本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于化學(xué)標(biāo)記技術(shù)的蛋白質(zhì)同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其他生命學(xué)科常涉及的分析內(nèi)容，在生化實驗中，對樣品中的蛋白質(zhì)進行準(zhǔn)確可靠的定量分析，是經(jīng)常進行的一項非常重要的工作。但是，由于蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子，它的種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來了許多具體的因難。

現(xiàn)有蛋白質(zhì)的定量方法主要是基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法，為了控制、降低由于檢測過程中帶來的誤差，可以在樣品制備、檢測過程中，加入內(nèi)標(biāo)。對于質(zhì)譜來說，最理想的內(nèi)標(biāo)為同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)，因為內(nèi)標(biāo)與被測物的理化性質(zhì)完全一樣，可以用于評估和校正前處理、色譜分離和離子化環(huán)節(jié)的誤差。在質(zhì)譜分離中，內(nèi)標(biāo)和被測物有顯著的分子量(質(zhì)合比)的差異，不會產(chǎn)生相互干擾。

其中蛋白質(zhì)組學(xué)中最常用的標(biāo)記技術(shù)是基于多肽層面的，它的目標(biāo)在于通過一次操作，能夠?qū)λ械鞍踪|(zhì)酶解多肽進行標(biāo)記，通過標(biāo)記物的同位素形式不同，可以在質(zhì)譜中將多種多肽/蛋白質(zhì)進行區(qū)分，現(xiàn)有技術(shù)中在多肽層面的標(biāo)記方法包括二甲基法、iTRAQ法、TMT法、ICAT法等，可參見圖1。現(xiàn)有基于多肽層面的標(biāo)記方法進行標(biāo)記時，存在許多不足，例如第一，多肽層面的標(biāo)記方法使得兩個樣品在酶解之后混合，酶解前(提取、凈化、還原、烷基化)的所有誤差均無法得到校正，降低檢測結(jié)果的精確度。第二，雖然其中iTRAQ法、TMT法、ICAT法三者均已有商品化試劑，但是商品化的標(biāo)記試劑約為1000～3000元/反應(yīng)，價格昂貴。

蛋白質(zhì)的同位素標(biāo)記技術(shù)還包括SILAC技術(shù)，其中SILAC蛋白質(zhì)的生產(chǎn)步驟主要分成兩步：(1)將目標(biāo)蛋白基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中；(2)將大腸桿菌在同位素標(biāo)記的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，使其表達同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)。SILAC同位素蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)具有完全一致的一級結(jié)構(gòu)，理化結(jié)構(gòu)相近，可以在樣品提取前加入SILAC蛋白質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，用于校正樣品處理、檢測過程中的全過程誤差。但是SILAC技術(shù)存在以下不足：(1)SILAC蛋白合成的價格昂貴，據(jù)SILAC合成企業(yè)的估價，大約10mg SILAC蛋白質(zhì)需要20萬歐元左右，大約滿足數(shù)百到一千次樣品的檢測需求，折合每次檢測200～400歐元左右；(2)SILAC蛋白質(zhì)的生產(chǎn)基于轉(zhuǎn)基因表達技術(shù)，由于現(xiàn)有技術(shù)限制，不是所有的蛋白質(zhì)均能成功通過該技術(shù)表達出來；(3)正常表達的蛋白質(zhì)在表達完成后，會進行表達后修飾和蛋白質(zhì)折疊，而轉(zhuǎn)基因表達的蛋白質(zhì)不會進行這兩個步驟，所以轉(zhuǎn)基因表達的蛋白質(zhì)在空間結(jié)構(gòu)上與正常表達蛋白質(zhì)有顯著區(qū)別。

由上述可知，現(xiàn)有蛋白質(zhì)的同位素標(biāo)記技術(shù)依然存在價格昂貴，操作繁瑣，操作過程中存在一定的誤差等諸多不足。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種基于化學(xué)標(biāo)記技術(shù)的蛋白質(zhì)同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，使得操作過程中產(chǎn)生的誤差得以校正，而且操作方便，成本較低。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種基于化學(xué)標(biāo)記技術(shù)的蛋白質(zhì)同位素稀釋串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，包括以下步驟：

(1)采用化學(xué)標(biāo)簽A對待測樣品進行標(biāo)記，得到標(biāo)記樣品；

(2)采用帶同位素標(biāo)記的化學(xué)標(biāo)簽iso-A對內(nèi)標(biāo)物進行標(biāo)記，得到標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物；

(3)將所述標(biāo)記樣品與標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物按照預(yù)設(shè)比例混勻，得到初樣；

(4)對初樣進行預(yù)處理，得到進樣樣品；

(5)將所述進樣樣品進行檢測。

本發(fā)明中化學(xué)標(biāo)簽A與化學(xué)標(biāo)簽iso-A為相同的標(biāo)記物質(zhì)，化學(xué)標(biāo)簽iso-A與化學(xué)標(biāo)簽A的不同之處在于，化學(xué)標(biāo)簽iso-A與化學(xué)標(biāo)簽A上的其中一種或多種化學(xué)元素互為同位素。

本發(fā)明的標(biāo)記方法基于蛋白質(zhì)層面，本發(fā)明將待測樣品和內(nèi)標(biāo)物分別采用化學(xué)標(biāo)簽A和帶同位素標(biāo)記的化學(xué)標(biāo)簽iso-A標(biāo)記后，再將兩者混合并置于同一反應(yīng)體系下進行后續(xù)的處理工作，使得待測樣品和內(nèi)標(biāo)物在同一體系中所受到的基質(zhì)效應(yīng)、操作誤差均相同，使得誤差可以得以校正。

天然蛋白質(zhì)具有一定的空間結(jié)構(gòu)，形成或疏或密的三維結(jié)構(gòu)。作為優(yōu)選，所述步驟(1)中采用化學(xué)標(biāo)簽A對待測樣品進行標(biāo)記之前，將待測樣品進行蛋白質(zhì)變性處理。經(jīng)由蛋白質(zhì)變性處理可以破壞蛋白質(zhì)中固定其空間結(jié)構(gòu)的鍵，使結(jié)構(gòu)松散，可以使得化學(xué)標(biāo)簽結(jié)合位點暴露出來，讓化學(xué)標(biāo)簽A易于接觸到其結(jié)合位點，增加化學(xué)標(biāo)簽結(jié)合率。

作為優(yōu)選，所述步驟(1)中蛋白質(zhì)變性處理方法包括有機試劑變性處理方法、無機鹽變性處理方法、酸處理變性處理方法、堿處理變性處理方法、破壞氫鍵變性處理方法、破壞非共價鍵變性處理方法、還原二硫鍵變性處理方法、加熱變性處理方法、超聲處理變性處理方法以及加入表面活性劑變性處理方法中的一種或一種以上變性處理方法的組合。

作為優(yōu)選，所述標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物和標(biāo)記樣品之間的分子量大于等于4Da。過小的分子量差異會導(dǎo)致同位素標(biāo)記產(chǎn)物和非同位素標(biāo)記產(chǎn)物的天然同位素重疊，導(dǎo)致結(jié)果相互干擾?；瘜W(xué)標(biāo)簽iso-A可同位素標(biāo)記的位點過少，可以通過增加化學(xué)標(biāo)簽的種類和數(shù)量達到這一目的。

本發(fā)明基于蛋白質(zhì)層面的標(biāo)記，而蛋白質(zhì)由多個不同種類的氨基酸組成，本發(fā)明中可以選擇的標(biāo)記物有多種，因此相比于多肽層面的標(biāo)記方法來說，本發(fā)明的適用性更廣，作為優(yōu)選，所述化學(xué)標(biāo)簽A為甲醛和氰基硼氫化物組成的標(biāo)記組份、碘代乙酰胺、1，2-環(huán)己二酮、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、甘氨酰胺、碘代乙酰胺、焦碳酸二乙酯、琥珀酰酐、2-羥基-5-硝基芐溴以及四硝基甲烷中的至少一種組份。

根據(jù)上述優(yōu)選標(biāo)記組份，化學(xué)標(biāo)簽A的作用位點可廣泛分布于20種常見氨基酸中的16種，包括精氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。廣泛的候選氨基酸側(cè)鏈增加了本發(fā)明的適用范圍，可以基本覆蓋所有多肽可能性。

作為優(yōu)選，所述標(biāo)記位點為精氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸中至少一種氨基酸的側(cè)鏈。

本發(fā)明中步驟(4)中的預(yù)處理方法可以有多種，作為優(yōu)選，所述步驟(4)中的預(yù)處理方法包括二硫鍵還原、半胱氨酸烷基化、非共價鍵斷裂、翻譯后修飾消除、蛋白酶解反應(yīng)、蛋白質(zhì)凈化、多肽凈化以及稀釋處理方法中的一種或者一種以上處理方法的組合?；瘜W(xué)標(biāo)簽標(biāo)記后的內(nèi)標(biāo)物和化學(xué)標(biāo)簽標(biāo)記后的待測樣品處于同一反應(yīng)體系下，其反應(yīng)效率一致，可以用于互相校正基質(zhì)效應(yīng)對預(yù)處理帶來的干擾，也可用于相互校正后續(xù)質(zhì)譜檢測中的基質(zhì)效應(yīng)問題。

質(zhì)譜檢測技術(shù)對多肽長度有一定要求，過短的多肽(少于6個氨基酸)的特異性小，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)；過長的多肽(大于20個氨基酸)在質(zhì)譜檢測中離子化效率低，多重電荷現(xiàn)象嚴(yán)重，導(dǎo)致靈敏度低。同時，氨基酸側(cè)鏈與化學(xué)標(biāo)簽結(jié)合后，會影響部分以此為酶切位點的蛋白酶活性。作為優(yōu)選，所述步驟(4)中的預(yù)處理方法包括蛋白酶解反應(yīng)，所述蛋白酶解反應(yīng)中的蛋白酶包括堿性胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、蛋白質(zhì)酶K、Rhizopuspepsin、CysN、LysC、LysN、ArgC、ArgN、AspC、AspN、GluC、TyrC、ProC、ProN、V8蛋白酶中的一種或者一種以上。該蛋白酶的選擇可以穩(wěn)定獲得適宜于質(zhì)譜檢測的多肽。

作為優(yōu)選，所述步驟(5)中的檢測方法為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法或者原位質(zhì)譜法。預(yù)處理后的樣品可用經(jīng)典的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法進行檢測，也可使用原位質(zhì)譜技術(shù)進行檢測，提高檢測通量。作為優(yōu)選，所采用的質(zhì)譜儀為三重四級桿質(zhì)譜、時間飛行質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜、軌道阱質(zhì)譜中的一種或者一種以上組成的多重質(zhì)譜。

作為優(yōu)選，所述內(nèi)標(biāo)物為蛋白質(zhì)純品、蛋白質(zhì)純品混合物、蛋白質(zhì)純品與待測樣品基質(zhì)混合得到的混合物，或蛋白質(zhì)純品混合物與待測樣品基質(zhì)混合得到的混合物。

作為優(yōu)選，所述化學(xué)標(biāo)簽A上的同位素化學(xué)標(biāo)記為多重標(biāo)記。本發(fā)明中可以將化學(xué)標(biāo)簽A與化學(xué)標(biāo)簽iso-A之間設(shè)置多個變量，利用質(zhì)譜對分子量進行檢測的原理，可以采用多重化學(xué)標(biāo)簽(N重化學(xué)標(biāo)簽)，理論上在一次預(yù)處理操作和進樣操作中對N-1個樣品同時分析，可以極大地提高檢測的效率。

作為優(yōu)選，標(biāo)記之后的多肽之間的分子量差異大于等于4Da。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

(1)本發(fā)明將樣品和內(nèi)標(biāo)物兩種分別標(biāo)記后，再將兩者混合并置于同一反應(yīng)體系下進行后續(xù)的處理工作，使得樣品和內(nèi)標(biāo)物蛋白質(zhì)在同一體系中所受到的基質(zhì)效應(yīng)、操作誤差均相同，使得誤差可以得以校正；

(2)本發(fā)明的成本較低，可供選擇的試劑范圍較廣，而且本發(fā)明所述使用的試劑折算之后成本大約為5000元人民幣，滿足1000次樣品檢測，單次檢測成本為5元；

(3)本發(fā)明的方法基于蛋白質(zhì)層面進行標(biāo)記，先標(biāo)記之后，再進行酶解，標(biāo)記位點和蛋白酶選擇范圍較廣，使得其操作方便，適用范圍較廣。

附圖說明

圖1為現(xiàn)有技術(shù)中基于多肽層面的標(biāo)記方法的流程圖。

圖2為現(xiàn)有技術(shù)中AQUA法的流程圖。

圖3為現(xiàn)有技術(shù)中SILAC法的流程圖。

圖4為本發(fā)明的流程圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明詳細說明如下，但不因具體的實施例限制本發(fā)明。

實施例1

本實施例為對紅酒中alpha s1-酪蛋白(牛奶過敏源)的檢測，其中alpha s1-酪蛋白含量為20μg/mL，檢測過程包括以下步驟：

(1)取1mL紅酒，加入100μL的TEAB緩沖液(1M，pH＝8.5)，二硫蘇糖醇10μL(100mmol/L)，在60℃水浴鍋中孵育30分鐘，加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L)，室溫環(huán)境下避光靜置30分鐘，得到標(biāo)記樣品；

(2)取alpha s1-酪蛋白溶液按照上述相同方法進行處理，僅將碘代乙酰胺更換成帶同位素標(biāo)記的¹³C₂²H₄-碘代乙酰胺，得到標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物；

(3)分別各取500μL的標(biāo)記樣品以及標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物，將兩者混合均勻，然后加入10μL胰蛋白酶(100μg/mL)，置于37℃水浴鍋中反應(yīng)4小時，得到酶解液；

(4)將酶解液過濾后通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進樣分析，其中，高效液相色譜分離條件：色譜柱為C18色譜柱，柱溫為40℃；流動相A為體積百分比為0.1％的甲酸的乙腈溶液，流動相B為體積百分比為0.1％的甲酸水溶液，梯度洗脫，流速為0.3mL/min；

其中，梯度洗脫為：

流動相A的體積百分比由3％耗時10min上升至40％，對應(yīng)地流動相B的體積百分比由97％耗時10min下降至60％，然后改為100％流動相A沖洗2min，最后改為流動相A體積百分比3％和流動相B體積百分比97％保留3min；

進樣分析質(zhì)譜條件：

毛細管電壓：3.5kv，錐孔電壓：35kv，脫溶劑溫度：500℃，脫溶劑氣流量：900L/min，錐孔反吹氣流量：30L/hr，碰撞室壓力：3.0×10-3mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，離子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，離子能量2：1.0；離子源溫度：150℃，提取器電壓：3.0V，入口透鏡電壓：0.5V，出口電壓：0.5V，碰撞梯度：1.0。

實施例2

本實施例為對紅酒中alpha s1-酪蛋白(牛奶過敏源)的檢測，其中alpha s1-酪蛋白含量為20μg/mL，檢測過程包括：

取1mL紅酒，加入10mL乙腈將蛋白質(zhì)變性沉淀，在15000g離心30分鐘，棄去液體后將加入100μL的TEAB緩沖液(1M，pH＝8.5)，RapiGest表面活性劑型變性劑10μL(1mg/mL)，二硫蘇糖醇10μL(100mmol/L)，水990μL，在60℃水浴鍋中孵育30分鐘；后續(xù)操作與實施例1中“加入碘代乙酰胺10μL”后相同。

對比例1(二甲基化法)

該對比例以二甲基化法作為對比方法，其操作步驟包括：

(1)取1mL紅酒和alphas1-酪蛋白溶液，分別加入100μL的TEAB緩沖液(1M，pH＝8.5)，二硫蘇糖醇10μL(100mmol/L)，在60℃水浴鍋中孵育30分鐘，加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L)，室溫環(huán)境下避光靜置30分鐘；

(2)在兩者溶液各100μL中，分別加入4μL甲醛溶液(4％)和4μL氰基硼氫化鈉(0.6mol/L)，其中與紅酒樣品反應(yīng)的甲醛選擇非同位素標(biāo)記甲醛，與alpha s1-酪蛋白溶液反應(yīng)的甲醛為¹³C²H₂-甲醛。于室溫下震蕩孵育1小時后，先后加入16μL氨水(1％)和8μL甲酸(5％)。將兩者1：1混合、過濾、通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進樣分析，其中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中參數(shù)設(shè)置與實施例1相同。

表1為實施例1和對比例1的MRM參數(shù)對比

實施例1的回收率為98.2±5.13％，實施例2的回收率為97.3±3.87％，對比例1的回收率為70.3±10.3％，原因主要是紅酒中含有大量單寧類物質(zhì)(鞣質(zhì))，會降低蛋白酶的酶解效果，使其失活，對比例1中紅酒基質(zhì)中單寧含量多，蛋白酶酶解效率下降得也多，而對比例1中的alpha s1-酪蛋白在無單寧的環(huán)境中進行酶解，能夠完全酶解，因此對比例1無法對酶解效率的降低幅度進行評估和校正，導(dǎo)致結(jié)果嚴(yán)重偏離理論值。本發(fā)明中的實施例1和實施例2將標(biāo)記后的紅酒和內(nèi)標(biāo)物alpha s1-酪蛋白在同一體系中進行酶解，使得蛋白酶失活帶來的兩種蛋白質(zhì)酶解效率下降幅度一致，可以通過同位素稀釋質(zhì)譜思路進行校正。

其中實施例2中樣品回收率為97.3±3.87％。此回收率與實施例1的98.2±5.13％相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性差異，但是實施例2引入乙腈變性和表面活性劑變性兩個方法，能夠在保持回收率穩(wěn)定的情況下，實施例2中酶解時間可從4小時縮短至1小時，將酶解時間縮短，大大提高了檢測效率。

對比例2(AQUA方法)

AQUA方法的操作步驟包括：

取1mL紅酒，加入100μL的TEAB緩沖液(1M，pH＝8.5)，二硫蘇糖醇10μL(100mmol/L)，在60℃水浴鍋中孵育30分鐘之后，加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L)，室溫環(huán)境下避光靜置30分鐘，最后加入10μL LSFNPTQL*EEQCHI*溶液(10nmol/L)，過濾、通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進樣分析，其中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中參數(shù)設(shè)置與實施例1相同。

表2為實施例1和對比例2的MRM參數(shù)對比

實施例1的回收率為98.2±5.13％，實施例2的回收率為97.3±3.87％，對比例2的回收率為73.4±5.9％。原因與上述對比例1與實施例1和實施例2的分析類似，其中對比例2中加入的LSFNPTQL*EEQCHI*溶液無需參與酶解，所以對酶解過程中的誤差無法進行有效校正，導(dǎo)致結(jié)果偏離理論值。

實施例3(蛋白飲料中beta乳球蛋白的檢測)

本實施例對蛋白飲料中beta乳球蛋白進行檢測時的步驟包括：

(1)取1mL飲料樣品和beta乳球蛋白(20mg/L)，分別加入100μL的TEAB緩沖液(1M，pH＝8.5)，再分別加入40μL甲醛溶液(4％)和40μL氰基硼氫化鈉(0.6mol/L)，于室溫下震蕩孵育1小時后，其中與飲料樣品反應(yīng)的甲醛溶液選擇非同位素標(biāo)記甲醛，與beta乳球蛋白溶液反應(yīng)的甲醛溶液為¹³C²H₂-甲醛；

(2)震蕩孵育1小時后，分別依次加入160μL氨水(1％)和80μL甲酸(5％)，然后各取500μL飲料樣品溶液和beta乳球蛋白溶液，混合后加入二硫蘇糖醇10μL(100mmol/L)，在60℃水浴鍋中孵育30分鐘之后，加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L)，室溫環(huán)境下避光靜置30分鐘之后，加入10μL的V8蛋白酶(100μg/mL)，并置于37℃水浴鍋中反應(yīng)，得到酶解液；

(3)反應(yīng)完成，將酶解液過濾后通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進樣分析，其中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中參數(shù)設(shè)置與實施例1相同。

對比例3(SILAC法)

該對比例3通過SILAC法對蛋白飲料中beta乳球蛋白進行檢測，具體的操作步驟如下：

取1mL飲料樣品，加入100μL的TEAB緩沖液(1M，pH＝8.5)和100μL采用SILAC方法制備的同位素標(biāo)記beta-乳球蛋白，混合后加入二硫蘇糖醇10μL(100mmol/L)，在60℃水浴鍋中孵育30分鐘，加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L)，室溫環(huán)境下避光靜置30分鐘，加入10μL V8蛋白酶(100μg/mL)，置于37℃水浴鍋中反應(yīng)，將酶解液過濾后通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進樣分析，其中液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)中參數(shù)設(shè)置與實施例1相同。

表3為實施例2和對比例3的MRM參數(shù)對比

表4為實施例2與對比例3的酶解效率對比

正常表達的蛋白質(zhì)在表達完成后，會進行表達后修飾和蛋白質(zhì)折疊；而轉(zhuǎn)基因表達的蛋白質(zhì)不會進行這兩個步驟，所以轉(zhuǎn)基因表達的蛋白質(zhì)在空間結(jié)構(gòu)上與正常表達蛋白質(zhì)有顯著區(qū)別，牛乳中的β-乳球蛋白為致密球體，酶解位點大多隱藏在空間結(jié)構(gòu)內(nèi)部深處，難以酶解，而用SILAC技術(shù)合成的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)較為松散，極易酶解。本發(fā)明中的酶解效率相似度高達101.0％，所以可以依據(jù)同位素稀釋質(zhì)譜法進行校正，減少了檢測誤差。

實施例4(針對精氨酸的化學(xué)標(biāo)記)

標(biāo)記物：1，2-環(huán)己二酮

本實施例采用上述標(biāo)記物對精氨酸進行化學(xué)標(biāo)記時的步驟如下：

(a)稱取50mg牛血清蛋白(牛血清蛋白為樣品，下同)溶于1ml硼酸鹽緩沖液(pH＝8，100mM)；

(b)加入6mg 1，2-環(huán)己二酮，于室溫中反應(yīng)2小時；

(c)標(biāo)記后從上述反應(yīng)體系中取970μl溶液，并在970μl溶液中加入10μl二硫蘇糖醇(100mM)于70℃下反應(yīng)30分鐘；

(d)再加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗處室溫保存30分鐘；

(e)最后加入10μl堿性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反應(yīng)2小時。

上述標(biāo)記物1，2-環(huán)己二酮對精氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅰ)式；采用帶同位素¹³C標(biāo)記的標(biāo)記物1，2-環(huán)己二酮對精氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅱ)；兩種方式標(biāo)記之后的分子量相差4Da。

實施例5(針對谷氨酸和天冬氨酸的化學(xué)標(biāo)記)

標(biāo)記物：(1)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽

(2)甘氨酰胺

本實施例采用上述標(biāo)記物對谷氨酸和天冬氨酸進行化學(xué)標(biāo)記時的步驟如下：

(a)稱取50mg牛血清蛋白溶于1ml磷酸緩沖鹽溶液pH＝5(50mM)中；

(b)加入126mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽以及16mg甘氨酰胺，于室溫反應(yīng)時間120分鐘；

(c)再加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值到8.5；

(d)標(biāo)記后從反應(yīng)體系中取出970μl溶液，并在970μl溶液中加入10μl二硫蘇糖醇(100mM)，于70℃下反應(yīng)30分鐘；

(e)再加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗處室溫保存30分鐘；

(f)最后加入10μl堿性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反應(yīng)2小時。

上述標(biāo)記物對谷氨酸和天冬氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅰ)式；采用帶同位素D標(biāo)記的標(biāo)記物對谷氨酸和天冬氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅱ)；兩種方式標(biāo)記之后的分子量相差5Da。

實施例6(針對半胱氨酸的化學(xué)標(biāo)記)

標(biāo)記物：碘代乙酰胺

本實施例采用上述標(biāo)記物對半胱氨酸進行化學(xué)標(biāo)記時的步驟如下：

(a)稱取50mg牛血清蛋白溶于1ml NH₄CO₃pH＝8.5(500mM)中；

(b)加入40mg碘代乙酰胺于反應(yīng)液中，同時加入少量乙醇，使碘乙酸完全溶解，于室溫，暗處，反應(yīng)3小時；

(c)從反應(yīng)體系中取990μl反應(yīng)液，在990μl反應(yīng)液中加入10μl堿性胰蛋白酶(200μg/ml)，于37℃反應(yīng)2小時。

上述標(biāo)記物對半胱氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅰ)式；采用帶同位素D標(biāo)記的標(biāo)記物對半胱氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅱ)；兩種方式標(biāo)記之后的分子量相差4Da。

實施例7(針對組氨酸的化學(xué)標(biāo)記)

標(biāo)記物：焦碳酸二乙酯

本實施例采用上述標(biāo)記物對組氨酸進行化學(xué)標(biāo)記時的步驟如下：

(a)稱取50mg牛血清蛋白溶于1ml乙醇水溶液(pH＝6.5)中；

(b)再加入50mg焦碳酸二乙酯于37℃，反應(yīng)2小時；

(c)除去反應(yīng)有機溶劑，脫鹽，蒸干；

(d)在剩余標(biāo)記蛋白質(zhì)加入NH₄CO₃(500mM)到970μl，pH＝8.5；

(e)再加入10μl二硫蘇糖醇(100mM)于70℃下反應(yīng)30分鐘；

(f)再加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗處室溫保存30分鐘；

(g)最后加入10μl堿性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃反應(yīng)2小時。

上述標(biāo)記物對組氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅰ)式；采用帶同位素D標(biāo)記的標(biāo)記物對組氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅱ)；兩種方式標(biāo)記之后的分子量相差5Da。

實施例8(針對賴氨酸的化學(xué)標(biāo)記)

標(biāo)記物：琥珀酰酐

本實施例采用上述標(biāo)記物對賴氨酸進行化學(xué)標(biāo)記時的步驟如下：

(a)稱取50mg牛血清蛋白溶于1ml乙醇水溶液(pH＝8)中；

(b)再加入80mg琥珀酰酐于反應(yīng)液中，于37℃，反應(yīng)2小時；

(d)除去反應(yīng)有機溶劑，脫鹽，蒸干；

(e)在剩余標(biāo)記蛋白質(zhì)加入NH₄CO₃(500mM)到970μl，pH＝8.5；

(f)加入10μl二硫蘇糖醇(100mM)于70℃下反應(yīng)30分鐘；

(g)加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗處室溫保存30分鐘；

(h)加入10μl堿性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反應(yīng)2小時。

上述標(biāo)記物對賴氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅰ)式；采用帶同位素¹⁸O標(biāo)記的標(biāo)記物對賴氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅱ)；兩種方式標(biāo)記之后的分子量相差6Da。

實施例9(針對色氨酸的化學(xué)標(biāo)記)

標(biāo)記物：2-羥基-5-硝基芐溴

本實施例采用上述標(biāo)記物對色氨酸進行化學(xué)標(biāo)記時的步驟如下：

(a)稱取50mg牛血清蛋白溶于1ml純二甲亞砜中(pH＝5)；

(b)在反應(yīng)體系中加入15mg2-羥基-5-硝基芐溴于37℃下反應(yīng)30min；

(c)除去反應(yīng)有機溶劑，脫鹽，蒸干；

(d)在剩余標(biāo)記蛋白質(zhì)加入NH₄CO₃(500mM)到970μl，pH＝8.5；

(e)加入10μl二硫蘇糖醇(100mM)于70℃下反應(yīng)30分鐘；

(f)加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗處室溫保存30分鐘；

(g)加入10μl堿性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃反應(yīng)2小時。

上述標(biāo)記物對色氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅰ)式；采用帶同位素¹³C標(biāo)記的標(biāo)記物對色氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅱ)；兩種方式標(biāo)記之后的分子量相差7Da。

實施例10(針對酪氨酸的化學(xué)標(biāo)記)

標(biāo)記物：四硝基甲烷

本實施例采用上述標(biāo)記物對酪氨酸進行化學(xué)標(biāo)記時的步驟如下：

(a)稱取50mg牛血清蛋白溶于磷酸緩沖液(pH＝8)中；

(b)在反應(yīng)體系中加入50mg四硝基甲烷，于37℃反應(yīng)2h；

(c)取970μl反應(yīng)溶液，加入10μl二硫蘇糖醇(100mM)于70℃下反應(yīng)分鐘；

(d)加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗處室溫保存30分鐘；

(e)加入10μl堿性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反應(yīng)2小時。

上述標(biāo)記物對酪氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅰ)式；采用帶同位素¹⁸O標(biāo)記的標(biāo)記物對酪氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅱ)；兩種方式標(biāo)記之后的分子量相差4Da。

實施例11(針對絲氨酸的化學(xué)標(biāo)記)

標(biāo)記物：焦碳酸二乙酯

本實施例采用上述標(biāo)記物對絲氨酸進行化學(xué)標(biāo)記時的步驟如下：

(a)稱取50mg牛血清蛋白溶于1ml乙醇水溶液(pH＝6.5)中；

(b)加入50mg焦碳酸二乙酯于反應(yīng)液中，于37℃反應(yīng)2小時；

(c)除去反應(yīng)有機溶劑，脫鹽，蒸干；

(d)在剩余標(biāo)記蛋白質(zhì)中加入NH₄CO₃(500mM)到970μl，pH至8.5；

(e)加入10μl二硫蘇糖醇(100mM)于70℃下反應(yīng)30分鐘；

(f)加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗處室溫保存30分鐘；

(g)加入10μl堿性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反應(yīng)2小時。

上述標(biāo)記物對絲氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅰ)式；采用帶同位素D標(biāo)記的標(biāo)記物對絲氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅱ)；兩種方式標(biāo)記之后的分子量相差5Da。

實施例12(針對蘇氨酸的化學(xué)標(biāo)記)

標(biāo)記物：焦碳酸二乙酯

本實施例采用上述標(biāo)記物對蘇氨酸進行化學(xué)標(biāo)記時的步驟如下：

(a)稱取50mg牛血清蛋白溶于1ml乙醇水溶液(pH＝6.5)中；

(b)加入50mg焦碳酸二乙酯于反應(yīng)液中，于37℃，反應(yīng)2小時；

(c)除去反應(yīng)有機溶劑，脫鹽，蒸干；

(d)在剩余標(biāo)記蛋白質(zhì)加入NH₄CO₃(500mM)到970μl，pH至8.5；

(e)加入10μl二硫蘇糖醇(100mM)于70℃下反應(yīng)30分鐘；

(f)加入10μl碘代乙酰胺(300mM)于暗處室溫保存30分鐘；

(g)加入10μl堿性胰蛋白酶(200μg/ml)于37℃下反應(yīng)2小時。

上述標(biāo)記物對蘇氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅰ)式；采用帶同位素D標(biāo)記的標(biāo)記物對蘇氨酸進行標(biāo)記時的反應(yīng)方程式，參見(Ⅱ)；兩種方式標(biāo)記之后的分子量相差5Da。

實施例13(蛋白質(zhì)酶的選擇)

(1)取三份各1mL alpha s1-酪蛋白溶液，分別加入100μL的TEAB緩沖液(1M，pH＝8.5)，二硫蘇糖醇10μL(100mmol/L)，在60℃水浴鍋中孵育30分鐘，加入碘代乙酰胺10μL(300mmol/L)，室溫環(huán)境下避光靜置30分鐘，再分別加入4μL甲醛溶液(4％)和4μL氰基硼氫化鈉(0.6mol/L)，于室溫下震蕩孵育1小時后，先后加入16μL氨水(1％)和8μL甲酸(5％)，得到三份標(biāo)記樣品；

(2)在三份標(biāo)記樣品中分別加入10μL胰蛋白酶(100μg/mL)、Lys-C(100μg/mL)和Lys-N(100μg/mL)，置于37℃水浴鍋中反應(yīng)4小時，得到酶解液；

(3)將酶解液過濾后通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)進樣分析，色譜條件同實施例1，質(zhì)譜選擇Q-ToF高分辨飛行時間質(zhì)譜。

(4)將所得到的色質(zhì)譜圖用蛋白質(zhì)組分析軟件Waters Proteinlynx Global Server進行分析，結(jié)果如下表5。

表5

由于胰蛋白酶的酶解位點為賴氨酸和精氨酸的C端肽鍵，它無法對二甲基化的賴氨酸進行酶解，所以酶解位點僅為精氨酸。它的理論酶解產(chǎn)物多肽共5個，其中4個多肽長度過長，含有19～69個氨基酸，不適宜質(zhì)譜檢測，所以無法測得，僅能夠測得YLGYLEQLLR這一條多肽。

Lys-C的酶解位點為賴氨酸的C端肽鍵，它無法對二甲基化的賴氨酸進行酶解，所以無法在二甲基化的alpha s1酪蛋白中酶解出任何多肽。

Lys-N的酶解位點為賴氨酸的N端肽鍵，且不受二甲基化的賴氨酸影響，所以理論上它依舊能從二甲基化的alpha s1酪蛋白產(chǎn)生10條多肽。其中8條多肽長度適宜，能夠被質(zhì)譜實際檢測到。

由上可知，本發(fā)明在進行蛋白酶的選擇時，可根據(jù)標(biāo)記位點進行酶的選擇，選擇以不受標(biāo)記位點標(biāo)記而影響酶解活性的蛋白酶。