本發(fā)明屬于藥物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種飼料中四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的檢測方法。
背景技術(shù)：
：隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，獸藥在畜牧業(yè)中的運(yùn)用顯著增加。由于抗菌譜廣，四環(huán)素類抗生素是我國畜牧業(yè)中生產(chǎn)量和使用量最多的一種抗生素，被廣泛作為飼料中的藥物添加劑，用于治療動物疾病和促進(jìn)動物生長。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中四環(huán)素類藥物的濫用和不遵從停藥期規(guī)定可導(dǎo)致藥物殘留，沉積于骨骼及牙組織內(nèi)，與新形成的骨、牙中所沉積的鈣相結(jié)合，導(dǎo)致牙齒持久成黃色，俗稱“四環(huán)素牙”，使出生的幼兒乳牙釉質(zhì)發(fā)育不全并出現(xiàn)黃色沉積，引起畸形或生長抑制。四環(huán)素類藥物還在肝組織中富集，造成肝損害，還可造成過敏反應(yīng)、二重感染、致畸胎作用，四環(huán)素藥物殘留易誘導(dǎo)耐藥菌株，同時造成的食品殘留也給人們身體健康帶來隱患。四環(huán)素類抗生素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在酸堿等條件下易發(fā)生變性反應(yīng)，形成差向異構(gòu)體，反應(yīng)是可逆的，平衡時差向異構(gòu)體的比例可達(dá)40％～60％。多數(shù)異構(gòu)體的藥效極低或消失，但毒性增加，己證實(shí)差向四環(huán)素對小鼠的靜脈毒性是四環(huán)素的2～3倍，己被歐盟確定為殘留標(biāo)示物，因此對四環(huán)素類藥物的異構(gòu)體進(jìn)行檢測也是非常重要和必要的。目前國內(nèi)外對四環(huán)素類藥物殘留問題十分關(guān)注，在飼料預(yù)警快速篩查中檢出土霉素、金霉素和差向金霉素，其中土霉素、金霉素超出50mg/kg的飼料允許添加范圍，依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第168號《飼料藥物添加劑使用規(guī)范》規(guī)定。迄今為止，國內(nèi)外的研究多集中于四環(huán)素類抗生素的檢測，而關(guān)于同時檢測四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的報道很少，還沒有相關(guān)飼料中四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的殘留量檢測方法。中國發(fā)明專利申請(申請?zhí)枺?00910099611.5)公開了“同時測量蜂王漿中多種四環(huán)素類藥物殘留量的檢測方法”，該方法中，前處理方法復(fù)雜，步驟繁瑣，試劑用量大，不利于綠色環(huán)保。本發(fā)明的特點(diǎn)是檢測方法簡單、快捷、綠色環(huán)保，用最簡單的提取方法，最少的試劑用量，達(dá)到最佳的結(jié)果，便于推廣應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為解決飼料中四環(huán)素類抗生素及其異構(gòu)體檢測沒有現(xiàn)行檢測方法問題，提供一種利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測飼料中四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的方法。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，采取的技術(shù)方案如下：一種飼料中四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的檢測方法，所述方法包括以下步驟：步驟一：稱取待測樣品加入提取液Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液和乙酸鉛水溶液渦動混勻，震蕩，離心，取出上清液，備用；步驟二：用甲醇、超純水活化PRiMEHLB固相萃取小柱，上清液過柱，用甲醇水溶液淋洗，真空泵抽干；甲醇洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈珊?，再用甲醇水溶液溶解殘渣，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定；步驟三：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的測定，液相色譜選用C18柱，采用0.1％甲酸乙腈和0.1％甲酸水體系，梯度洗脫，質(zhì)譜條件采用正離子模式下進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測。上述步驟一中Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液PH值為4.0～6.5，優(yōu)選PH值為5.0。上述步驟一中蛋白沉淀劑有乙酸鋅水溶液、乙酸鉛水溶液、乙酸銨溶液、三氯乙酸溶液、甲醇、乙腈和冰乙酸水溶液，優(yōu)選乙酸鉛水溶液。上述步驟二中優(yōu)選固相萃取小柱為PRiMEHLB60mg，3mL。上述步驟二中淋洗液為10％乙腈水溶液、10％甲醇水溶液、5％乙腈水溶液和5％甲醇水溶液淋洗液，優(yōu)選5％甲醇水溶液。上述步驟二中溶解殘渣的溶液為甲醇-0.1％甲酸/水溶液(5∶95，V/V)、甲醇水溶液(8∶2，V/V)和甲醇水溶液(5∶5，V/V)，優(yōu)選甲醇水溶液(5∶5，V/V)。上述步驟三優(yōu)選的液相色譜條件為色譜柱WatersBEHC18(2.1×50mm，1.7μm)；流動相為A：0.1％甲酸乙腈和B：0.1％甲酸水；梯度洗脫程序如下：0～0.5min，A5％，B95％0.5～2.5min，A5％～20％，B95％～80％2.5～4.3min，A20％～95％，B80％～5％4.3～5.3min，A95％～5％，B5％～95％流速為0.3mL/min；進(jìn)樣量10μL；優(yōu)選的質(zhì)譜條件為電噴霧正離子電離ESI(+)；多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)；電噴霧電壓：5500V；霧化氣壓力：50psi；氣簾氣壓力：30psi；輔助氣流速：60psi；離子源溫度：500℃；輔助氣流速：60psi；離子源溫度：500℃；碰撞氣：Medium。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果是：本發(fā)明的檢測方法簡單、快捷、綠色環(huán)保，用最簡單的提取方法，最少的試劑用量，達(dá)到最佳的結(jié)果。特異性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、且快速準(zhǔn)確，只需進(jìn)行一次前處理便可同時檢測飼料中6種四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體。附圖說明圖1為飼料基質(zhì)匹配四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖(5.0μg/kg)；圖2為空白飼料特征離子質(zhì)量色譜圖；圖3為空白飼料添加四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體試樣特征離子質(zhì)量色譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此，凡是對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。具體實(shí)施方式一：一種飼料中四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的檢測方法，所述方法包括以下步驟：步驟一：稱取待測樣品加入提取液Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液和乙酸鉛水溶液(為蛋白沉淀劑)渦動混勻，震蕩，離心，取出上清液，備用；步驟二：用甲醇、超純水活化PRiMEHLB固相萃取小柱，上清液過柱，用甲醇水溶液淋洗，真空泵抽干；甲醇洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈珊螅儆眉状妓芤喝芙鈿堅?，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定；步驟三：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的測定，液相色譜選用C18柱，采用0.1％甲酸乙腈和0.1％甲酸水體系，梯度洗脫，質(zhì)譜條件采用正離子模式下進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測。具體實(shí)施方式二：具體實(shí)施方式一中所述的飼料中四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的檢測方法，步驟一中Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液PH值為4.0～6.5(優(yōu)選PH值為5.0)。具體實(shí)施方式三：具體實(shí)施方式一中所述的飼料中四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的檢測方法，步驟二中選用固相萃取小柱PRiMEHLB60mg，3mL。具體實(shí)施方式四：具體實(shí)施方式一中所述的飼料中四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的檢測方法，步驟二中淋洗液選用的甲醇和水的混合體積比為5∶95。具體實(shí)施方式五：具體實(shí)施方式一中所述的飼料中四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的檢測方法，步驟二中溶解殘渣的甲醇水溶液中甲醇和水的混合體積比為5∶5。具體實(shí)施方式六：具體實(shí)施方式一中所述的飼料中四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的檢測方法，步驟三中色譜柱為WatersBEHC18色譜柱(2.1×50mm，1.7μm)，其中，2.1指內(nèi)徑，50指柱長，1.7指粒度；流動相為A：0.1％甲酸乙腈和B：0.1％甲酸水；梯度洗脫程序如下：0～0.5min，A5％，B95％；0.5～2.5min，A5％～20％，B95％～80％；2.5～4.3min，A20％～95％，B80％～5％；4.3～5.3min，A95％～5％，B5％～95％；流速為0.3mL/min；進(jìn)樣量10μL；質(zhì)譜條件為電噴霧正離子電離ESI(+)；多反應(yīng)監(jiān)測掃描(MRM)；電噴霧電壓：5500V；霧化氣壓力：50psi；氣簾氣壓力：30psi；輔助氣流速：60psi；離子源溫度：500℃；輔助氣流速：60psi；離子源溫度：500℃；碰撞氣：Medium。具體實(shí)施方式七：具體實(shí)施方式一中所述的飼料中四環(huán)素類藥物及其異構(gòu)體的檢測方法，四環(huán)素類藥物分別為四環(huán)素、土霉素、金霉素，四環(huán)素類藥物的異構(gòu)體分別為差相四環(huán)素、差相土霉素、差相金霉素。實(shí)施例1：一、樣品處理方法，包括如下步驟：步驟一：稱取飼料樣品2.00(±0.02)g于50mL離心管中，加入18mLNa2EDTA-Mcllvaine緩沖液，加2mL2％乙酸鉛水溶液渦動混勻，震蕩30min，10000r/min離心10min，取出上清液，備用；步驟二：用3mL甲醇、3mL水活化PRiMEHLB固相萃取小柱取上清液5mL過柱，用3mL5％甲醇水溶液淋洗，真空泵抽干，用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，用氮?dú)庠?0℃水浴吹干，用1.0mL甲醇水(V/V＝50/50)溶液溶解殘渣，然后，使用過濾膜0.2μm過濾，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。二、液相色譜-質(zhì)譜儀儀器條件為：1)色譜柱：BEHC18色譜柱(2.1×50mm，1.7μm)2)流動相梯度洗脫條件見表1表1流動相梯度洗脫條件時間min0.1％甲酸乙腈0.1％甲酸水0.05.095.00.55.095.01.520802.520803.395.05.04.395.05.04.45.095.05.35.095.03)流速：0.3mL/min4)進(jìn)樣量：10μL5)離子源：電噴霧離子源6)掃描方式：正離子掃描7)檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測8)電噴霧電壓(IS)：5500V9)霧化氣壓力：(GS1)：50psi10)氣簾氣壓力：(CUR)：30psi11)輔助氣流速：(GS2)：60psi12)離子源溫度：500℃13)碰撞氣(CAD)：Medium14)離子對、去簇電壓(DP)及碰撞氣能量(CE)見表2表2備注：*表示定量離子三、線性關(guān)系：四環(huán)素類混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液是用空白基質(zhì)添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液制備，樣品中添加濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100μg/kg基質(zhì)匹配系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在本發(fā)明方法確定的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣，測定峰面積，以濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)，見表3。表3表達(dá)的是四環(huán)素類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)化合物名稱標(biāo)準(zhǔn)曲線方程相關(guān)系數(shù)土霉素y＝1.24×105x+2.00×1050.99977四環(huán)素y＝1.78×105x+2.39×1050.99945金霉素y＝3.77×104x+7.14×1040.99862差向土霉素y＝1.23×105x+2.00×1050.99958差向四環(huán)素y＝5.22×104x+6.53×1040.99973差向金霉素y＝2.96×104x+1.29×1040.99925四、回收率及精密度試驗(yàn)空白飼料樣品中添加3個不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加濃度分別為5.0、10.0、20.0μg/kg，按照樣品處理方法制備樣品溶液，回收率及精密度見表4。表4表示的是四環(huán)素類抗生素的回收率及精密度(n＝5)五、靈敏度試驗(yàn)：利用本發(fā)明的方法對土霉素、四環(huán)素、金霉素、差向土霉素、差向四環(huán)素或差向金霉素的檢出限為5.0μg/kg，定量限為10.0μg/kg。當(dāng)前第1頁1 2 3