本發(fā)明屬于藥物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：美他多辛，化學(xué)名為吡多醇L-2吡咯烷酮-5-羧酸鹽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式下所示；美他多辛由意大利LaboratoriBaldacciSPA公司研制開發(fā)，1985年9月在意大利上市，商品名為Metadoxil；美他多辛可降低血中乙醇，體內(nèi)乙醇主要經(jīng)乙醇脫氫酶(ADH)轉(zhuǎn)化為乙醛，少量經(jīng)微粒體乙醇氧化酶轉(zhuǎn)化為乙醛，乙醛又經(jīng)乙醛脫氫酶(ALDH)轉(zhuǎn)化為乙酸，再經(jīng)三羧酸循環(huán)最后氧化為CO2和H2O。因乙醇的代謝速度主要取決于肝內(nèi)代謝酶的活力，故應(yīng)與其可阻止ADH的失活有關(guān)，可使體內(nèi)ADH維持在正常水平，還有研究表明，美他多辛能加速乙醇及其代謝產(chǎn)物乙醛和酮體經(jīng)腎臟排泄，其適應(yīng)癥為酒精性肝病。酒精性肝病患者群體巨大，且有增長(zhǎng)趨勢(shì)，美他多辛作為治療酒精性肝病藥物，能夠改善由于長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致的肝功能損害。隨著美他多辛藥品廣泛使用，作為藥品其質(zhì)量受廣大受用人群關(guān)注，而現(xiàn)有的美他多辛質(zhì)量研究較少，因此，美他多辛的質(zhì)量研究對(duì)其質(zhì)量控制具有重要意義。目前，現(xiàn)有技術(shù)中均采用LunaC18(2)、AgilenZorbaxSB-C18色譜柱來檢測(cè)美他多辛的主要成分及有關(guān)物質(zhì)，采用此種色譜柱進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，樣品保留時(shí)間太長(zhǎng)，分離度小等缺點(diǎn)；若嘗試縮短保留時(shí)間則導(dǎo)致有關(guān)物質(zhì)與主要成分焦谷氨酸不能有效分離；因此尋找一種分離度高、主成分保留時(shí)間適中即分析時(shí)間短、成本低的檢測(cè)方法是非常有必要的。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法，以解決上述問題。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：一種高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法，包括：采用高效液相色譜法分別對(duì)美他多辛供試品溶液及對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，記錄二者的色譜圖并獲得所述美他多辛供試品溶液中維生素B6堿的峰面積及所述對(duì)照品溶液的主峰面積并以外標(biāo)法對(duì)美他多辛有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行定量分析；所述對(duì)照品溶液為美他多辛純品溶液。本發(fā)明采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，不論樣品中的所有組分是否全部出峰，均可對(duì)出峰組分做定量分析。就定量參比物而言，外標(biāo)法是最為準(zhǔn)確的方法，因?yàn)槭峭|(zhì)組分進(jìn)行比較。優(yōu)選的，如上所述的高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法，所述美他多辛供試品溶液的濃度為0.2mg/ml～1mg/ml，更優(yōu)選為0.3mg/ml～0.6mg/ml，還可以選擇0.4mg/ml。優(yōu)選的，如上所述的高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法，所述對(duì)照品溶液的濃度為0.04μg/ml～10μg/ml，更優(yōu)選為0.08μg/ml～8μg/ml，更優(yōu)選為0.5μg/ml～6μg/ml，還可以選擇1μg/ml、2μg/ml或4μg/ml等。優(yōu)選的，如上所述的高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法，在進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)時(shí)，所用色譜柱的固定相為全多孔硅膠微粒鍵合C8官能團(tuán)，流動(dòng)相為乙腈-水的混合溶液。優(yōu)選的，如上所述的高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法，所述色譜柱的規(guī)格為：內(nèi)徑為4.2～5.0mm，長(zhǎng)度為200～300mm，填料粒徑為2～8μm。更優(yōu)選為內(nèi)徑為4.6mm，長(zhǎng)度為250mm，填料粒徑為5μm。優(yōu)選的，如上所述的高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法，所述色譜柱為InertsilC8-4。優(yōu)選的，如上所述的高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法，所述乙腈-水的混合溶液中乙腈與水的體積比為1：99～10：90，并用磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值為1.0～3.0；優(yōu)選的所述乙腈-水的混合溶液中乙腈與水的體積比為1：99～5：90，并用磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值為1.5～2.5；優(yōu)選的，如上所述的高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法，所述流動(dòng)相的流速為0.5ml/min～1.5ml/min；更優(yōu)選的，流速為0.8ml/min-1.2ml/min，還可以選擇0.6ml/min、1.0ml/min等。流速的大小直接影響到流動(dòng)相的用量問題，但從經(jīng)濟(jì)的角度來講，應(yīng)該設(shè)定較小流速；由于柱子的填充和儀器本身的關(guān)系也不能設(shè)定過大的流速。優(yōu)選的，如上所述的高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法，所述色譜柱的柱溫為10℃～40℃，更優(yōu)選為25℃～35℃。柱溫對(duì)洗脫時(shí)的保留時(shí)間影響較大，隨著柱溫的升高，保留時(shí)間一般會(huì)下降。優(yōu)選的，如上所述的高效液相色譜檢測(cè)美他多辛有關(guān)物質(zhì)的方法，在進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)波長(zhǎng)為200nm～300nm，更優(yōu)選為200nm～210nm，還可以選擇205nm；高效液相色譜一次進(jìn)樣量為3μl～7μl，更優(yōu)選為5μl。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：1)、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有更高的分離度，美他多辛中所含維生素B6與焦谷氨酸主要成分分離度大于7.0，色譜主峰理論塔板大于10000，且峰形尖銳、對(duì)稱。2)、本發(fā)明在流動(dòng)相為乙睛-水(1％：99％，磷酸調(diào)pH值為2.0)時(shí)，即可保證美他多辛主成分主要分離度在7.0以上，又可以使主成分與主要雜質(zhì)的分離度大于6.0，且保留時(shí)間在10min以內(nèi)，同時(shí)具備了分離度高、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。3)、本發(fā)明采用流動(dòng)相溶解美他多辛，其溶解度更高、溶解速度更快，可以有效的避免檢測(cè)過程中析出固體而導(dǎo)致色譜柱以及色譜系統(tǒng)的堵塞，使得檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，其操作也更簡(jiǎn)便。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為實(shí)施例1條件下對(duì)美他多辛的液相檢測(cè)色譜圖；圖2為實(shí)施例2條件下對(duì)美他多辛的液相檢測(cè)色譜圖；圖3為實(shí)施例3條件下對(duì)美他多辛的液相檢測(cè)色譜圖；圖4為實(shí)施例4條件下對(duì)美他多辛的液相檢測(cè)色譜圖；圖5為本發(fā)明檢測(cè)方法的線性關(guān)系。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。本發(fā)明具體實(shí)施方式中使用的供試品、對(duì)照品、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，其中對(duì)照品在中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買高效液相色譜儀：Angilent1260高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器參照說明書附圖以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的測(cè)定美他多辛含量的方法作以下詳細(xì)說明。實(shí)施例1美他多辛高效液相色譜檢測(cè)方法：(1)制備供試品溶液：精密稱取美他多辛5mg，置25ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。制備對(duì)照品溶液：取美他多辛有關(guān)物質(zhì)A5mg，置于25ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密量取適量，定量稀釋制成每1ml中含有0.2μg的溶液，作為對(duì)照品溶液制備系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液：取美他多辛5mg，置于25ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到美他多辛溶液；取對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25ml，置于25ml量瓶中，用上述美他多辛溶液稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液；(2)高效液相色譜的檢測(cè)條件為：色譜柱：InertsilC8-4(4.6mm×260mm5μm)流動(dòng)相：乙腈-水(1％：99％)，磷酸調(diào)pH值為2.0流速：0.8ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：205nm柱溫：25℃按照上述檢測(cè)條件，取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，取對(duì)照品5μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰峰高約為滿量程的10％；精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品種美他多辛雜質(zhì)的含量約為0.02％。計(jì)算公式：美他多辛有關(guān)物質(zhì)式中：A樣：指供試品溶液中維生素B6堿的峰面積；A對(duì)：指對(duì)照品溶液主峰面積C樣：指供試品溶液的濃度(單位：mg/ml)C對(duì)：指對(duì)照品溶液的濃度(單位：μg/ml)表1實(shí)施例1條件下美他多辛主要成分維生素B6、焦谷氨酸、有關(guān)物質(zhì)A的分離效果注：2#、3#分離度的計(jì)算結(jié)果均以1#相關(guān)結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)方法美他多辛主成分維生素B6與焦谷氨酸分離度為7.31，維生素B6堿與有關(guān)物質(zhì)A分離度6.53，理論塔板均大于51000，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)的分離度和理論塔板數(shù)，有效的避免了各組分的干擾影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；同時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)方法美他多辛中主成分與有關(guān)物質(zhì)A的保留時(shí)間均在10min以內(nèi)，具有分析時(shí)間短、成本低等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例2檢測(cè)條件中流動(dòng)相改為乙腈-水(5％：95％)，磷酸調(diào)pH值為2.0，其他步驟及實(shí)施條件同實(shí)施例1。按照上述檢測(cè)條件，取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，取對(duì)照品5μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰峰高約為滿量程的10％；精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品種美他多辛雜質(zhì)的含量約為0.02％。表2、實(shí)施例2條件下美他多辛主要成分維生素B6、焦谷氨酸、有關(guān)物質(zhì)A的分離效果注：2#、3#分離度的計(jì)算結(jié)果均以1#相關(guān)結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)方法美他多辛主成分維生素B6與焦谷氨酸分離度為3.27，維生素B6堿與有關(guān)物質(zhì)A分離度8.43，理論塔板均大于54000，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)的分離度和理論塔板數(shù)，有效的避免了各組分的干擾影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；同時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)方法美他多辛中主成分與有關(guān)物質(zhì)A的保留時(shí)間均在10min以內(nèi)，具有分析時(shí)間短、成本低等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例3檢測(cè)條件中流速變?yōu)?.0ml/min，其他步驟及實(shí)施條件同實(shí)施例1。按照上述檢測(cè)條件，取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，取對(duì)照品5μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰峰高約為滿量程的10％；精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品種美他多辛雜質(zhì)的含量約為0.02％。表3、實(shí)施例3條件下美他多辛主要成分維生素B6、焦谷氨酸、有關(guān)物質(zhì)A的分離效果注：2#、3#分離度的計(jì)算結(jié)果均以1#相關(guān)結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)方法美他多辛主成分維生素B6與焦谷氨酸分離度為6.36，維生素B6堿與有關(guān)物質(zhì)A分離度8.08，理論塔板均大于44000，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)的分離度和理論塔板數(shù)，有效的避免了各組分的干擾影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；同時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)方法美他多辛中主成分與有關(guān)物質(zhì)A的保留時(shí)間均在10min以內(nèi)，具有分析時(shí)間短、成本低等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)施例4檢測(cè)條件中柱溫變?yōu)?5℃，其他步驟及實(shí)施條件同實(shí)施例1。按照上述檢測(cè)條件，取系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，取對(duì)照品5μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰峰高約為滿量程的10％；精密量取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品種美他多辛雜質(zhì)的含量約為0.02％。表4、實(shí)施例4條件下美他多辛主要成分維生素B6、焦谷氨酸、有關(guān)物質(zhì)A的分離效果注：2#、3#分離度的計(jì)算結(jié)果均以1#相關(guān)結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)方法美他多辛主成分維生素B6與焦谷氨酸分離度為7.48，維生素B6堿與有關(guān)物質(zhì)A分離度6.86，理論塔板均大于55000，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)的分離度和理論塔板數(shù)，有效的避免了各組分的干擾影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；同時(shí)，本發(fā)明檢測(cè)方法美他多辛中主成分與有關(guān)物質(zhì)A的保留時(shí)間均在10min以內(nèi)，具有分析時(shí)間短、成本低等優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)例1、線性關(guān)系(1)分別取供試品溶液適量，加流動(dòng)相制成濃度為0.05μg/ml～1.5μg/ml的系列供試品溶液；(2)按照實(shí)施例1的檢測(cè)條件對(duì)上述供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，以美他多辛中維生素B6堿的濃度對(duì)相應(yīng)的峰面積進(jìn)行線性回歸，線性方程：y＝16.20x+0.280，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999，如圖5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)方法的條件下，美他多辛有關(guān)物質(zhì)A的濃度與峰面積線性關(guān)系良好。試驗(yàn)例2、檢測(cè)限試驗(yàn)線性關(guān)系試驗(yàn)中最低濃度的對(duì)照品溶液主峰高為222uv，基線噪音約為5uv，信噪比約為44:1，根據(jù)檢測(cè)限要求(信噪比應(yīng)為3:1)，分別配置0.02、0.002、0.0002μg/ml的美他多辛對(duì)照片溶液，按照實(shí)施例1的的檢測(cè)條件，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。美他多辛中維生素B6的最小檢出量為0.02ng、焦谷氨酸最小檢出量為0.2ng，試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)美他多辛的主要成分維生素B6、焦谷氨酸檢測(cè)限低。試驗(yàn)例3、精密度試驗(yàn)通過配制潛在的已知雜質(zhì)，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，考察分離度及峰面積，要求測(cè)定6次結(jié)果的RSD不得大于5.0％，來證實(shí)方法具有良好的進(jìn)樣精密度，并同時(shí)測(cè)定各已知雜質(zhì)的校正因子和相對(duì)保留時(shí)間。分別稱取MT-1、MT-2、MT-3、MT-4雜質(zhì)對(duì)照品各5mg，置于25ml量瓶中，加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別取1ml置100ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻作為測(cè)試溶液按照實(shí)施例1的的檢測(cè)條件，取測(cè)試溶液5μl，注入液相色譜儀，連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜圖。檢測(cè)結(jié)果見表6。表6、各雜質(zhì)對(duì)照品保留時(shí)間精密度考察結(jié)果組分123456平均RSD％MT-15.6595.6755.6575.6585.6575.6575.66050.08MT-26.1636.1906.1706.1656.1666.1616.16910.12MT-37.1017.1337.1107.1097.1047.1027.10980.11MT-410.31710.36110.33810.32610.31710.31410.32880.13根據(jù)表6可以看出，對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次后，各雜質(zhì)保留時(shí)間的RSD均＜2.0％，進(jìn)樣精密度良好。試驗(yàn)例4、方法的專屬性方法的專屬性研究考察峰的鑒別和選擇性，要求：分別進(jìn)樣空白溶液及所有定位溶液，來確定所有潛在雜質(zhì)、主峰與相鄰色譜峰之間的分離度不得小于1.5。分別將已知雜質(zhì)MT-1、MT-2、MT-3、MT-4配置成濃度約為0.2mg/ml的定位溶液，將上述雜質(zhì)定位溶液各取1ml置同一10ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻得到雜質(zhì)混合溶液。另取美他多辛5mg至25ml容量瓶中，并取雜質(zhì)混合溶液0.25ml于此量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻作為混合溶液按照實(shí)施例1的的檢測(cè)條件，將空白(流動(dòng)相)、各定位溶液和混合溶液各5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。檢測(cè)結(jié)果見表5。表5、混合溶液分離度測(cè)試結(jié)果化合物代號(hào)保留時(shí)間(min)分離度理論塔板數(shù)純度因子空白2.035///MT-15.645/14092999.862MT-26.3583.7918863999.452MT-37.3885.2320211999.354MT-410.85513.5520547999.615根據(jù)表5可以看出，空白不干擾美他多辛有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，也不干擾其雜質(zhì)檢測(cè)。美他多辛中各雜質(zhì)可以得到有效分離，分離度均大于2.0，峰形良好，峰純度良好，理論塔板數(shù)大于3000，拖尾因子小于1.5，符合標(biāo)準(zhǔn)。盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3