(qū)冬蟲夏草專一性寡核苷酸探針probe 2作為另一引物進(jìn)行配對(duì)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約550bp長。
②以rDNA間隔區(qū)冬蟲夏草專一性探針probe1作為一個(gè)引物，然后在25S rRNA編碼區(qū)5’末端保守區(qū)另設(shè)置一個(gè)真菌通用引物D1a，probe1/D1a配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物約550bp長。
③以冬蟲夏草專一性寡核苷酸探針probe1和probe2作為引物進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物約400bp。
采用該P(yáng)CR方法可快速、準(zhǔn)確地檢測鑒別冬蟲夏草，而且樣品用量少。
本發(fā)明具有如下有益效果①蟲草rDNA中非編碼區(qū)(間隔區(qū))是一個(gè)高變區(qū)，不同蟲草類群的rDNA間隔區(qū)結(jié)構(gòu)差別很大，這種差別還可以反映不同蟲草菌之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近(即親緣關(guān)系越近，差別越小，道地性越高，反之亦然)。按照本發(fā)明所提供的冬蟲夏草rDNA間隔區(qū)序列，根據(jù)被檢樣品序列中核苷酸的變化大小(標(biāo)準(zhǔn)為核苷酸變化范圍0.00～5％)判別樣品的道地性，并可計(jì)算機(jī)化、儀器化，具有客觀、精確、自動(dòng)化等特點(diǎn)。
②所提供的冬蟲夏草核酸分子探針為冬蟲夏草(包括天然冬蟲夏草蟲體階段和人工培養(yǎng)的蟲草菌絲體階段)的專一性序列，因此在樣品未知的前提下，可通過檢測樣品中是否存在與此相同的核苷酸序列，快速方便地檢測樣品的真?zhèn)巍?br> ③由于PCR方法的應(yīng)用，使得該方法更加簡單化，通常只須少量樣品，如挑取數(shù)個(gè)子囊孢子或少量菌核組織或菌絲體便可達(dá)到要求，而不需要大量提取DNA，另外，還可對(duì)冬蟲夏草中草藥成藥(粉劑或片劑)及蟲草保健品進(jìn)行檢測。
圖1是核糖體rRNA基因結(jié)構(gòu)示意圖，其中的ITS1和ITS2為本發(fā)明所涉及的多核苷酸序列(rDNA間隔區(qū)序列)；圖2是冬蟲夏草rDNA間隔區(qū)多核苷酸序列(rRNA基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列)結(jié)構(gòu)示意圖，其中帶上劃線的黑體部分(142bp～163bp和506bp～485bp)分別為本發(fā)明的冬蟲夏草專一性寡核苷酸分子探針probe1和probe2；圖3是實(shí)施例4的PCR結(jié)果示意圖，其中1為空白對(duì)照，2為2kb分子量梯度，3為天然冬蟲夏草蟲體，4為人工培養(yǎng)冬蟲夏草菌(中國被毛孢)，5為蛹蟲草，6為古尼蟲草，7為中國擬青霉；圖4是實(shí)施例5的PCR擴(kuò)增結(jié)果示意圖，其中1為空白對(duì)照，2為2kb分子量梯度，3為天然冬蟲夏草蟲體，4為人工培養(yǎng)冬蟲夏草菌(中國被毛孢)，5為蛹蟲草，6為古尼蟲草，7為中國擬青霉。
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明實(shí)施例1冬蟲夏草rDNA間隔區(qū)多核苷酸序列的制備取冬蟲夏草樣品0.1-0.5g于研缽中，加液氮研磨至粉末狀，分裝入1.5ml提取緩沖液中(1％SDS，10mM EDTA pH 8.0，10mM Tris-HCl pH 7.6)的小指管中，搖均，65℃保溫0.5-2小時(shí)，離心(8000rpm/min)，取上清，轉(zhuǎn)入新指管，加3M NaAc和等體積異丙醇沉淀15分鐘，離心(10000rpm/min，10min)，傾去上清，沉淀晾干，加入50-100μl TE(Tris-HCl，10mM，EDTA，1mM，pH 7.8)溶解，獲得冬蟲夏草總DNA。取1個(gè)0.5ml小指管，加入100微升PCR反應(yīng)液(100微升PCR反應(yīng)液成份10×TaqDNA聚合酶緩沖液10微升；2mM dNTP溶液10微升；引物為LH2 0.5微克；引物為D1a 0.5微克；TaqDNA聚合酶2.5單位，加無菌水定容至100微升)。然后加入獲取的冬蟲夏草總DNA1微升，加50微升礦物油，放于PCR儀上，按下列程序進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃ 5min，94℃、55℃和72℃各1min，30個(gè)循環(huán)，然后是72℃5min。反應(yīng)完成后，除去礦物油，用PCR純化試劑盒(QIAGEN，Germany)純化PCR產(chǎn)物，得到所需核苷酸序列。純化后的PCR產(chǎn)物于商業(yè)化的DNA自動(dòng)測序儀上測定，獲得如序列表1的核苷酸組成與排列。
實(shí)施例2probe1和probe2的制備在獲得冬蟲夏草rDNA間隔區(qū)核苷酸序列的基礎(chǔ)上，將所得序列與其它蟲草或真菌同源序列進(jìn)行排列比較，得出probe1和probe2(如圖2所示的142bp-163bp和506bp-485bp)的核苷酸組成和排列是用于冬蟲夏草鑒別的最佳寡核苷酸片段。根據(jù)probe1和probe2的核苷酸組成和排列，在商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀上進(jìn)行化學(xué)合成，即可獲得如序列表2和序列表3所示的核苷酸序列。
實(shí)施例3 冬蟲夏草微量樣品DNA的制備用牙簽挑取冬蟲夏草蟲體少量子囊孢子或少量菌核組織，或少量無性菌絲體→放入含適量提取緩沖液(0.5-3％SDS，5-10mM EDTA(pH7.5-8.5)，10mM Tris-HCl(pH7.5-8.5)，10mM NaCl)的0.5微升小指管中→震蕩→加入1ul玻璃粉和60微升6M NaI→離心→棄上清→加入100ul洗液(84mMTris-HCl，40uMEDTA，60％乙醇，80mMKAc)，離心→棄上清→沉淀涼干，備用。
實(shí)施例4 冬蟲夏草的鑒別(常規(guī)PCR方法)(1)樣品預(yù)處理(待檢測的樣品處理，可采用下列方法I或方法II)方法I.取樣品0.1～0.5克于研缽中，加液氮研磨至粉末狀，分裝入含有1.5毫升提取緩沖液(1％SDS，10mM EDTA pH8.0，10mM Tris-Hcl pH7.6)的小指管中，搖均，65℃保溫0.5～2小時(shí)，離心(8000轉(zhuǎn)/分鐘)，取上清，移入新管，加3M NaAc和等體積異丙醇沉淀15分鐘，離心(10000轉(zhuǎn)/分，10分鐘)，傾去上清，沉淀涼干后加入50～100微升TE(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，pH 7.8)溶解。
方法II.用牙簽挑取少量樣品(例如冬蟲夏草蟲體的少量孢子或少量菌核組織，或少量無性菌絲體)，放入含20微升提取緩沖液中(緩沖液成份同方法I)，搖均，用DPS純化試劑[包括玻璃粉，6M NaI，洗液(84mMTris-HCl，40uMEDTA，60％乙醇，80mMKAc)]純化后，涼干、備用。
(2)100微升PCR混合液中成份冬蟲夏草專一性探針Probe1 0.5微克冬蟲夏草專一性探針Probe2 0.5微克10×Taq DNA聚合酶緩沖液10微升2mMdNTP溶液10微升TaqDNA聚合酶 2.5單位以上用無菌水定容為100微升(3)PCR操作取7個(gè)0.5毫升小指管，分別加入20微升PCR混合液，然后分別加入樣品DNA，其中一個(gè)管僅加PCR混合液20微升(對(duì)照)。各管中加50微升礦物油， 放于PCR儀上，按下列程序進(jìn)行PCR反應(yīng)94℃ 5分鐘，94℃、55℃和72℃各1分鐘，并且連續(xù)循環(huán)30次，然后72℃ 5分鐘。反應(yīng)完成后，每管加入5微升載樣液(30％Fcol，0.25％溴酚蘭)。取4微升點(diǎn)樣于2％的瓊脂糖凝膠中，電泳結(jié)果如圖3所示。
圖3的結(jié)果清楚地顯示采用引物Probe1/Probe2進(jìn)行PCR檢測，天然冬蟲夏草有性蟲體階段和人工培養(yǎng)的冬蟲夏草菌(中國被毛孢)都為陽性反應(yīng)，而古尼蟲草，蛹蟲草等其它蟲草相關(guān)的無性型菌株為陰性反應(yīng)，說明了該引物組合的專一性。
本方法具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)簡便快速。常規(guī)DNA制備需1至數(shù)小時(shí)，該方法在樣品預(yù)處理時(shí)若采用“方法II”只需20～30分鐘即可(擴(kuò)增時(shí)間除外)。
(2)樣品用量少，僅需少量樣品就可以完成整個(gè)操作，不影響樣品的完整性。
(3)準(zhǔn)確、靈敏度高，probe1和probe2為冬蟲夏草專一性核酸分子探針，若為偽品，為陰性反應(yīng)。
(4)不使用有毒試劑。
實(shí)施例5 冬蟲夏草的鑒別(參照引物法)(1)二種真菌rDNA間隔區(qū)PCR通用引物L(fēng)H25’TAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA 3’、D1a5’TTCCCTGTTCACTCGCCGTTACT3’均用DNA自動(dòng)合成儀合成，所有引物或探針溶于TE(Tris-HCl 10mM，EDTA 1mM，pH7.8)溶液，濃度為0.5微克/微升。
(2)樣品預(yù)處理同實(shí)施例1。
(3)100微升PCR混合液配制冬蟲夏草專一性探針Probe1 0.5微克冬蟲夏草專一性探針Probe2 0.5微克真菌rDNA間隔區(qū)PCR通用引物L(fēng)H2 0.5微克真菌rDNA間隔區(qū)PCR通用引物D1a 0.5微克10×Taq DNA聚合酶緩沖液 10微升2mMdNTP溶液 10微升Taq DNA聚合酶 2.5單位以上用無菌水定容為100微升(4)PCR操作同實(shí)施例1，結(jié)果如圖4所示。
從圖4的結(jié)果可以清楚地看出采用參照引物PCR方法檢測，天然冬蟲夏草有性蟲體階段和人工培養(yǎng)的冬蟲夏草菌(中國被毛孢)有3條PCR擴(kuò)增帶，而古尼蟲草、蛹蟲草、中國擬青霉等其它蟲草相關(guān)的無性型菌株僅有1條擴(kuò)增帶，從而清晰、準(zhǔn)確、快速地鑒別冬蟲夏草及相關(guān)的蟲草菌。
序列表11.序列特征長度615bp，類型核酸，鏈數(shù)雙鏈，幾何結(jié)構(gòu)線性；2.分子類型核糖體DNA3.來源冬蟲夏草4.序列描述SEQ ID No.1GTAGGTGAAC CTGCGGAAGG ATCCTTATCG AGTCACCACT CCCAAACCCC CTGCGAACACCACAGCAGTT GCCTCGGCGG GACCGCCCCG GCGCCCCAGG GCCCGGACCA GGGCGCCCGCCGGAGGACCC CCAGACCCTC CTGTCGCAGT GGCATCTCTC AGTCAAGAAG CAAGCAAAGGAATCAAAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG TTCTGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAATGCGATAAGTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG TGAACCATCG AATCTTTGAA CGCACATTGCGCCCGCCAGC ACTCTGGCGG GCATGCCTGT CCGAGCGTCA TCTCAACCCT CGAGCCCCCCGCCTCGCGGC GGCGGGGCCC GGCCTTGGGG GTCACGGCCC CGCGCCGCCC CCTAAACGCAGTGGCAACCC CGCCGCGGCT CCCCTGCGCA GTAGCTCGCT GAGAACCTCG CACCGGGAGCGCGGAGGCGG TCACGCCGTG AAACCACCAC ACCCTCCAGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGGATACCCGCTG AACTTAAGCA TATCAATAAG CGGAGGAAAA GAAACCAACA GGGATTGCCCCAGTAACGGC GAGTG序列表21.序列特征長度22bp，類型核酸，鏈數(shù)單鏈，幾何結(jié)構(gòu)線性；2.分子類型DNA3.來源冬蟲夏草4.序列描述SEQ ID No.2TGTCGCAGTG GCATCTCTCA GT序列表31.序列特征長度22bp，類型核酸，鏈數(shù)單鏈，幾何結(jié)構(gòu)線性；2.分子類型DNA3.來源冬蟲夏草4.序列描述SEQ ID No.3TGGTTTCACG GCGTGACCGC CT
權(quán)利要求
1.一種用于鑒別冬蟲夏草的核苷酸序列，其特征是該序列來源于冬蟲夏草rDNA間隔區(qū)的核苷酸序列，具體序列為GTAGGTGAAC CTGCGGAAGG ATCCTTATCG AGTCACCACT CCCAAACCCC CTGCGAACACCACAGCAGTT GCCTCGGCGG GACCGCCCCG GCGCCCCAGG GCCCGGACCA GGGCGCCCGCCGGAGGACCC CCAGACCCTC CTGTCGCAGT GGCATCTCTC AGTCAAGAAG CAAGCAAAGGAATCAAAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG TTCTGGCATC GATGAAGAAC GCAGCGAAATGCGATAAGTA ATGTGAATTG CAGAATTCAG TGAACCATCG AATCTTTGAA CGCACATTGCGCCCGCCAGC ACTCTGGCGG GCATGCCTGT CCGAGCGTCA TCTCAACCCT CGAGCCCCCCGCCTCGCGGC GGCGGGGCCC GGCCTTGGGG GTCACGGCCC CGCGCCGCCC CCTAAACGCAGTGGCAACCC CGCCGCGGCT CCCCTGCGCA GTAGCTCGCT GAGAACCTCG CACCGGGAGCGCGGAGGCGG TCACGCCGTG AAACCACCAC ACCCTCCAGT TGACCTCGGA TCAGGTAGGGATACCCGCTG AACTTAAGCA TATCAATAAG CGGAGGAAAA GAAACCAACA GGGATTGCCCCAGTAACGGC GAGTG
2.一種以權(quán)利要求1的核苷酸序列為基礎(chǔ)而設(shè)計(jì)的冬蟲夏草專一性核酸分子探針，其特征是該核酸分子探針來源于權(quán)利要求1所述核苷酸序列的全序列或其中一段不少于18個(gè)核苷酸的寡核苷酸序列，或者上述序列經(jīng)修飾、變化，且其核苷酸變化量不超過5％的序列。
3.按照權(quán)利要求2所述的核酸分子探針，其特征是其核苷酸序列為probe15’TGTCGCAGTGGCATCTCTCAGT 3’或probe25’TGGTTTCACGGCGTGACCGCCT 3’。
4.一種冬蟲夏草鑒定試劑盒，其特征是該試劑盒包括2個(gè)如權(quán)利要求2或3所述的核酸分子探針、3對(duì)PCR引物及冬蟲夏草微量樣品DNA制備試劑；該3對(duì)PCR引物分別為權(quán)利要求3所述的核酸分子探針probe1和probe2配對(duì)構(gòu)成一對(duì)引物，probe1和probe2分別與真菌通用PCR引物L(fēng)H25’CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCA3’和D1a5’TTCCCTGTTCACTCGCCGTTACT3’配對(duì)構(gòu)成另二對(duì)引物；該微量樣品DNA制備試劑包括提取緩沖液、玻璃粉、NaI和洗液，該提取緩沖液的組成為0.5-3％SDS、5-10mM EDTA(pH7.5-8.5)、10mM Tris-HCl(pH 7.5-8.5)和10mM NaCl，該洗液的組成為84mM Tris-HCl、40uM EDTA、60％乙醇、80mM Kac。
5.一種冬蟲夏草鑒別方法，其特征是采用權(quán)利要求2或3所述的核酸分子探針，以通用的核酸分子探針雜交方法進(jìn)行檢驗(yàn)鑒定，具體步驟和過程按常規(guī)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行。
6.一種冬蟲夏草的鑒別方法，其特征是采用PCR方法，以2個(gè)如權(quán)利要求2或3所述的核酸分子探針為一組PCR引物或者以該二個(gè)核酸分子探針分別與另一個(gè)真菌通用PCR引物配對(duì)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，其步驟和過程按常規(guī)PCR方法進(jìn)行。
7.按照權(quán)利要求6所述的方法，其特征是所說的二個(gè)核酸分子探針為權(quán)利要求3所述的probe1和probe2，所說的真菌通用PCR引物為權(quán)利要求4所述的LH2和D1a。
全文摘要
本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法檢測中藥材的技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了冬蟲夏草rDNA間隔區(qū)核苷酸序列及來源于該序列的核酸分子探針和包含該探針的冬蟲夏草鑒定試劑盒,以及利用該序列、探針或試劑盒鑒別冬蟲夏草的方法。利用本發(fā)明,可方便、快速、準(zhǔn)確地鑒別冬蟲夏草(包括商品藥材、菌絲體和系列保健品等),還可判別樣品的道地性,并且可以計(jì)算機(jī)化、儀器化,具有客觀、準(zhǔn)確、自動(dòng)化等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1274010SQ00114160
公開日2000年11月22日 申請(qǐng)日期2000年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月24日
發(fā)明者陳月琴, 王寧, 屈良鵠, 李泰輝 申請(qǐng)人:中山大學(xué)