本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其涉及一種用于測(cè)定三碘甲狀腺原氨酸的試劑盒。
背景技術(shù)：
三碘甲狀腺原氨酸(T3)屬于小分子項(xiàng)目，現(xiàn)有T3免疫測(cè)定試劑的抗體一般為多克隆抗體或鼠的單克隆抗體，在特異性和靈敏度方面都有所欠缺?，F(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有稀釋待標(biāo)記抗體至固定濃度，標(biāo)記微量抗體時(shí)操作不方便，同時(shí)批間差異大，不同批次的試劑盒功能差距較大，造成穩(wěn)定性較低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種用于測(cè)定三碘甲狀腺原氨酸的試劑盒，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中T3免疫測(cè)定試劑的特異性和靈敏度方面都比較差的問(wèn)題。
為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種用于測(cè)定三碘甲狀腺原氨酸的試劑盒，包括羊單抗包被的磁珠、ANS解離劑和酶工作液；羊單抗包被的磁珠上標(biāo)記有生物素。ANS解離劑為含ANS的解離劑(ANS：8-苯胺-1-萘磺酸8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid)。
進(jìn)一步，所述羊單抗包被的磁珠的制備方法為：將羊單抗稀釋到設(shè)定的濃度，對(duì)稀釋后的羊單抗進(jìn)行生物素標(biāo)記獲得生物素抗體，將生物素抗體包被在裸磁珠上獲得羊單抗包被的磁珠；所述設(shè)定的濃度為固定值。
在對(duì)羊單抗標(biāo)記之前，將羊單抗稀釋到特定的濃度，可以提高試劑盒的穩(wěn)定性，不同批次的試劑盒功能相近。
進(jìn)一步，設(shè)定的濃度在0.1mg/mL～0.6mg/mL內(nèi)取值。
羊單抗稀釋到特定的濃度在該范圍內(nèi)時(shí)，試劑盒的效價(jià)較高，而且穩(wěn)定性好。
進(jìn)一步，所述羊單抗包被的磁珠的制備方法為：
A、采用PBS緩沖液對(duì)羊單抗透析，取出透析完畢后的羊單抗；將透析完畢后取出的羊單抗稀釋到設(shè)定的濃度；
B、將BNHS溶于DMSO中，配置成BNHS溶液；其中BNHS(N-羥基琥珀酰亞胺生物素酯；EZ-Link NHS-LC-Biotin，50mg，廠家：Thermo Prod#21336)；
C、將稀釋后的羊單抗和BNHS溶液混合并反應(yīng)，反應(yīng)設(shè)定時(shí)間后，加入Tris緩沖液終止反應(yīng)，獲得生物素抗體；
E、采用PBS緩沖液對(duì)生物素抗體進(jìn)行透析；
F、取出透析后的生物素抗體，生物素抗體包被裸磁珠，獲得羊單抗包被的磁珠。
進(jìn)一步，所述羊單抗包被的磁珠的制備方法為：
A、采用0.1～0.3mol/L的PBS緩沖液對(duì)的羊單抗透析，透析的溫度為2～8℃；取出透析析完畢后的羊單抗，將羊單抗稀釋到設(shè)定的濃度；
B、將BNHS溶于DMSO中，配置成8～12mmol/L的BNHS溶液；
C、將步驟A解析后的羊單抗和步驟B配制的BNHS溶液混合并反應(yīng)28～33分鐘；
D、用0.8～1.2mol/L的Tris緩沖液終止步驟C的反應(yīng)；獲得生物素抗體；
E、采用濃度為0.1～0.3mol/L的PBS緩沖液對(duì)生物素抗體進(jìn)行透析，透析的溫度為2～8℃；
F、向透析后的生物素抗體加入丙三醇，生物素抗體與丙三醇體積比為4:5～5:4；
G、生物素抗體包被裸磁珠，獲得羊單抗包被的磁珠；用0.08～0.12％BSA的緩沖液對(duì)羊單抗包被的磁珠稀釋到設(shè)定濃度。
進(jìn)一步，酶工作液為BSA的緩沖液和ALP標(biāo)記的T3衍生物的混合溶液。ALP標(biāo)記的T3衍生物為堿性磷酸酶標(biāo)記的T3衍生物，在一種類似T3抗原的分子上連接堿性磷酸酶，既具有酶的高催化性，又具有T3抗原的特異性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明采中包含羊單抗包被的磁珠，磁微粒(磁珠)上包被的是生物素的抗體，抗體為羊的單克隆抗體，試劑盒的特異性和靈敏度都比之前的T3免疫測(cè)定試劑高。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例一：
一種用于測(cè)定三碘甲狀腺原氨酸的試劑盒，包括羊單抗包被的磁珠、ANS解離劑和酶工作液，羊單抗包被的磁珠上標(biāo)記有生物素。
所述羊單抗包被的磁珠的制備方法為：
A、取0.25mg羊單抗，用0.2mmol/L PBS(PH7.4)緩沖液5L進(jìn)行2～8℃透析過(guò)夜。
B、取出透析好的羊單抗于適當(dāng)容器，準(zhǔn)確量取體積并記錄，將羊單抗稀釋為0.5mg/mL備用。
C、稱取1.0mg的BNHS，用217μLDMSO充分溶解，配制成10mmol/L的BNHS溶液。
D、將配制好的BNHS與羊單抗的比例為20：1的量加入到透析后的羊單抗中，充分混勻后室溫反應(yīng)30min。即1.0mg的抗體加入10mmol/LBNHS 13.3μL。0.25mg加入配置好的10mmol/LBNHS 3.3μL。
E、取1mol/LTris緩沖液進(jìn)行終止反應(yīng)，加入1mol/LTris緩沖液于反應(yīng)液中。加入Tris的體液為上述反應(yīng)液終體積的百分之一，充分混勻，室溫反應(yīng)10Min。
F、取出終止后的反應(yīng)液裝入透析袋，用0.2mol/L PBS(PH7.4)緩沖液5L進(jìn)行2～8℃透析過(guò)夜。
G、將透析好的生物素抗體取出，并準(zhǔn)確量取體積，加入等體積的丙三醇，貼簽，并記錄濃度，于-20℃保存，備用。
H、將生物素標(biāo)記好的生物素抗體包被裸磁珠，包被量為1μg/mg，獲得羊單抗包被的磁珠。用1％BSA的緩沖液Buffer稀釋后，備用。
實(shí)施例二：
一種用于測(cè)定三碘甲狀腺原氨酸的試劑盒，包括羊單抗包被的磁珠、ANS解離劑和酶工作液，羊單抗包被的磁珠上標(biāo)記有生物素。
所述羊單抗包被的磁珠的制備方法為：
A、取0.2mg羊單抗，用0.12mol/L PBS(PH7.4)緩沖液4.5L進(jìn)行2～8℃透析過(guò)夜。
B、取出透析好的羊單抗于適當(dāng)容器，準(zhǔn)確量取體積并記錄，將羊單抗稀釋為0.2mg/mL備用。
C、將BNHS溶于DMSO中，配制成8mmol/L的BNHS溶液。
D、將配制好的BNHS與羊單抗的比例為18：1的量加入到透析后的羊單抗中，充分混勻后室溫反應(yīng)28min。
E、取1mol/L的Tris緩沖液進(jìn)行終止反應(yīng)，加入1mol/LTris緩沖液于反應(yīng)液中。加入Tris的體液為上述反應(yīng)液終體積的百分之一，充分混勻，室溫反應(yīng)11Min。
F、取出終止后的反應(yīng)液裝入透析袋，用0.2mol/L的PBS(PH7.4)緩沖液5L進(jìn)行2～8℃透析過(guò)夜。
G、將透析好的生物素抗體取出，并準(zhǔn)確量取體積，向透析后的生物素抗體加入丙三醇，生物素抗體與丙三醇體積比為4:5，貼簽，并記錄濃度，于-20℃保存，備用。
H、將生物素標(biāo)記好的生物素抗體包被裸磁珠，包被量為0.12μg/mg，獲得羊單抗包被的磁珠。用1％BSA的緩沖液Buffer稀釋后，備用。
實(shí)施例三：
一種用于測(cè)定三碘甲狀腺原氨酸的試劑盒，包括羊單抗包被的磁珠、ANS解離劑和酶工作液，羊單抗包被的磁珠上標(biāo)記有生物素。
所述羊單抗包被的磁珠的制備方法為：
A、取0.3mg羊單抗，用0.12mol/LPBS(PH7.4)緩沖液6L進(jìn)行2～8℃透析過(guò)夜。
B、取出透析好的羊單抗于適當(dāng)容器，準(zhǔn)確量取體積并記錄，將羊單抗稀釋為0.1mg/mL備用。
C、將BNHS溶于DMSO中，配制成11mmol/L的BNHS溶液。
D、將配制好的BNHS與羊單抗的比例為21：1的量加入到透析后的羊單抗中，充分混勻后室溫反應(yīng)31min。
E、取1.1mol/L的Tris緩沖液進(jìn)行終止反應(yīng)，加入1.1mol/LTris緩沖液于反應(yīng)液中。加入Tris的體液為上述反應(yīng)液終體積的百分之一，充分混勻，室溫反應(yīng)9Min。
F、取出終止后的反應(yīng)液裝入透析袋，用0.3mol/L的PBS(PH7.5)緩沖液5.5L進(jìn)行2～8℃透析過(guò)夜。
G、將透析好的生物素抗體取出，并準(zhǔn)確量取體積，向透析后的生物素抗體加入丙三醇，生物素抗體與丙三醇體積比為5:4，貼簽，并記錄濃度，于-20℃保存，備用。
H、將生物素標(biāo)記好的生物素抗體包被裸磁珠，包被量為0.09μg/mg，獲得羊單抗包被的磁珠。用0.11％BSA的緩沖液Buffer稀釋后，備用。
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果：
實(shí)驗(yàn)一：兔多抗、鼠單抗和羊單抗在同等情況下，試劑盒靈敏度與特異性比較實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)材料：BNHS，0.2mol/L PBS(PH7.4)緩沖液，1mmol/LTris緩沖液，丙三醇，DMSO，T3抗體3種(兔多抗，鼠單抗，羊單抗)，含有1％BSA的緩沖液Buffer，ALP標(biāo)記的T3衍生物，ANS解離劑，裸磁珠，T3校準(zhǔn)品cal-1,cal-5(將T3純品稀釋到含5％BSA的緩沖液Buffer，Cal-1到Cal-5的濃度為0，0.3，1，3，10ng/mL)，高濃度T4，底物液，清洗液，濱松光子半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀。
采用實(shí)施例一的方法，將上述兔多抗、鼠單抗和羊單抗包被的磁珠分別與解離劑，酶工作液共同組成試劑盒，測(cè)定T3校準(zhǔn)品cal-1至cal-5，及高濃度的T4，觀察不同抗體的測(cè)定曲線及特異性。
反應(yīng)模式為：先加入校準(zhǔn)品30μL，磁珠50μL，解離劑50μL37℃共同孵育15min后，再加入酶工作液37℃孵育15Min，加入清洗液在磁場(chǎng)中清洗分離三次后，加入底物液37℃孵育5Min后，于半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀上檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示：
表1
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：采用兔多抗的試劑盒靈敏度和特異性均較差，采用鼠單抗的試劑盒曲線基本滿足使用，靈敏度夠用，但特異性較差。采用羊單抗的試劑盒靈敏度和特異性均有很大的提高。
實(shí)驗(yàn)二：不同濃度的羊單抗，試劑盒靈敏度與特異性比較實(shí)驗(yàn)。
有三批羊單抗，濃度分別5mg/mL，2.5mg/mL，1mg/mL，分別標(biāo)記生物素后，按照實(shí)驗(yàn)一的方法對(duì)T3校準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，觀察批間差。
實(shí)驗(yàn)材料：BNHS，0.2mol/L PBS(PH7.4)緩沖液，1mol/L的Tris緩沖液，丙三醇，DMSO，T3抗體(均為羊單抗，濃度分別為5mg/mL，2.5mg/mL，1mg/mL)，含有1％BSA的緩沖液Buffer，ALP標(biāo)記的T3衍生物，ANS解離劑，裸磁珠，T3校準(zhǔn)品cal-1,cal-5(將T3純品稀釋到含5％BSA的緩沖液Buffer，Cal-1到Cal-5的濃度為0，0.3，1，3，10ng/mL)，底物液，清洗液，濱松光子半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀。
實(shí)驗(yàn)方法參照實(shí)驗(yàn)一；備注：將三種濃度的抗體進(jìn)行透析后，回收體積基本不變，則透析后的濃度依然與原濃度一致。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2：
表2
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：同為羊單抗，但由于標(biāo)記生物素時(shí)濃度不同，按相同的標(biāo)記方法所制備的試劑盒批間差較大，且抗體濃度越大，試劑盒的效價(jià)越低。
實(shí)驗(yàn)三：固定T3抗體濃度，試劑盒靈敏度與特異性比較實(shí)驗(yàn)。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)二所得出的結(jié)論，將羊單抗均稀釋到相同的濃度，再進(jìn)行生物素的標(biāo)記，觀察對(duì)批間差和效價(jià)的影響。
實(shí)驗(yàn)材料：BNHS，0.2mol/LPBS(PH7.4)緩沖液，1mol/LTris緩沖液，丙三醇，DMSO，T3抗體(均為羊單抗，濃度分別為5mg/mL，2.5mg/mL，1mg/mL)，含有1％BSA的緩沖液Buffer，ALP標(biāo)記的T3衍生物，ANS解離劑，裸磁珠，T3校準(zhǔn)品cal-1,cal-5(將T3純品稀釋到含5％BSA的緩沖液Buffer，Cal-1到Cal-5的濃度為0，0.3，1，3，10ng/mL)，底物液，清洗液，濱松光子半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀。
實(shí)驗(yàn)方法參照實(shí)驗(yàn)一，將實(shí)施例一步驟B中“取出透析好的羊單抗于適當(dāng)容器，準(zhǔn)確量取體積并記錄，將羊單抗稀釋為0.5mg/mL備用?！碧鎿Q為：“取出透析好的羊單抗于適當(dāng)容器，準(zhǔn)確量取體積并記錄，將三種不同濃度的抗體均稀釋成0.5mg/mL備用?！?/p>
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3：
表3
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：將三種不同濃度的羊單抗均稀釋到0.5mg/mL后標(biāo)記生物素，然后包被磁珠構(gòu)成的的三種T3試劑盒的效價(jià)基本一致，曲線基本相同，稀釋后抗體標(biāo)記生物素能夠有效控制產(chǎn)品的批間差。
實(shí)驗(yàn)四：不同濃度的羊單抗進(jìn)行生物素標(biāo)記，試劑盒靈敏度與特異性比較實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)二和實(shí)驗(yàn)三中2.5mg/mL以及將2.5mg/mL稀釋至0.5mg/mL進(jìn)行生物素標(biāo)記后包被的兩種磁珠，酶工作液，解離劑，T3校準(zhǔn)品，底物液，清洗液，濱松光子半自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀，恒溫培養(yǎng)箱。
實(shí)驗(yàn)方法：將制備好的兩種磁珠，每種等體積分成兩份，一份與2-8℃保存，一份于恒溫培養(yǎng)箱中37℃保存，6天后取出。將四份磁珠分別于解離劑和酶工作液配合測(cè)定T3校準(zhǔn)品。觀察校準(zhǔn)品的發(fā)光信號(hào)，計(jì)算信號(hào)保留率，驗(yàn)證磁珠的穩(wěn)定性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4：
表4
實(shí)驗(yàn)結(jié)論：抗體稀釋后標(biāo)記生物素抗體包被的磁珠37攝氏度存放后信號(hào)保留率更高，穩(wěn)定性更好。
綜上四個(gè)實(shí)驗(yàn)可以得出：表明T3測(cè)定試劑盒在采用羊單抗時(shí)，靈敏度和特異性均有效提高。在生物素標(biāo)記之前，將羊單抗稀釋為一個(gè)固定的設(shè)定濃度，可以提高試劑盒的穩(wěn)定性，設(shè)定濃度太低會(huì)浪費(fèi)資源。
以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，但本發(fā)明的技術(shù)特征并不局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的領(lǐng)域內(nèi)，所作的變化或修飾皆涵蓋在本發(fā)明的專利范圍之中。