本發(fā)明涉及口蹄疫疫苗檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種油佐劑疫苗破乳后水相的純化方法。

背景技術(shù)：

口蹄疫疫苗檢測(cè)中，由于油佐劑中成分復(fù)雜，含有很多表面活性劑、免疫增強(qiáng)劑等雜質(zhì)會(huì)溶于水相中，且使用現(xiàn)有的蛋白定性定量檢測(cè)方法檢測(cè)蛋白時(shí)極易受到雜質(zhì)的干擾，造成數(shù)據(jù)波動(dòng)，因此油佐劑疫苗經(jīng)過破乳后直接使用蛋白定性定量檢測(cè)方法會(huì)影響其檢測(cè)過程，造成信號(hào)掩蓋或干擾，壓低了抗原信號(hào)的強(qiáng)度，甚至無法有效檢測(cè)到其中的抗原，業(yè)內(nèi)也沒有能夠去除上述雜質(zhì)的方法，所以在破乳后引入純化步驟以去除破乳后水相中的各類雜質(zhì)，進(jìn)而利于使用蛋白定性定量檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，解決破乳后樣品中雜質(zhì)對(duì)檢測(cè)方法，反映更真實(shí)的樣品狀態(tài)。

現(xiàn)有技術(shù)中主流的樣品純化手段為各類層析，而層析過程所需要的樣品量大，不僅會(huì)造成約30％～50％的樣品損失(在起始樣品量低時(shí)更易引起擴(kuò)散作用)，同時(shí)對(duì)設(shè)備依賴性較高。油佐劑疫苗中的抗原濃度為微克級(jí)，經(jīng)過破乳過程后會(huì)造成一部分抗原的損失，再使用層析的方式進(jìn)行純化，其抗原回收率極低，無法用于檢測(cè)，若加大疫苗破乳量，則會(huì)造成疫苗浪費(fèi)，且油佐劑中雜質(zhì)會(huì)加速縮短層析填料使用壽命，其經(jīng)濟(jì)性不佳。

現(xiàn)有的凝膠電泳純化技術(shù)中，所分離的復(fù)雜樣品其成分均為生物分子及其同類物，而非其他復(fù)雜性質(zhì)的物質(zhì)，其中處理的樣品成分相比于破乳后水相其樣品狀態(tài)更為簡(jiǎn)單?，F(xiàn)有的蛋白質(zhì)電泳后膠內(nèi)酶解技術(shù)，其程序較多，步驟復(fù)雜，經(jīng)過操作后其回收率低，微量樣品經(jīng)過處理后所能回收的樣品已無法滿足檢測(cè)要求。

目前國(guó)內(nèi)各大廠家都在探索一種實(shí)用的方法，能夠?qū)?jīng)破乳處理的疫苗中抗原進(jìn)行處理，減少抗原中的雜質(zhì)對(duì)其后續(xù)定性定量檢測(cè)分析的影響。破乳后水相中存在的表面活性劑等物質(zhì)在業(yè)內(nèi)被公認(rèn)為最難處理的雜質(zhì)，業(yè)內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)并不能對(duì)破乳后水相直接進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明中針對(duì)的樣品成分復(fù)雜，且疫苗中蛋白濃度低并不適合傳統(tǒng)純化方法，破乳后水相中又含有的表面活性劑等雜質(zhì)，不僅以游離狀態(tài)存在，其雙親的性質(zhì)還會(huì)與蛋白相結(jié)合，在電場(chǎng)力的作用下會(huì)使得雜質(zhì)與蛋白的結(jié)合鍵打開，在凝膠中實(shí)現(xiàn)分離純化。通過凝膠電泳的方式純化相比傳統(tǒng)方式其所需的樣品量將大大減少，并大幅降低對(duì)操作人員及儀器設(shè)備的依賴性，同時(shí)可使與蛋白黏連的雜質(zhì)與蛋白分離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供了一種油佐劑疫苗破乳后水相的純化方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供了一種油佐劑疫苗破乳后水相的純化方法，包括以下步驟：

S1、將口蹄疫疫苗破乳后的抗原樣品進(jìn)行凝膠電泳；

S2、切取其中一個(gè)蛋白泳道進(jìn)行染色確定目標(biāo)蛋白的條帶位置；

S3、再切取未染色凝膠上與經(jīng)步驟S2染色后的目標(biāo)蛋白條帶位置相同的凝膠進(jìn)行樣品處理；

S4、經(jīng)處理后的膠塊進(jìn)行超聲萃取，所得上清液進(jìn)行真空冷凍干燥或者低溫冷凍離心濃縮，即可。

優(yōu)選地，步驟S1中，所述凝膠電泳的條件為：采用丙烯酰胺質(zhì)量含量為5％的濃縮膠和丙烯酰胺質(zhì)量含量為12％分離膠，210V電壓下處理30-40min。。

優(yōu)選地，步驟S2中，所述染色采用銀染或者考染。

優(yōu)選地，步驟S3中，所述樣品處理具體包括以下步驟：

A1、將含目標(biāo)蛋白的凝膠經(jīng)ddH₂O清洗、乙腈震蕩脫水后，加入含二硫蘇糖醇的NH₄HCO₃水溶液進(jìn)行第一次孵育；

A2、經(jīng)第一次孵育后的膠塊用乙腈震蕩脫水后，再加入含碘乙酰胺的NH₄HCO₃水溶液進(jìn)行第二次孵育。

優(yōu)選地，所述第一次孵育條件為：56℃下孵育30min；第二次孵育條件為：RT避光孵育20min。

優(yōu)選地，所述超聲萃取的溫度為0-8℃，超聲15min，采用的萃取液為80％ACN/5％FA或80％ACN/0.05％TFA。采用超聲萃取，可加速膠內(nèi)目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取的進(jìn)行，同時(shí)縮短萃取時(shí)間。

優(yōu)選地，所述超聲萃取采用的萃取液為乙腈(ACN)質(zhì)量含量80％、甲酸(FA)質(zhì)量含量5％的混合溶液；或乙腈質(zhì)量含量80％、三氟乙酸(TFA)質(zhì)量含量0.05％的混合溶液。

萃取液更優(yōu)選乙腈質(zhì)量含量80％、甲酸質(zhì)量含量5％的混合溶液，F(xiàn)A在質(zhì)譜中對(duì)目標(biāo)信號(hào)的掩蓋較低，在進(jìn)行高精度檢測(cè)時(shí)優(yōu)選FA。本發(fā)明采用超聲萃取，利用超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化應(yīng)效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)、高的加速度、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用等多級(jí)效應(yīng)，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取的進(jìn)行。

本發(fā)明的原理是：本發(fā)明通過凝膠電泳手段，可通過分子量大小對(duì)樣品中殘留的表面活性劑等雜質(zhì)進(jìn)行分離，特異性切取目的蛋白條帶能夠進(jìn)一步降低雜質(zhì)對(duì)后續(xù)檢測(cè)的干擾。由此可實(shí)現(xiàn)高效率純化，相比常規(guī)的純化手段，本發(fā)明所需的起始樣品量較低，同時(shí)可大大提高破乳后水相中抗原的純度。且本發(fā)明在采用凝膠電泳純化步驟中，特定采用部分染色的方式，可簡(jiǎn)化抗原處理步驟，同時(shí)增加抗原回收率，降低儀器維護(hù)成本。

現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

1)本發(fā)明通過將破乳后的抗原采用電泳進(jìn)行分離純化，提高了抗原的純度，使抗原中的表面活性劑雜質(zhì)含量基本為0，從而使純化后的樣品檢測(cè)重復(fù)性良好，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2)常規(guī)凝膠電泳后均會(huì)涉及到染色及脫色步驟，在后續(xù)處理步驟中每一步均會(huì)有蛋白損失，若進(jìn)行脫色步驟，不僅會(huì)延長(zhǎng)處理時(shí)間，且脫色劑在脫色的時(shí)也會(huì)造成蛋白的損失，同時(shí)脫色劑的殘留也會(huì)影響到后續(xù)的檢測(cè)過程，更會(huì)對(duì)檢測(cè)儀器造成污染，增加設(shè)備維護(hù)及使用成本。而本發(fā)明將凝膠電泳的方法用于破乳后的抗原純化，且在本發(fā)明中僅將染色樣品泳道作為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)需后續(xù)處理的樣品泳道不進(jìn)行染色，對(duì)未染色的膠進(jìn)行處理，直接跳過脫色步驟，能夠有效避免常規(guī)電泳后續(xù)處理的上述問題發(fā)生，提高樣品回收率的同時(shí)縮短了處理時(shí)間。

3)本發(fā)明經(jīng)電泳后的抗原，通過兩次孵育，第一次孵育是為了還原膠內(nèi)抗原多肽，將抗原內(nèi)半胱氨酸間二硫鍵還原為巰基，即還原半胱氨酸。第二次孵育是為了將第一次孵育后還原的半胱氨酸和組氨酸進(jìn)行烷基化保護(hù)，使得抗原保持變性狀態(tài)，以便于后續(xù)酶解及檢測(cè)。兩次孵育后可提高抗原的酶解效率，達(dá)到極大降低檢測(cè)所需起始樣品量的目的。

4)采用本發(fā)明的純化手段制備的樣品進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)，可顯著降低圖譜信噪比，突出目標(biāo)分子。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：

圖1為實(shí)施例1制備的樣品的質(zhì)譜掃描圖譜；

圖2為對(duì)比例1未經(jīng)純化的樣品的質(zhì)譜掃描圖譜；

圖3為對(duì)比例2制備的樣品的質(zhì)譜掃描圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗破乳后水相的純化方法，包括以下步驟：

1.樣品處理：將口蹄疫疫苗破乳后經(jīng)超濾、洗濾，然后凍干后得到的蛋白抗原樣品(抗原純度為8％)，取蛋白抗原樣品加入蛋白上樣緩沖液中，采用95℃加熱2min，進(jìn)行凝膠電泳，將樣品平均上于所有空白泳道中(采用丙烯酰胺質(zhì)量含量為5％的濃縮膠和丙烯酰胺質(zhì)量含量為12％分離膠)，210V，30～40min，切取其中一個(gè)蛋白泳道進(jìn)行銀染確定目標(biāo)蛋白的條帶位置，切取未染色凝膠上與經(jīng)銀染后樣品中目標(biāo)蛋白條帶位置相同的凝膠進(jìn)行樣品處理。

2.將切取的膠塊切成1～2mm³大小的膠塊置于EP管中，加入400ul ACN震蕩脫水3min。

3.棄去液體，室溫干燥，加入溶有DTT的NH₄HCO₃溶液，56℃孵育30min。所述溶有DTT的NH₄HCO₃溶液中，DTT的濃度為0.01M。

4.自然冷卻后棄去液體，加入400ul ACN震蕩脫水3min。

5.棄去液體，自然風(fēng)干，加入溶有碘乙酰胺的NH₄HCO₃溶液適量，RT避光孵育20min。所述溶有碘乙酰胺的NH₄HCO₃溶液中，碘乙酰胺的濃度為0.1M。

6.棄去液體，加入400ul ACN震蕩脫水3min。

7.棄去液體，室溫干燥，加入Trypsin濃度為12.5ng/ul的NH₄HCO₃溶液，RT吸漲。

8.棄去液體，加入50mM NH₄HCO₃適量沒過膠塊，56℃孵育3h。

9.移去溶液置于新EP管中，加入200ul 80％ACN和5％FA的混合溶液，冰水浴超聲15min，重復(fù)3次，取上清置于新EP管中。

10.將萃取后的水相真空冷凍干燥。

11.每管以100μl 0.1％TFA溶液溶解真空冷凍干燥后粉末，質(zhì)譜待檢。

本實(shí)施例制得的粉末其質(zhì)譜圖如圖1所示樣品中理論分子量之一為611AMU，從該圖中可得出，圖中雜質(zhì)豐度已經(jīng)被降到極低的程度，而目標(biāo)分子已成為圖譜主峰，色譜檢測(cè)中樣品純度達(dá)到90％以上。圖1為經(jīng)過本實(shí)施例所述步驟處理后所得樣品的質(zhì)譜掃描圖譜，其中611.22AMU為本次實(shí)驗(yàn)中樣品目標(biāo)分子量之一。圖中可見目標(biāo)分子量豐度高，圖譜信噪比低。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗破乳后水相的純化方法，包括以下步驟：

1.樣品處理：將口蹄疫疫苗破乳后經(jīng)超濾、洗濾，然后凍干后得到的蛋白抗原樣品(抗原純度為8％)，取蛋白抗原樣品加入蛋白上樣緩沖液中，采用95℃加熱2min，進(jìn)行凝膠電泳，將樣品平均上于所有空白泳道中(采用丙烯酰胺質(zhì)量含量為5％的濃縮膠和丙烯酰胺質(zhì)量含量為12％分離膠)，210V，30～40min，切取其中一個(gè)蛋白泳道進(jìn)行考染確定目標(biāo)蛋白的條帶位置，切取未染色凝膠上與經(jīng)考染后樣品中目標(biāo)蛋白條帶位置相同的凝膠進(jìn)行樣品處理。

2.將切取的膠塊切成1～2mm³大小的膠塊置于EP管中，加入400ul ACN震蕩脫水3min。

3.棄去液體，室溫干燥，加入溶有DTT的NH₄HCO₃溶液，56℃孵育30min。所述溶有DTT的NH₄HCO₃溶液中，DTT的濃度為0.01M。

4.自然冷卻后棄去液體，加入400ul ACN震蕩脫水3min。

5.棄去液體，自然風(fēng)干，加入溶有碘乙酰胺的NH₄HCO₃溶液適量，RT避光孵育20min。所述溶有碘乙酰胺的NH₄HCO₃溶液中，碘乙酰胺的濃度為0.1M。

6.棄去液體，加入400ul ACN震蕩脫水3min。

7.棄去液體，室溫干燥，加入Trypsin濃度為12.5ng/ul的NH₄HCO₃溶液，RT吸漲。

8.棄去液體，加入50mM NH₄HCO₃適量沒過膠塊，56℃孵育3h。

9.移去溶液置于新EP管中，加入200ul 80％ACN和0.05％TFA的混合溶液，8℃水浴超聲15min，重復(fù)3次，取上清置于新EP管中。

10.將萃取后的水相真空冷凍干燥。

11.每管以100μl 0.1％TFA溶液溶解真空冷凍干燥后粉末，質(zhì)譜待檢。

本實(shí)施例制得的粉末純度達(dá)85％，所得樣品的質(zhì)譜掃描圖譜的信噪比低。

對(duì)比例1

將口蹄疫疫苗破乳后經(jīng)超濾、洗濾，然后凍干后得到的蛋白抗原樣品直接加入NH₄HCO₃，以1ug胰蛋白酶進(jìn)行消化，質(zhì)譜待檢。

本對(duì)比例檢測(cè)質(zhì)譜圖如圖2所示，從圖中可以得出，圖中雜質(zhì)豐度較高，目標(biāo)分子豐度被雜質(zhì)壓低，信號(hào)干擾嚴(yán)重，色譜檢測(cè)中樣品純度為10％。圖2為破乳后樣品直接酶解后的質(zhì)譜掃描圖譜，其圖譜較雜，目標(biāo)分子量豐度低，雜質(zhì)信號(hào)干擾嚴(yán)重，且若不去除樣品中的表面活性劑等成分，會(huì)極大影響后續(xù)質(zhì)譜的性能，增加后期保養(yǎng)維護(hù)費(fèi)用。

對(duì)比例2

本實(shí)施例提供了一種油佐劑疫苗破乳后水相的純化方法，具體采用以下步驟：

1.樣品染色：將口蹄疫疫苗破乳后經(jīng)超濾、洗濾，然后凍干后得到的蛋白抗原樣品(抗原純度為8％)加入蛋白上樣緩沖液，95℃加熱2min，凝膠電泳(5％濃縮膠，12％分離膠)，210V，30～40min，銀染。

2.染色后的樣品消化：將凝膠置于在超凈工作臺(tái)培養(yǎng)皿中用75％乙醇清洗，再用超純水清洗。

3.在超凈工作臺(tái)中用手術(shù)刀片切取目標(biāo)蛋白條帶，并將其切成1～2mm³大小的膠塊，置于EP管中。

4.在EP管中加入300ul脫色液，混勻靜置，直至棕色完全消失；所述脫色液配制如下：100mmol/L Na₂S₂O₃和30mmol/L K₃Fe(CN)₆溶液按照體積比1∶1混合而成。

5.棄去液體，加入400ul ddH₂O清洗膠塊，直至膠塊變?yōu)橥该鳌?/p>

6.棄去液體，加入400ul ACN震蕩脫水3min。

7.棄去液體，室溫干燥，加入DTT濃度為0.01M的NH₄HCO₃溶液適量，56℃孵育30min。

8.自然冷卻后棄去液體，加入400ul ACN震蕩脫水3min。

9.棄去液體，自然風(fēng)干，加入碘乙酰胺濃度為0.1M的NH₄HCO₃溶液適量，RT避光孵育20min。

10.棄去液體，加入400ul ACN震蕩脫水3min。

11.棄去液體，室溫干燥，加入Trypsin濃度為12.5ng/ul的NH₄HCO₃溶液，RT吸漲。

12.棄去液體，加入50mM NH₄HCO₃適量沒過膠塊，56℃孵育3h。

13.移去溶液置于新EP管中，加入200ul 80％ACN和0.05％TFA的混合溶液，冰水浴超聲15min，重復(fù)3次，取上清置于新EP管中。

14.將萃取后的水相真空冷凍干燥。

15.每管以100μl 0.1％TFA溶液溶解真空冷凍干燥后粉末，質(zhì)譜待檢。

采用本對(duì)比例的方法所得粉末的純度為70％左右，圖3為經(jīng)過本實(shí)施例所述步驟處理后所得樣品的質(zhì)譜掃描圖譜，相比于圖1，其信噪比更高，且由其信號(hào)強(qiáng)度低于圖1一個(gè)數(shù)量級(jí)，可推斷其抗原含量及純度均大幅低于圖1中樣品。

本發(fā)明具體應(yīng)用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)指出，以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而并不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。