本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種油佐劑疫苗的破乳方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有的疫苗質(zhì)量標準中規(guī)定效力檢驗必須采用本動物進行檢驗，由于國家實行100％的強化免疫政策，很難選出易感的檢驗用動物，而且動物攻毒對實驗設(shè)施要求高(BSL3級實驗室)、耗時長(一個月以上)、資金花費大。如果采用血清中和試驗選擇易感動物，在技術(shù)上難以排除具有細胞免疫的非易感動物，在檢驗實際中經(jīng)常發(fā)生檢驗數(shù)據(jù)不規(guī)律的問題，影響檢驗的準確性。因此口蹄疫疫苗尤其是用于牛的疫苗的質(zhì)量檢測一直困擾著獸藥監(jiān)測部門和相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)。因此需要盡快研制體外檢驗技術(shù)，代替現(xiàn)有的本動物試驗。

當前國家對疫苗的檢驗正逐步過渡到對疫苗內(nèi)抗原的檢測，而當前較為普遍的方法為疫苗破乳后對抗原進行檢測，通過將疫苗進行破乳處理，使抗原轉(zhuǎn)移至水相中，繼而對其進行后續(xù)的檢測分析，然而現(xiàn)有的破乳方法及破乳劑并不適用于所有的油佐劑疫苗，使用傳統(tǒng)破乳劑對油佐劑疫苗進行破乳，雖然能將疫苗破乳，但是其水相中的抗原含量極低。不同破乳劑的破乳效率與破乳效果層次不齊。

雖然業(yè)內(nèi)已有破乳方法，但其效率和效果均不佳，傳統(tǒng)的破乳方法破乳后會有種種問題，例如不同疫苗使用不同破乳劑、破乳不完全、水相和油相分界不清晰、水相中檢測不到抗原等問題一直困擾著業(yè)界。如何去尋找一種通用且高效的破乳方法及如何使得疫苗內(nèi)抗原進入水相成了業(yè)內(nèi)亟待解決的問題。

中國專利CN 103088157B中提到在提取所述口蹄疫病毒RNA時，加入正戊醇作為破乳劑。但以正戊醇為破乳劑，其效率低，適用并不廣泛，且針對合成肽疫苗時其水相中并不能檢測到抗原組分，而本發(fā)明破乳時間短，在加入破乳劑后既能完成破乳，離心后取水相即可抽取水相，并能夠明顯提高抗原的回收。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種油佐劑疫苗的破乳方法。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種油佐劑疫苗的破乳方法，包括如下步驟：油佐劑疫苗與破乳劑混合，經(jīng)分層后，得水相抗原樣品；

所述破乳劑包括有機溶劑與酸的混合物，所述有機溶劑選自乙腈、正丁醇、苯甲醇、丁基二乙二醇、乙醇中的一種，所述酸選自鹽酸、乙酸、甲酸、三氟乙酸中的一種。破乳后水相經(jīng)液相色譜檢測，抗原回收率可達90％以上。

優(yōu)選地，破乳劑中有機溶劑選自乙腈、乙醇中的一種，酸選自三氟乙酸、鹽酸中的一種。

優(yōu)選地，油佐劑疫苗與破乳劑按體積比9:1～5:5進行混合。破乳劑含量過高會增加后續(xù)對水相樣品凍干或濃縮的處理時間，過低則無法破乳。

優(yōu)選地，所述破乳劑中酸與有機溶劑的體積比為(0.05～0.5)：100。

優(yōu)選地，所述油佐劑疫苗包括口蹄疫疫苗。

優(yōu)選地，所述破乳方法還包括將水相抗原樣品進行凍干或濃縮處理，即得抗原樣品；所述凍干的條件為：-80～-50℃溫度下真空冷凍12～18h。

采用本發(fā)明的破乳方法，由于抗原回收率高，得到的抗原樣品無需進一步純化，即可直接用于抗原的定量定性檢測。

在本發(fā)明中乙腈作為一種極佳的有機溶劑，對乳化膜有很強的溶解作用，能夠?qū)⒁呙缛榛と芙?，從而釋放出其中的抗原水相，抗原易溶于乙腈，乙腈與水互溶，能將抗原帶入水相中。三氟乙酸類似催化劑，促進破乳，加速乳化膜的破解，減少乙腈的用量。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

1、相比于現(xiàn)有方法，本發(fā)明提供的破乳方法破乳能力更強，能保證抗原主要分布于水相中，且水相與油相能完全分離，能真實反應(yīng)出疫苗內(nèi)有效抗原的含量及質(zhì)量，抗原回收率可達90％以上。

2、本發(fā)明提供的破乳方法適用性更廣，可用于合成肽疫苗破乳后定性定量檢測，也可用于滅活疫苗破乳后核酸檢測。

3、破乳劑成分簡單，破乳后水相中雜質(zhì)含量較少，可直接進行檢測，且對后續(xù)檢測結(jié)果的干擾較低，重復(fù)性好。

4、破乳方法更簡單，更易于推廣，更快速、也更準確。

5、口蹄疫疫苗經(jīng)過本發(fā)明破乳方法后，疫苗內(nèi)抗原成分主要存在于水相中，而其他方式破乳其抗原成分主要分布于油相中。破乳更完全，更迅速，破乳效率更高。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將會變得更明顯：

圖1為對比例1的方法破乳后水相中抗原濃度HPLC檢測圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

本實施例涉及一種口蹄疫疫苗的破乳方法，選用市售的豬口蹄疫疫苗與破乳劑混合，經(jīng)分層后，得水相抗原樣品。

所述破乳劑中有機溶劑選用乙腈，酸選用三氟乙酸，乙腈與三氟乙酸的體積比為100:0.05。取8ml待檢疫苗置于離心管內(nèi)，疫苗與破乳劑以體積比8:2混合，震蕩混勻，在4℃條件下，以3000G離心15分鐘，離心后用10ml注射器小心抽取下層水相。經(jīng)液相色譜分析后與疫苗中理論抗原濃度標準進行對比，其中，對疫苗中理論抗原濃度的HPLC檢測圖譜樣品出峰位置進行積分，其積分信息如表1所示，樣品中抗原含量以積分峰面積的形式體現(xiàn)，其積分峰面積為2738690。采用本實施例破乳方法破乳后得到的水相中抗原樣品濃度的HPLC檢測圖譜樣品出峰位置進行積分，其積分信息如表2所示，樣品中抗原含量以積分峰面積的形式體現(xiàn)，其積分峰面積為1674252。經(jīng)對比分析，使用本實施例方法抗原回收率為91.7％，相比于現(xiàn)有方法，抗原回收率大大提高。

表1

表2

注：疫苗由佐劑與抗原乳化，其佐劑與抗原的體積比為1:1，因此破乳后得到的水相為待檢疫苗體積的50％，由于本實施例中破乳劑與水互溶，因此經(jīng)本發(fā)明方法破乳后其水相體積較疫苗內(nèi)水相多出破乳劑的體積，即稀釋作用，因此本實施例中水相較理論水相(4ml)增多50％(2ml)，本實施例中破乳得到的水相檢測的積分結(jié)果應(yīng)計算稀釋效應(yīng)，即檢測積分結(jié)果除以66.67％。

實施例2

本實施例涉及一種口蹄疫疫苗的破乳方法，市售的豬口蹄疫疫苗按照如實施1中的破乳方法進行處理，所不同之處在于：取5ml待檢疫苗與破乳劑以體積比5:5混合。經(jīng)液相色譜分析后，與疫苗中理論抗原濃度標準進行對比，使用該方法抗原回收率為90.3％。

注：疫苗由佐劑與抗原乳化，其佐劑與抗原的體積比為1:1，因此破乳后得到的水相為待檢疫苗體積的50％，由于本實施例中破乳劑與水互溶，因此經(jīng)本發(fā)明方法破乳后其水相體積較疫苗內(nèi)水相多出破乳劑的體積，即稀釋作用，因此本實施例中水相較理論水相2.5ml增多200％(5ml)，本實施例中破乳得到的水相檢測的積分結(jié)果應(yīng)計算稀釋效應(yīng)，即檢測積分結(jié)果除以33.33％。

實施例3

本實施例涉及一種口蹄疫疫苗的破乳方法，將市售的豬口蹄疫疫苗按照如實施1中的破乳方法進行處理，所不同之處在于：所述破乳劑中有機溶劑選用乙醇，酸選用鹽酸，乙醇與鹽酸的體積比為100:0.33，取7ml待檢疫苗與破乳劑以體積比7:3混合。經(jīng)液相色譜分析后，與疫苗中理論抗原濃度標準進行對比，使用該方法抗原回收率為93.5％。

注：疫苗由佐劑與抗原乳化，其佐劑與抗原的體積比為1:1，因此破乳后得到的水相為待檢疫苗體積的50％，由于本實施例中破乳劑與水互溶，因此經(jīng)本發(fā)明方法破乳后其水相體積較疫苗內(nèi)水相多出破乳劑的體積，即稀釋作用，因此本實施例中水相較理論水相3.5ml增多85.7％(3ml)，本實施例中破乳得到的水相檢測的積分結(jié)果應(yīng)計算稀釋效應(yīng)，即檢測積分結(jié)果除以53.85％。

對比例1

本對比例1提供了一種口蹄疫疫苗的破乳方法，將市售的豬口蹄疫疫苗按照如下方法破乳處理：

取待檢疫苗置于離心管內(nèi)，與正丁醇以體積比8:2混合，震蕩混勻，在4℃條件下，以3000G離心15分鐘，離心后用10ml注射器小心抽取下層水相，經(jīng)液相色譜分析后與疫苗中理論抗原濃度標準進行對比，其回收率基本為零，如圖1所示。

本對比例中使用疫苗與實施例中一致，為同一批次疫苗。僅以正丁醇破乳后，其水相中抗原含量基本為零。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。