專利名稱：甲狀腺功能檢測蛋白芯片及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外臨床檢驗和化學(xué)發(fā)光免疫法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于甲狀腺 功能檢測蛋白芯片及其試劑盒。
背景技術(shù)：
甲狀腺是人體最大的內(nèi)分泌腺，能分泌甲狀腺素(T4)，三碘甲狀腺原氨酸(T3)等 激素。這些激素受由腺垂體分泌的促甲狀腺素(TSH)的調(diào)節(jié)，對人體的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、 維生素，水和鹽的代謝以及人體的生長發(fā)育起著十分重要的作用。甲狀腺功能紊亂為內(nèi)分 泌疾病中最常見者，并至今仍易被漏診。據(jù)美國對11個城市4. 6萬人的普查中發(fā)現(xiàn)，有約 11 %的人存在未被診斷出的各種甲狀腺功能紊亂。甲狀腺功能紊亂可分為甲狀腺功能亢進 癥(hyperthyroidism，簡稱甲亢)和甲狀腺功能減退癥(hypothyroidism，簡稱甲減)?？勾偌谞钕偌に?TSH)是由腺垂體嗜堿細(xì)胞中的S細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)甲狀腺功能的 主要激素，半衰期60min。它是一種糖蛋白，分子量為觀000。腺垂體TSH呈脈沖式釋放，每 池 4h出現(xiàn)一次波動，日周期變化是清晨高而午后低。它能促進酪氨酸的碘化和碘化酪氨 酸的縮合，促進細(xì)胞內(nèi)RNA和蛋白質(zhì)包括甲狀腺球蛋白的合成等。過量的甲狀腺素是TSH 分泌最重要的生理抑制性因子，TSH濃度降低強烈提示甲狀腺功能發(fā)生亢進。由于TSH檢 測技術(shù)靈敏度的提高使其不僅可區(qū)分甲狀腺功能減低，診斷甲狀腺功能亢進，亞臨床型甲 狀腺功能減低或甲狀腺功能亢進，甚至可以評價門診和非甲狀腺疾病住院病人甲狀腺功能 狀況。三碘甲狀腺原氨酸CH)分子量為651，大約65%由甲狀腺直接產(chǎn)生，35% T4在外 周組織脫碘形成。在外周血中，99. 6%與甲狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)結(jié)合。T3是已知目前生 物活性最強的甲狀腺激素，其生物活性為T4的3倍 5倍，臨床上一般將未與TBG結(jié)合的 T3稱為游離T3，即游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)，只有游離的T3具有代謝活性，而未結(jié)合 的則沒有。FT3可以通過細(xì)胞膜與受體結(jié)合發(fā)揮生理效應(yīng)，因此它是甲狀腺激素發(fā)生生理 效應(yīng)的的真正活性部分，能較確切地反映甲狀腺的功能狀態(tài)及其他對人體機能的影響。在 多數(shù)甲狀腺功能亢進病例中，血清T3和T4的升高相平行，而T3毒癥時僅T3升高，T4在正 常范圍。甲狀腺功能亢進病人在進行放射性或藥物治療過程中，血清T4降至正常，而T3仍 高于正常，直至臨床甲狀腺功能恢復(fù)正常，血清T3才降至正常，故T3又可作為判斷療效的 可靠指標(biāo)。在某些疾病，如肝硬變時，T3可能降低，但只要甲狀腺功能正常，T4則在正常范 圍。因此，作為評價甲狀腺功能低下的指標(biāo)，測定T3不如T4可靠。甲狀腺素(T4)是由甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞合成和分泌的甲狀腺激素，半衰期為7d, 其結(jié)構(gòu)由一個酪氨酸殘基和一個酚環(huán)組成，與T3的區(qū)別僅在于多一個碘原子。T4入血后約 99.6%與結(jié)合蛋白結(jié)合，結(jié)合T4與游離甲狀腺素(FT4)之間呈可逆的平衡狀態(tài)，只有游離 T4才能進入靶細(xì)胞與受體結(jié)合發(fā)揮其生理功能。甲狀腺功能亢進，醫(yī)源性或中毒性甲狀腺 功能亢進T4與FT4都升高；亞急性甲狀腺炎或慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎T4、FT4 —過性升 高；各種原因所致TBG升高，如雌激素，肝炎等，也使T4升高但FT4不升高；精神病及一些非甲狀腺疾病病人，極少數(shù)人會出現(xiàn)T4升高，但并無甲狀腺功能亢進癥狀，原發(fā)病緩解后T4 恢復(fù)正常。甲狀腺功能減低時，T4降低，且T4的降低先于T3的降低，甲狀腺缺乏或先天性 發(fā)育不良及甲狀腺全切后，血清TT4降低。各種原因所致的甲低病例中，F(xiàn)T4均顯著低于正 常范圍，但妊娠36周后，F(xiàn)T4呈正常生理性降低。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和化學(xué)發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)是目前國內(nèi)市場上檢測甲狀腺功能相關(guān)指標(biāo)的主要手段。但由于 ELISA方法操作繁瑣、耗時較長，且檢測范圍以及靈敏度不如CLIA，目前已逐步處于被淘汰 的階段。雖然CLIA檢測結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高，但由于國內(nèi)目前技術(shù)不夠成熟，主要還是應(yīng)用 國外的電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA)等自動化免疫檢測 儀，其操作體系封閉，必須配備昂貴的儀器以及專用的試劑盒，成本高且只能進行單指標(biāo)檢 測(一般醫(yī)院對甲狀腺功能進行檢測時會同時對多項指標(biāo)進行檢測)，在國內(nèi)不易推廣。因此市場上需要一種成本更低、檢測范圍廣，能夠節(jié)省檢測時間、提高檢測效率的 甲狀腺功能類檢測產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要提供一種專門用于甲狀腺功能檢測的蛋白芯片及其試劑盒。解決目前市 場上甲狀腺功能檢測產(chǎn)品檢測能力單一、檢測成本高，并且沒有集成化的缺點。本發(fā)明的技術(shù)方案如下提供一種甲狀腺功能檢測蛋白芯片，包括基板和位于基 板上的反應(yīng)孔，所述的反應(yīng)孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被有游離三碘甲狀腺 原氨酸抗體、游甲狀腺素抗體、三碘甲狀腺原氨酸抗體、甲狀腺素抗體、促甲狀腺激素抗體 中兩種或兩種以上抗體的微點陣。所述的反應(yīng)孔由兩類組成，一類反應(yīng)孔包被有游離三碘甲狀腺原氨酸抗體、游甲 狀腺素抗體，另一類反應(yīng)孔包被有三碘甲狀腺原氨酸抗體、甲狀腺素抗體、促甲狀腺激素抗 體。所述的兩類反應(yīng)孔按1 1的數(shù)量排列于基板上。所述的各類反應(yīng)孔數(shù)量為4-30。所述的游離三碘甲狀腺原氨酸抗體、游甲狀腺素抗體、三碘甲狀腺原氨酸抗體、甲 狀腺素抗體、促甲狀腺激素抗體在固相載體上各有2-8個點樣點，在每一反應(yīng)孔內(nèi)還包被
有一定位基準(zhǔn)點。所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。本發(fā)明還提供了一種甲狀腺功能檢測蛋白芯片試劑盒，它包括權(quán)利要求1所述的 甲狀腺功能檢測蛋白芯片。還包括酶標(biāo)工作液和檢測液、陰性對照、陽性對照品。所述的酶標(biāo)工作液由HRP標(biāo)記的抗體、抗原或抗原類似物組成，所述的檢測液由 發(fā)光物和過氧化氫二種試劑組成。所述的發(fā)光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。本發(fā)明將目前醫(yī)院最常檢測的甲狀腺功能項目集中于一張芯片上，可同時對同一 血清的5項指標(biāo)進行檢測。該發(fā)明可以大大節(jié)省時間和資源，提高檢測效率、降低檢測成 本。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1 一種甲狀腺功能檢測蛋白芯片的制備其步驟主要是(1)準(zhǔn)備基質(zhì)硝酸纖維素膜；(2)設(shè)計芯片，在奇數(shù)列反應(yīng)孔中用 FT3抗體和FT4抗體作為包被的抗體，在偶數(shù)列反應(yīng)孔中用T3抗體、T4抗體和TSH抗體作 為包被的抗體；(3)點樣針從384孔板吸出抗體噴點于硝酸纖維素膜上；(4)裝配硝酸纖維 素膜，并且進行封閉、干燥、包裝、保存。上述用于檢測甲狀腺功能的蛋白芯片的制備方法具體包括以下步驟1.甲狀腺功能檢測相關(guān)抗原抗體等的確定用于制備甲狀腺功能檢測蛋白芯片檢測指標(biāo)抗原的購買自Fitzgerald ；FT3、FT4 類似物購買自 Sigma-aldrich ；所采用的檢測抗體買自Meridian life。2.點樣制備具檢測指標(biāo)涂層的膜芯片用Gesim點樣儀噴點，點樣針從384孔板吸出抗體噴點于硝酸纖維素膜上，點 陣形式為10X5矩形陣列，當(dāng)點直徑為0. Imm,點橫向間距為0. 6mm，抗體陣列的大小為 6mmX5mm ；點樣后貼膜，封閉；最后將芯片干燥、包裝后于4°C保存。3.蛋白芯片組裝用具有分隔反應(yīng)區(qū)域的器具將反應(yīng)區(qū)域固定。組裝方式見ZL032298900。實施例2 試劑盒的制備一種甲狀腺功能檢測蛋白芯片試劑盒，由甲狀腺功能檢測蛋白芯片，標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控 品，樣本稀釋液，酶標(biāo)工作液，濃縮洗滌液，檢測液組成；各部分為瓶裝，用紙質(zhì)模板固定于 包裝盒內(nèi)，不限放置方式，檢測時配套使用。以下是各部分的制備方法1.甲狀腺功能檢測蛋白芯片為6X8孔板，由硝酸纖維素膜做為片基，組裝方式見 ZL032298900。2.標(biāo)準(zhǔn)品提供12管，每管0. 2ml。用含有3% BSA和0. 05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)配 置，其中T3、I^FTSaF1M和TSH標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度見下表CC ( pg/ml) 標(biāo)準(zhǔn)品 I標(biāo)準(zhǔn)品II標(biāo)準(zhǔn)品III標(biāo)準(zhǔn)品IV 標(biāo)準(zhǔn)品V 標(biāo)準(zhǔn)品VIT3 00.751. 53.0 6.0 10.0T4 02.05.010.0 15.0 25.0FT3 00.92.25.0 9.0 19.0FT4 02.08.040.0 80.0 120.0TSH 00. 52.05.0 10.0 25.0
3.質(zhì)控品提供4瓶，每瓶0. 2ml。
質(zhì)控品分為4個濃度，分別是質(zhì)控品I、質(zhì)控品II、質(zhì)控品III、質(zhì)控品IV。這四個 質(zhì)控品為分別含有不同濃度的不同抗原混合液。
質(zhì)控品是用含有3% BSA和0. 05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)配制，下表顯示T3、T4、FT3、FT4和TSH質(zhì)控品的終濃度及質(zhì)控界限。cc (U /ml)質(zhì)控品I 質(zhì)控品II 質(zhì)控品III 質(zhì)控品IVT32. 484.41(±15%)(±15DT4
FT3(士 15%)(±15%)1.37 7.10(±15%) (±15%)FT43. 79 70. 60(±15%) (±15%)TSH1.4615.48(±15幻(±15%)上述質(zhì)控品質(zhì)控界限測定方法如下分別由2個實驗人員按照標(biāo)準(zhǔn)實驗操作檢測質(zhì)控品，重復(fù)4次/板，每天每人重復(fù) 測2塊芯片，重復(fù)檢測10天，分別計算質(zhì)控品的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，質(zhì)控界限為X士 15%。4.樣本稀釋液由3% BSA和0.05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)配制而 成。提供1瓶，9ml。用于稀釋血清樣本(體積比1 1)。5.酶標(biāo)工作液由3% BSA和0. 05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)配成溶液， 酶標(biāo)工作液I含有HRP標(biāo)記的T3、T4抗原和TSH單克隆抗體；酶標(biāo)工作液II含有HRP標(biāo)記的FT3、FT4類似物，以上兩種酶標(biāo)工作液均含有檢測抗體HRP-羊抗兔IgG。提供1. 5ml，各 1瓶。6.濃縮洗滌液(IOX)為磷酸鹽緩沖液。由以下方法配置而成磷酸二氫鉀6. 8g，磷酸氫二鈉7. lg， TWEEN-2010ml，溶于1000ml純化水。各化學(xué)物質(zhì)均為分析純。提供50ml，1瓶。使用前用 450ml去離子水稀釋，混勻。7.檢測液使用 PIERCE 公司的SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate 作為配套檢測液。A液、B液各1瓶，每瓶0.6ml。實施例3 蛋白芯片及試劑盒的應(yīng)用及檢測本發(fā)明所述的用于檢測甲狀腺功能的蛋白芯片的應(yīng)用，主要采用競爭法和雙抗夾 心法檢測人血液中的相關(guān)指標(biāo)。方法是將人血清加于芯片表面，再加入酶標(biāo)工作液，直接進 行反應(yīng)；加入檢測液后1分鐘，掃描并收集信號，樣本點的信號強度與血清中抗原的濃度成 線性關(guān)系。在上述用于檢測甲狀腺功能的蛋白芯片試劑盒的應(yīng)用中，其抗原抗體反應(yīng)及檢測 的具體使用方法如下(1)對噴點抗體、陽性對照、陰性對照的芯片用3% BSA溶液進行封閉，室溫2小 時，封閉基片表面非特異性位點；(2)甩干封閉液后，室溫放置4小時，進行干燥；(3)在芯片的反應(yīng)區(qū)域，加入人血清樣品、標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品；每孔加IOOul ；(4)在基數(shù)列加入酶標(biāo)工作液I，在偶數(shù)列加入酶標(biāo)工作液II，50ul/每孔。置于 恒溫反應(yīng)儀中37°C，振蕩反應(yīng)1小時，使充分反應(yīng)；(5)反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)儀上洗滌5次，洗液量設(shè)置為每孔350ul。(6)將 PIERCE 公司的 SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate的配套使用的檢測液A液和B液1 1混合，加入芯片上各反應(yīng)區(qū)域上，每陣列 加60ul，進行化學(xué)發(fā)光；(7)用CCD檢測儀進行化學(xué)發(fā)光的掃描并收集信號，依據(jù)掃描結(jié)果顯示分析檢測結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種甲狀腺功能檢測蛋白芯片，包括基板和位于基板上的反應(yīng)孔，其特征在于所 述的反應(yīng)孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被有游離三碘甲狀腺原氨酸抗體、游甲 狀腺素抗體、三碘甲狀腺原氨酸抗體、甲狀腺素抗體、促甲狀腺激素抗體中兩種或兩種以上 抗體的微點陣。
2.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)板，其特征在于，所述的反應(yīng)孔由兩類組成，一類反應(yīng)孔包 被有游離三碘甲狀腺原氨酸抗體、游甲狀腺素抗體，另一類反應(yīng)孔包被有三碘甲狀腺原氨 酸抗體、甲狀腺素抗體、促甲狀腺激素抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的反應(yīng)板，其特征在于，所述的兩類反應(yīng)孔按1 1的數(shù)量排列于 基板上。
4.如權(quán)利要求3所述的反應(yīng)板，其特征在于，所述的各類反應(yīng)孔數(shù)量為4-30。
5.如權(quán)利要求1或2所述的反應(yīng)板，其特征在于，所述的游離三碘甲狀腺原氨酸抗體、 游甲狀腺素抗體、三碘甲狀腺原氨酸抗體、甲狀腺素抗體、促甲狀腺激素抗體在固相載體上 各有2-8個點樣點，在每一反應(yīng)孔內(nèi)還包被有一定位基準(zhǔn)點。
6.如權(quán)利要求1所述的反應(yīng)板，其特征在于，所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。
7.一種甲狀腺功能檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，它包括權(quán)利要求1所述的甲狀 腺功能檢測蛋白芯片。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，還包括酶標(biāo)工作液和檢測液、陰性對照、 陽性對照品。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶標(biāo)工作液由HRP標(biāo)記的抗體、抗 原或抗原類似物組成，所述的檢測液由發(fā)光物和過氧化氫二種試劑組成。
10.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的發(fā)光物為魯米諾、異魯米諾或其 衍生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甲狀腺功能檢測蛋白芯片及其試劑盒，該試劑盒包括甲狀腺功能檢測蛋白芯片，芯片上包被有游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)抗體、游離甲狀腺素(FT4)抗體、三碘甲狀腺原氨酸抗體(T3)、甲狀腺素(T4)抗體、促甲狀腺激素(TSH)抗體。本發(fā)明可以定量檢測出病人血清FT3、FT4、T3、T4、TSH的含量，用于輔助診斷甲狀腺功能紊亂疾病。與傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)相比，本發(fā)明不僅保留了ELISA技術(shù)的高度特異性，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、可靠性和操作的簡便性，采用的化學(xué)發(fā)光法能提高檢測的靈敏度，并能夠同時檢測出多項指標(biāo)，大大節(jié)約了時間和成本。
文檔編號G01N33/544GK102095869SQ20091020038
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者汪寧梅, 王通, 穆宇豪, 穆海東 申請人:上海裕隆生物科技有限公司