本發(fā)明屬于分析化學
技術領域：
，具體涉及一種同時分離和測定唾液中多種酚類物質的方法。
背景技術：
：苯酚、苯二酚、甲基苯酚等，它們不但有較難聞的氣味，還對皮膚及呼吸道黏膜有強烈的刺激作用和致癌作用。另一些酚類，如丁香酚、2-甲氧基-4-甲基-苯酚，有強烈的香氣，是香精中的重要配方之一。這些酚類物質大量存在于卷煙主流煙氣中，可通過煙草吸食者、被動吸煙者的唾液溶解吸收，進而對人體產(chǎn)生影響。此外，大量暴露于酚類物質的人體唾液中可能存在酚類，大量吸入酚類物質而引發(fā)的酚類物質中毒者唾液中也可能存在酚類物質。因此研究測定人體唾液中吸收溶解的酚類成分，不僅可為吸煙與健康的評估提供數(shù)據(jù)支持，還可用于評價酚類物質的人體暴露量，或者用于檢測酚類中毒。目前，測定不同基質、樣品中酚類物質已有大量報道，然而唾液樣品中多種酚類物質的測定還未見報道。酚類物質常用的測定方法有氣相色譜-質譜聯(lián)用法、高效液相色譜法。但采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定酚類物質易氧化或受熱分解，通常需要進行衍生化處理，操作十分繁瑣，影響測定結果的準確性。采用常規(guī)的高效液相色譜法測定時，同時測定的目標物少，分離時間長，且前處理過程繁瑣。因此，開發(fā)簡單快速、分離效果好、高通量、高靈敏度、定量準確的唾液中多種酚類物質的分離和測定方法非常迫切。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對目前唾液中多種酚類物質分離和測定的方法未見文獻報道的現(xiàn)狀，以及現(xiàn)有技術的不足，提供一種同時分離和測定唾液中多種酚類物質的方法，該方法分離效果好，檢出限低，精密度好，準確可靠，具有推廣應用價值，基于實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：一種同時分離和測定唾液中多種酚類物質的方法，包括以下步驟：步驟(1)，樣品采集：將唾液收集管中的棉棒放于口中，咀嚼后放回收集管，經(jīng)離心后，得到唾液樣品；所述的咀嚼時間為1-3min；步驟(2)，樣品酸化：移取唾液樣品于樣品管中，依次加入酸化劑、內標物，然后經(jīng)渦旋振蕩至混合均勻，得到酸化液；所述的酸化劑為乙酸，所述的酸化劑用量為唾液體積的0.5％-2％；所述的內標物為4-氟苯酚，濃度為0.1-10mg/L；步驟(3)，測定：將步驟(2)得到的酸化液，過0.22μm微孔濾膜，采用超高效液相色譜-多波長熒光法分離和測定唾液中的多種酚類物質，內標法定量，根據(jù)標準曲線計算各酚類物質的含量；所述的多種酚類物質包括對苯二酚、間苯二酚、鄰甲基對苯二酚、鄰苯二酚、苯酚、4-甲基苯酚、2-甲基苯酚、2-甲氧基-4-甲基-苯酚、2,6-二甲基苯酚、2-乙基苯酚和丁香酚；所述超高效色譜條件如下：色譜柱：C18反相色譜柱或等效柱，C18反相色譜柱的規(guī)格為長度×內徑是100mm×2.1mm，粒徑為1.7μm；流速為0.1-0.4mL/min；柱溫為30-60℃；進樣量為1-3μL；流動相A為體積濃度為0.5-2％的乙酸水溶液，流動相B為乙酸、乙腈和水的混合溶液，流動相B乙酸濃度與流動相A中乙酸濃度相同，乙腈體積濃度為25-50％，梯度洗脫；梯度洗脫條件為：第0min，流動相A70-95％，流動相B30-5％；第6-12min任意一時刻改變流動相濃度配比，改變后的流動相A為0％，流動相B為100％；第15min停止洗脫；具體見下表1：表1時間(min)流動相A(％)流動相B(％)070-9530-56-12任意一時刻0100150100所述多波長熒光法的熒光檢測器的波長選擇見下表2：表2化合物激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)對苯二酚280-300320-335間苯二酚270-280295-315鄰甲基對苯二酚290-300320-330鄰苯二酚270-280305-320苯酚260-280295-3104-甲基苯酚270-280300-3252-甲基苯酚265-275295-3252-甲氧基-4-甲基-苯酚270-280305-3152,6-二甲基苯酚265-275295-3052-乙基苯酚265-275295-305丁香酚270-280305-3154-氟苯酚(內標)270-280305-315進一步，優(yōu)選的是，步驟(1)中唾液離心轉速不低于10000rpm，離心時間不少于10min。進一步，優(yōu)選的是，步驟(2)中唾液移取量為0.5-5mL。進一步，優(yōu)選的是，步驟(2)中渦旋振蕩轉速為500-20000rpm，渦旋振蕩時間為0.5-10min。進一步，優(yōu)選的是，步驟(3)中標準曲線繪制方法如下：配制多種酚類物質的5級混合標準溶液，濃度分別為0.05mg/L、0.5mg/L、2.5mg/L、10mg/L、25mg/L，5級混合標準溶液中均加入內標物，內標物濃度與唾液樣品中加入內標濃度相同，內標物濃度為0.1-10mg/L，對5級混合標準溶液進行超高效液相色譜-多波長熒光法分析，根據(jù)各酚類物質響應峰面積與內標物響應峰面積的比值為縱坐標，以各酚類物質濃度與內標物濃度比值為橫坐標，作各酚類物質的標準曲線。超高效液相色譜-多波長熒光法分析中的條件與前述超高效液相色譜-多波長熒光法中的條件相同。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，其有益效果為：(1)本發(fā)明方法可以有效用于同時分離和測定唾液中多種酚類物質，包括11種不同取代的苯酚和苯二酚類物質；(2)樣品只需酸化處理即可進樣分析，操作簡便，避免了常用的固相萃取、液液萃取、衍生化或濃縮等前處理技術多步驟處理過程中造成的目標物損失、氧化、變性，提高測定準確性。(3)采用多波長檢測，可選擇的波長范圍廣，可在10-20nm波長范圍內靈活選擇波長，并獲得高靈敏度；(4)采用4-氟苯酚作為內標進行整個分析過程的校正，回收率高，定量準確可靠，進一步有效的提高了準確性?？偟膩碚f，該方法不僅可以同時有效的分離和測定唾液中多種酚類物質，而且方法操作簡便，分離效果好，檢出限低，精密度好，準確可靠，具有推廣應用價值。以上說明為本發(fā)明技術方案的概述，為了更清楚的了解本發(fā)明的技術手段，而可依照說明書的內容予以實施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能夠更明顯易懂，現(xiàn)特舉較佳實施例，并配合附圖，詳細說明如下。附圖說明圖1是本發(fā)明測定多中酚類物質標準溶液的液相色譜分離圖；圖2為唾液加標樣品的液相色譜分離圖。圖3為煙草吸食者唾液樣品的液相色譜分離圖。圖中各峰的含義如下：1，1.60min，對苯二酚；2，2.41min，間苯二酚；3，2.65min，鄰甲基對苯二酚；4，3.25min，鄰苯二酚；5，5.38min，苯酚；6，8.36min，4-甲基苯酚；7，8.59min，2-甲基苯酚；8，9.32min，2-甲氧基-4-甲基-苯酚；9，11.37min，2,6-二甲基苯酚；10，11.89min，2-乙基苯酚；11，13.68min，丁香酚；IS，6.57min，4-氟苯酚。具體實施方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但其并不限制本發(fā)明。本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1一種分離和測定烤煙吸食者唾液中多種酚類物質的方法，包括以下步驟：(1)樣品采集：將唾液收集管中的棉棒放于口中，咀嚼2min后放回收集管，于10000rpm轉速下離心15min后，得到唾液樣品；(2)樣品酸化：移取0.5mL唾液樣品于樣品管中，加入0.01mL乙酸、并加入4-氟苯酚內標并使其濃度為3mg/L，經(jīng)2000rpm轉速下渦旋振蕩2min至混合均勻；(3)測定：將步驟(2)得到的酸化液，過微孔濾膜，采用超高效液相色譜-多波長熒光法測定，內標法定量，根據(jù)標準曲線計算目標物含量。超高效色譜條件如下：色譜柱：C18反相色譜柱，規(guī)格為長度×內徑是100mm×2.1mm，粒徑為1.7μm；流速為0.3mL/min；柱溫為50℃；進樣量為2μL；流動相A為體積濃度為1％的乙酸水溶液，流動相B為乙酸-乙腈-水混合溶液，其中乙酸體積濃度1％，乙腈體積濃度為25％，梯度洗脫；梯度洗脫條件為：第0min，流動相A90％，流動相B10％；第10min改變流動相濃度配比，改變后的流動相A為0％，流動相B為100％；第15min停止洗脫；梯度洗脫條件見下表3：表3時間(min)流動相A(％)流動相B(％)09010100100150100所述多波長熒光法的熒光檢測器的波長選擇見下表4：表4表5線性相關系數(shù)、精密度(RSD)、檢出限、定量限和回收率n表示實驗重復次數(shù)。酚類物質混合標準溶液的液相色譜分離圖如圖1所示，11種酚類和內標物實現(xiàn)完全分離，峰形尖銳對稱；唾液加標樣品的液相色譜分離圖如圖2所示，11種酚類和內標物不受唾液基質的影響，均實現(xiàn)完全分離；煙草吸食者唾液樣品的液相色譜分離圖如圖3所示，檢測出的酚類物質分離良好，不受唾液基質干擾，能實現(xiàn)準確定量。表5給出了實施例1方法分析烤煙吸食者唾液中酚類物質的線性相關系數(shù)、精密度(RSD)、檢出限、定量限和回收率相關參數(shù)，上述數(shù)據(jù)表明該方法結果可靠，精密度好，適合于烤煙吸食者唾液中酚類物質的分離和測定。實施例2一種分離和測定雪茄煙吸食者唾液中多種酚類物質的方法，包括以下步驟：(1)樣品采集：將唾液收集管中的棉棒放于口中，咀嚼1min后放回收集管，于12000rpm轉速下離心12min后，得到唾液樣品；(2)樣品酸化：移取2.0mL唾液樣品于樣品管中，加入0.03mL乙酸、并加入4-氟苯酚內標并使其濃度為1.5mg/L，經(jīng)20000rpm轉速下渦旋振蕩0.5min至混合均勻；(3)測定：將步驟(2)得到的酸化液，過微孔濾膜，采用超高效液相色譜-多波長熒光法測定，內標法定量，根據(jù)標準曲線計算目標物含量。超高效色譜條件如下：色譜柱：C18反相色譜柱，規(guī)格為長度×內徑是100mm×2.1mm，粒徑為1.7μm；流速為0.1mL/min；柱溫為30℃；進樣量為3μL；流動相A為體積濃度為1.5％的乙酸水溶液，流動相B為乙酸-乙腈-水混合溶液，其中乙酸體積濃度1.5％，乙腈體積濃度為50％，梯度洗脫；梯度洗脫條件為：第0min，流動相A70％，流動相B30％；第6min改變流動相濃度配比，改變后的流動相A為0％，流動相B為100％；第15min停止洗脫；梯度洗脫條件見下表6：表6時間(min)流動相A(％)流動相B(％)0703060100150100所述多波長熒光法的熒光檢測器的波長選擇見下表7：表7表8線性相關系數(shù)、精密度(RSD)、檢出限、定量限和回收率n表示實驗重復次數(shù)。表8給出了實施例2方法分析雪茄煙吸食者唾液中酚類物質的線性相關系數(shù)、精密度(RSD)、檢出限、定量限和回收率相關參數(shù)，上述數(shù)據(jù)表明該方法結果可靠，精密度好，適合于雪茄煙吸食者唾液中酚類物質的分離和測定。實施例3一種分離和測定香精配方員唾液中多種酚類物質的方法，包括以下步驟：(1)樣品采集：將唾液收集管中的棉棒放于口中，咀嚼3min后放回收集管，于15000rpm轉速下離心10min后，得到唾液樣品；(2)樣品酸化：移取5.0mL唾液樣品于樣品管中，加入0.025mL乙酸、并加入4-氟苯酚內標并使其濃度為10mg/L，經(jīng)500rpm轉速下渦旋振蕩10min至混合均勻；(3)測定：將步驟(2)得到的酸化液，過微孔濾膜，采用超高效液相色譜-多波長熒光法測定，內標法定量，根據(jù)標準曲線計算目標物含量。超高效色譜條件如下：色譜柱：C18反相色譜柱，規(guī)格為長度×內徑是100mm×2.1mm，粒徑為1.7μm；流速為0.25mL/min；柱溫為30℃；進樣量為1μL；流動相A為體積濃度為0.5％的乙酸水溶液，流動相B為乙酸-乙腈-水混合溶液，其中乙酸體積濃度0.5％，乙腈體積濃度為40％，梯度洗脫；梯度洗脫條件為：第0min，流動相A95％，流動相B5％；第9min改變流動相濃度配比，改變后的流動相A為0％，流動相B為100％；第15min停止洗脫；梯度洗脫條件見下表9：表9時間(min)流動相A(％)流動相B(％)095590100150100所述多波長熒光法的熒光檢測器的波長選擇見下表10：表10時間(min)激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)對苯二酚300335間苯二酚280315鄰甲基對苯二酚300330鄰苯二酚280320苯酚2803104-甲基苯酚2803252-甲基苯酚2753252-甲氧基-4-甲基-苯酚2803152,6-二甲基苯酚2753052-乙基苯酚275305丁香酚2803154-氟苯酚(內標)280315表11線性相關系數(shù)、精密度(RSD)、檢出限、定量限和回收率n表示實驗重復次數(shù)。表11給出了實施例3方法分析香精配方員唾液中酚類物質的線性相關系數(shù)、精密度(RSD)、檢出限、定量限和回收率相關參數(shù)，上述數(shù)據(jù)表明該方法結果可靠，精密度好，適合于香精配方員唾液中酚類物質的分離和測定。實施例4一種分離和測定口含煙食用者中多種酚類物質的方法，包括以下步驟：(1)樣品采集：將唾液收集管中的棉棒放于口中，咀嚼2.5min后放回收集管，于20000rpm轉速下離心10min后，得到唾液樣品；(2)樣品酸化：移取3.0mL唾液樣品于樣品管中，加入0.03mL乙酸、并加入4-氟苯酚內標并使其濃度為0.1mg/L，經(jīng)15000rpm轉速下渦旋振蕩1min至混合均勻；(3)測定：將步驟(2)得到的酸化液，過微孔濾膜，采用超高效液相色譜-多波長熒光法測定，內標法定量，根據(jù)標準曲線計算目標物含量。超高效色譜條件如下：色譜柱：C18反相色譜柱，規(guī)格為長度×內徑是100mm×2.1mm，粒徑為1.7μm；流速為0.2mL/min；柱溫為30℃；進樣量為1μL；流動相A為體積濃度為2％的乙酸水溶液，流動相B為乙酸-乙腈-水混合溶液，其中乙酸體積濃度2％，乙腈體積濃度為35％，梯度洗脫；梯度洗脫條件為：第0min，流動相A80％，流動相B20％；第12min改變流動相濃度配比，改變后的流動相A為0％，流動相B為100％；第15min停止洗脫；梯度洗脫條件見下表12：表12時間(min)流動相A(％)流動相B(％)08020120100150100所述多波長熒光法的熒光檢測器的波長選擇見下表13：表13時間(min)激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)對苯二酚290330間苯二酚278310鄰甲基對苯二酚295325鄰苯二酚278318苯酚2753084-甲基苯酚2773202-甲基苯酚2723212-甲氧基-4-甲基-苯酚2783122,6-二甲基苯酚2723022-乙基苯酚272302丁香酚2783124-氟苯酚(內標)278312表14線性相關系數(shù)、精密度(RSD)、檢出限、定量限和回收率n表示實驗重復次數(shù)。表14給出了實施例4方法分析口含煙食用者唾液中酚類物質的線性相關系數(shù)、精密度(RSD)、檢出限、定量限和回收率相關參數(shù)，上述數(shù)據(jù)表明該方法結果可靠，精密度好，適合于口含煙食用者唾液中酚類物質的分離和測定。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。當前第1頁1 2 3