本發(fā)明涉及泰樂菌素檢測技術領域，具體為一種禽肉中泰樂菌素檢測方法及試劑盒。

背景技術：

泰樂菌素(tylosin)是弗氏鏈霉菌產(chǎn)生的一種大環(huán)內酯類抗生素，自80年代開始，泰樂菌素在國際上被廣泛地用作禽畜專用的抗菌促生劑，對治療禽畜的支原體疾病和革蘭氏陽性菌的感染、促禽畜生長、降低死亡率和提高飼料轉化率有明顯的作用，泰樂菌素在動物組織中的殘留，會威脅到食品安全，對人類的健康造成危害，我國農業(yè)部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》對泰樂菌素在動物性食品中殘留制定了最高殘留限量，其中，規(guī)定了泰樂菌素在雞肝組織中的最高殘留限量為0.13mg/kg，泰樂菌素在豬肉組織中的最高殘留限量為0.2mg/kg。

近年來，食品安全問題一直為人們所討論的熱門話題，禽肉中殘留的泰樂菌素經(jīng)常被提起，禽肉中殘留的泰樂菌素嚴重危害了人們的健康，現(xiàn)有泰樂菌素的檢測方法大多為微生物法和儀器分析法，但微生物法的精確度低，儀器分析法的成本過高，過于繁瑣，檢測效率低，為此，我們提出一種高效快捷的禽肉中泰樂菌素檢測方法及試劑盒。

技術實現(xiàn)要素：

（一）解決的技術問題

針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種禽肉中泰樂菌素檢測方法及試劑盒，解決了檢測效率低的問題。

（二）技術方案

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：一種禽肉中泰樂菌素用的試劑盒，所述試劑盒的內部放置有磷酸二氫銨溶液、無水磷酸二氫銨、磷酸、二水合磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、三水合磷酸氫二鉀、正己烷、甲醇、石油醚、三蒸水和二氯甲烷。

一種禽肉中泰樂菌素檢測方法，檢測方法包括如下步驟：

S1，用移液器取出0.1-0.5mol/L的磷酸二氫銨溶液，用電子天平稱取0.1-0.5g的無水磷酸二氫銨，放入燒杯內溶解，在4-10℃的環(huán)境下，反應5-10min；

S2，量取12-14mL的磷酸，加水定容至800-1000mL，并標記為A液，稱取30-32g的二水合磷酸二氫鈉，加水定容至800-1000mL，并標記為B液，取A液450-455mL，451.6mL、453.5mL、454.1mL、B液545-550mL，548.4mL、546.5mL、545.9mL，配制成PH為2.1-2.5的磷酸鹽緩沖液I，并用PH值測定儀經(jīng)常實時監(jiān)測；

S3，用電子天平稱取4-5g的磷酸二氫鉀和0.5-0.8g的三水合磷酸氫二鉀，放入燒杯內溶解，加水定容至450-500mL，配制成 PH為5.5-5.8的磷酸鹽緩沖液II，并用PH值測定儀經(jīng)常實時監(jiān)測；

S4，稱取10-20g的禽肉樣品，粉碎后用濾紙包好放入索氏提取器中，加入0.5-1g的正己烷，用60-75℃水浴脫脂至無色，并取出晾干備用；

S5，稱取1-2g的脫脂后樣品，并放入冷凍離心機的離心管內，加入10-15mL的甲醇，超聲提取25-30min，提取完畢后，在5-10℃的環(huán)境下，8000-10000r/min離心10-15min，取上清液，殘渣再次提取2次，合并3次提取液，在4-10℃的環(huán)境下，4500-5000r/min離心5-10min，并將提取液標記為甲液；

S6，當S5完成后，取出30-50mL的甲液并放入125mL的分液漏斗中，取30-40mL的石油醚并加入分液漏斗內，振蕩1-3min，靜置分層后，取下層溶液于300mL的分液漏斗中，并加入10-20mL的三蒸水和20-30mL的二氯甲烷，振蕩3-5min，靜置分層后，將下層溶液收集在燒瓶中，再向300mL的分液漏斗加入20-30mL的二氯甲烷，振蕩3-5分鐘，靜置分層后，將下層溶液再次收集在燒瓶中；

S7，將兩次收集的二氯甲烷層在50-60℃的環(huán)境下蒸干，并標記為A殘渣，取0.5-1g的A殘渣、3-5mL的磷酸鹽緩沖液I和0.5-1mL的乙腈放入燒杯內，反應3-5min，取0.5-1g的A殘渣、3-5mL的磷酸鹽緩沖液II和0.5-1mL的乙腈放入另一個燒杯內，反應3-5min，供高效液相色譜檢測。

優(yōu)選的，所述離心管的容量為50mL。

優(yōu)選的，所述燒杯、分液漏斗和離心管的數(shù)量均至少為五個。

優(yōu)選的，所述電子天平的型號為AL204。

優(yōu)選的，所述索氏提取器的型號為SXT-06。

優(yōu)選的，所述PH值測定儀的型號為BPH-200A。

優(yōu)選的，所述冷凍離心機的型號為X-15R。

（三）有益效果

本發(fā)明提供了一種禽肉中泰樂菌素檢測方法及試劑盒，具備以下有益效果：

（1）該禽肉中泰樂菌素檢測方法及試劑盒，本申請所提出的檢測方法，實用性能好，通過磷酸鹽緩沖液I和磷酸鹽緩沖液II，配合高效液相色譜的效果，能夠對樣品內部的泰樂菌素進行有效的檢測，檢測更加方便，省時省力，檢測精確度更高。

（2）該禽肉中泰樂菌素檢測方法及試劑盒，通過設置有試劑盒，配合本申請所提出的泰樂菌素檢測方法，能夠對禽肉內的殘留泰樂菌素進行精確的檢測，有效的避免了泰樂菌素對人們健康的危害，成本更低，檢測效率高。

（3）該禽肉中泰樂菌素檢測方法及試劑盒，通過配套多個燒杯、分液漏斗和離心管，能夠進行多次檢測和對比，保證了實驗的相對精確性，本申請所提到的設備，其型號均為優(yōu)選型號，精確度更好，實驗效果更好，有效的降低了檢測的偏差。

具體實施方式

基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明提供一種技術方案：一種禽肉中泰樂菌素用的試劑盒，試劑盒的內部放置有磷酸二氫銨溶液、無水磷酸二氫銨、磷酸、二水合磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、三水合磷酸氫二鉀、正己烷、甲醇、石油醚、三蒸水和二氯甲烷。

實施例1

一種禽肉中泰樂菌素檢測方法，檢測方法包括如下步驟：

S1，用移液器取出0.1mol/L的磷酸二氫銨溶液，用電子天平稱取0.1g的無水磷酸二氫銨，放入燒杯內溶解，在4℃的環(huán)境下，反應5min；

S2，量取12mL的磷酸，加水定容至800mL，并標記為A液，稱取30g的二水合磷酸二氫鈉，加水定容至800mL，并標記為B液，取A液451.6mL，B液548.4mL，配制成PH為2.1的磷酸鹽緩沖液I，并用PH值測定儀經(jīng)常實時監(jiān)測；

S3，用電子天平稱取4g的磷酸二氫鉀和0.5g的三水合磷酸氫二鉀，放入燒杯內溶解，加水定容至450mL，配制成 PH為5.5的磷酸鹽緩沖液II，并用PH值測定儀經(jīng)常實時監(jiān)測；

S4，稱取10g的禽肉樣品，粉碎后用濾紙包好放入索氏提取器中，加入0.5g的正己烷，用60℃水浴脫脂至無色，并取出晾干備用；

S5，稱取1g的脫脂后樣品，并放入冷凍離心機的離心管內，加入10mL的甲醇，超聲提取25min，提取完畢后，在5℃的環(huán)境下，8000r/min離心10min，取上清液，殘渣再次提取2次，合并3次提取液，在4℃的環(huán)境下，4500r/min離心5min，并將提取液標記為甲液；

S6，當S5完成后，取出30mL的甲液并放入125mL的分液漏斗中，取30mL的石油醚并加入分液漏斗內，振蕩1min，靜置分層后，取下層溶液于300mL的分液漏斗中，并加入10mL的三蒸水和20mL的二氯甲烷，振蕩3min，靜置分層后，將下層溶液收集在燒瓶中，再向300mL的分液漏斗加入20mL的二氯甲烷，振蕩3分鐘，靜置分層后，將下層溶液再次收集在燒瓶中；

S7，將兩次收集的二氯甲烷層在50℃的環(huán)境下蒸干，并標記為A殘渣，取0.5g的A殘渣、3mL的磷酸鹽緩沖液I和0.5mL的乙腈放入燒杯內，反應3min，取0.5g的A殘渣、3mL的磷酸鹽緩沖液II和0.5mL的乙腈放入另一個燒杯內，反應3min，供高效液相色譜檢測。

該實施例1的檢測方法與實施例2和實施例3相比存在以下特點：

檢測用時短，檢測速度快，檢測效率高；

檢測精確度和檢測成本均低于實施例2和實施例3；

檢測精確度≥94％。

實施例2

一種禽肉中泰樂菌素檢測方法，檢測方法包括如下步驟：

S1，用移液器取出0.3mol/L的磷酸二氫銨溶液，用電子天平稱取0.3g的無水磷酸二氫銨，放入燒杯內溶解，在6℃的環(huán)境下，反應6min；

S2，量取13mL的磷酸，加水定容至900mL，并標記為A液，稱取31g的二水合磷酸二氫鈉，加水定容至900mL，并標記為B液，取A液453.5mL，B液546.5mL，配制成PH為2.3的磷酸鹽緩沖液I，并用PH值測定儀經(jīng)常實時監(jiān)測；

S3，用電子天平稱取4.5g的磷酸二氫鉀和0.7g的三水合磷酸氫二鉀，放入燒杯內溶解，加水定容至480mL，配制成 PH為5.6的磷酸鹽緩沖液II，并用PH值測定儀經(jīng)常實時監(jiān)測；

S4，稱取15g的禽肉樣品，粉碎后用濾紙包好放入索氏提取器中，加入0.8g的正己烷，用70℃水浴脫脂至無色，并取出晾干備用；

S5，稱取1.5g的脫脂后樣品，并放入冷凍離心機的離心管內，加入12mL的甲醇，超聲提取28min，提取完畢后，在8℃的環(huán)境下，900r/min離心12min，取上清液，殘渣再次提取2次，合并3次提取液，在8℃的環(huán)境下，4800r/min離心8min，并將提取液標記為甲液；

S6，當S5完成后，取出40mL的甲液并放入125mL的分液漏斗中，取35mL的石油醚并加入分液漏斗內，振蕩2min，靜置分層后，取下層溶液于300mL的分液漏斗中，并加入15mL的三蒸水和25mL的二氯甲烷，振蕩4min，靜置分層后，將下層溶液收集在燒瓶中，再向300mL的分液漏斗加入25mL的二氯甲烷，振蕩4分鐘，靜置分層后，將下層溶液再次收集在燒瓶中；

S7，將兩次收集的二氯甲烷層在55℃的環(huán)境下蒸干，并標記為A殘渣，取0.8g的A殘渣、4mL的磷酸鹽緩沖液I和0.8mL的乙腈放入燒杯內，反應4min，取0.8g的A殘渣、4mL的磷酸鹽緩沖液II和0.8mL的乙腈放入另一個燒杯內，反應4min，供高效液相色譜檢測。

該實施例2的檢測方法存在以下特點：

該實施例2的檢測精確度和檢測成本均高于實施例1，但實施例2的檢測速度和檢測效率均低于實施例1，且實施例2的檢測時間長于實施例1的檢測時間；

該實施例2的檢測精確度和檢測成本均低于實施例3，但實施例2的檢測速度和檢測效率均高于實施例3，且實施例2的檢測時間短于實施例3的檢測時間；

檢測精確度≥96%。

實施例3

一種禽肉中泰樂菌素檢測方法，檢測方法包括如下步驟：

S1，用移液器取出0.5mol/L的磷酸二氫銨溶液，用電子天平稱取0.5g的無水磷酸二氫銨，放入燒杯內溶解，在10℃的環(huán)境下，反應10min；

S2，量取14mL的磷酸，加水定容至1000mL，并標記為A液，稱取32g的二水合磷酸二氫鈉，加水定容至1000mL，并標記為B液，取A液454.1mL，B液545.9mL，配制成PH為2.5的磷酸鹽緩沖液I，并用PH值測定儀經(jīng)常實時監(jiān)測；

S3，用電子天平稱取5g的磷酸二氫鉀和0.8g的三水合磷酸氫二鉀，放入燒杯內溶解，加水定容至500mL，配制成 PH為5.8的磷酸鹽緩沖液II，并用PH值測定儀經(jīng)常實時監(jiān)測；

S4，稱取20g的禽肉樣品，粉碎后用濾紙包好放入索氏提取器中，加入1g的正己烷，用75℃水浴脫脂至無色，并取出晾干備用；

S5，稱取2g的脫脂后樣品，并放入冷凍離心機的離心管內，加入15mL的甲醇，超聲提取30min，提取完畢后，在10℃的環(huán)境下，10000r/min離心15min，取上清液，殘渣再次提取2次，合并3次提取液，在10℃的環(huán)境下，5000r/min離心10min，并將提取液標記為甲液；

S6，當S5完成后，取出50mL的甲液并放入125mL的分液漏斗中，取40mL的石油醚并加入分液漏斗內，振蕩3min，靜置分層后，取下層溶液于300mL的分液漏斗中，并加入20mL的三蒸水和30mL的二氯甲烷，振蕩5min，靜置分層后，將下層溶液收集在燒瓶中，再向300mL的分液漏斗加入30mL的二氯甲烷，振蕩5分鐘，靜置分層后，將下層溶液再次收集在燒瓶中；

S7，將兩次收集的二氯甲烷層在60℃的環(huán)境下蒸干，并標記為A殘渣，取1g的A殘渣、5mL的磷酸鹽緩沖液I和1mL的乙腈放入燒杯內，反應5min，取1g的A殘渣、5mL的磷酸鹽緩沖液II和1mL的乙腈放入另一個燒杯內，反應5min，供高效液相色譜檢測。

該實施例3的檢測方法與實施例1和實施例2相比存在以下特點：

檢測精確度和檢測成本均高于實施例1和實施例2；

檢測時間長，檢測速度慢，檢測效率低；

檢測精確度≥98%。

綜上所述，該禽肉中泰樂菌素檢測方法及試劑盒，本申請所提出的檢測方法，實用性能好，通過磷酸鹽緩沖液I和磷酸鹽緩沖液II，配合高效液相色譜的效果，能夠對樣品內部的泰樂菌素進行有效的檢測，檢測更加方便，省時省力，檢測精確度更高，通過設置有試劑盒，配合本申請所提出的泰樂菌素檢測方法，能夠對禽肉內的殘留泰樂菌素進行精確的檢測，有效的避免了泰樂菌素對人們健康的危害，成本較低，檢測效率高，檢測精確度≥98%。

需要說明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關系術語僅僅用來將一個實體或者操作與另一個實體或操作區(qū)分開來，而不一定要求或者暗示這些實體或操作之間存在任何這種實際的關系或者順序。而且，術語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下。由語句“包括一個......限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設備中還存在另外的相同要素”。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。