本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，且特別涉及一種紅細(xì)胞剪切模量的測量方法和血液輸氧能力測量方法。

背景技術(shù)：

紅細(xì)胞主要功能是為生物組織和器官輸送氧氣，同時研究表明紅細(xì)胞具有免疫功能，紅細(xì)胞在人體生理機(jī)能的正常運轉(zhuǎn)中發(fā)揮著重要作用。在循環(huán)系統(tǒng)中，紅細(xì)胞需通過直徑小于自身尺寸的毛細(xì)血管，因此變形能力對于紅細(xì)胞具有重要意義，成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)考察血液輸氧能力的重要指標(biāo)?，F(xiàn)有的測量紅細(xì)胞膜彈性的技術(shù)包括激光衍射法、粘度法以及微孔濾篩法，這些方法僅可用于表征群體細(xì)胞的彈性，可實現(xiàn)單個細(xì)胞操縱的微吸管法則因為操作難度大而不具有實用性。對于單細(xì)胞的彈性模量的測量一直無法實現(xiàn)。目前對于單個細(xì)胞膜彈性的測量一般采用光鑷技術(shù)，但使用光鑷測量紅細(xì)胞膜彈性模量的操作過程較為繁瑣。在樣品的預(yù)處理上，對于手柄微球的修飾一直受到研究者們的青睞。

發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，功能化試劑修飾手柄微球?qū)y量的影響未知，而且微球修飾耗時較多、費用較高；在測量操作上，已有的光鑷測量方法為測量單個紅細(xì)胞的拉伸曲線，需要多次以不同的力拉伸紅細(xì)胞，頻繁地移動樣品臺；以上的缺點都嚴(yán)重影響了紅細(xì)胞膜彈性模量的測量效率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種紅細(xì)胞剪切模量的測量方法，此測量方法測量過程操作簡單、測量效率高且測量精度高。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種血液輸氧能力的測量方法，通過測量血液中紅細(xì)胞的剪切模量，得到血液的輸氧能力，應(yīng)用價值大。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

本發(fā)明提出一種紅細(xì)胞剪切模量的測量方法，其包括：

添加步驟：將孵化溶液加入樣品池，孵化溶液中含有紅細(xì)胞和電介質(zhì)微球，電介質(zhì)微球包括粘附于紅細(xì)胞相對兩側(cè)的第一電介質(zhì)微球以及未與紅細(xì)胞粘附的第二電介質(zhì)微球；

光阱剛度標(biāo)定步驟：使用掃描光鑷捕捉第二電介質(zhì)微球，對掃描光鑷的光阱剛度進(jìn)行標(biāo)定；

拉伸步驟：使用掃描光鑷捕獲紅細(xì)胞任意一側(cè)的第一電介質(zhì)微球，擬合得到紅細(xì)胞的相對伸長量與光阱力的關(guān)系曲線，關(guān)系曲線的斜率為k，其中，相對伸長量為紅細(xì)胞被拉伸后的伸長長度與紅細(xì)胞的直徑的比值，關(guān)系曲線的斜率k為相對伸長量與光阱力的比值；

計算步驟：計算紅細(xì)胞的剪切模量，計算公式如下：

其中，H為紅細(xì)胞的剪切模量，k為關(guān)系曲線的斜率，d為紅細(xì)胞的直徑，B為扭曲剪切模量，B＝2×10^-19Nm。

本發(fā)明提出一種血液輸氧能力測量方法，其包括利用上述紅細(xì)胞剪切模量的測量方法測量待測血液的紅細(xì)胞剪切模量。

本發(fā)明的有益效果是：

使用掃描光鑷技術(shù)，對紅細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)拉伸操作，不需要多次對紅細(xì)胞進(jìn)行拉伸操作，頻繁移動操作臺，可以簡化操作步驟，極大地縮短實驗操作的時間。標(biāo)定掃描光鑷的光阱剛度，再通過對紅細(xì)胞的連續(xù)拉伸得到紅細(xì)胞的相對伸長量與光阱力的關(guān)系曲線，根據(jù)關(guān)系曲線的斜率k值即可計算得到紅細(xì)胞的剪切模量。該紅細(xì)胞剪切模量的測量方法測量過程簡單、易于操作，測量的效率高，且測量結(jié)果的精度高。

同時，利用上述測量方法可簡單、快速測量出待測血液紅細(xì)胞的剪切模量，與健康血液的紅細(xì)胞剪切模量進(jìn)行比對分析，剪切模量越大，待測血液紅細(xì)胞的變形能力越小，紅細(xì)胞通過毛細(xì)血管進(jìn)行輸氧的能力越低。通過待測血液紅細(xì)胞的剪切模量即可得到待測血液輸氧能力的大小。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例的AOD掃描光鑷系統(tǒng)的示意圖；

圖2為本發(fā)明實施例的測量方法的示意圖，其中圖2(a)為紅細(xì)胞拉伸前的示意圖；圖2(b)為紅細(xì)胞拉伸后的示意圖；

圖3為本發(fā)明實施例的光阱剛度標(biāo)定過程圖；

圖4為本發(fā)明實施例的紅細(xì)胞相對伸長量和光阱力的關(guān)系曲線。

圖標(biāo)：11-激光源；12-聲光偏轉(zhuǎn)器；13-透鏡；14-分色鏡；15-倒置顯微鏡；16-CMOS攝像器；17-光阱移動；18-樣品；19-照明光；1-二氧化硅微球；2-紅細(xì)胞；3-光鑷；4-樣品池底部。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實施例的紅細(xì)胞剪切模量的測量方法進(jìn)行具體說明。

本發(fā)明實施例提供的一種紅細(xì)胞剪切模量的測量方法。

實驗前，使用真空采血管采集健康捐贈者的血液和電介質(zhì)微球作為實驗樣品，電介質(zhì)微球優(yōu)選為直徑2～4μm的二氧化硅微球。

進(jìn)一步地，選用直徑為4μm的二氧化硅微球，實驗結(jié)果表明，該直徑下的二氧化硅微球，其粒徑的均一性較高，與紅細(xì)胞的粘附幾率更大。且當(dāng)采用熱運動分析方法標(biāo)定光阱剛度時，用光鑷捕獲該粒徑的二氧化硅微球，二氧化硅微球偏離光阱中心的位移較小，光阱力和位移值的線性關(guān)系良好，標(biāo)定得到的光阱剛度精度高。

使用二氧化硅微球作為手柄微球，二氧化硅微球能夠以非特異性結(jié)合力粘附到紅細(xì)胞上，不需要使用修飾劑進(jìn)行修飾，避免因為修飾劑對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響。同時簡化操作步驟，節(jié)約操作費用。

樣品清洗：

分別對二氧化硅微球、紅細(xì)胞進(jìn)行清洗。具體為：二氧化硅微球溶液和血液樣品分別使用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，二氧化硅微球采用超聲清洗10～20min，6000～8000rpm離心10～15min收集，重復(fù)2～3次；紅細(xì)胞采用攪動分散、2000～3000rpm離心10～15min收集，重復(fù)2～3次。

孵化步驟：

將清洗過的二氧化硅微球、紅細(xì)胞重新分散在PBS中，調(diào)整紅細(xì)胞的濃度為1×10⁵～2×10⁵個/μl，且調(diào)整二氧化硅微球和紅細(xì)胞的質(zhì)量濃度比為2～4:1，將二者等比例混合均勻。在1～5℃環(huán)境靜置孵化30～60min得到孵化溶液。此時，孵化溶液中含有相對兩側(cè)均粘附有二氧化硅微球的紅細(xì)胞和未與紅細(xì)胞粘附的二氧化硅微球。紅細(xì)胞相對兩側(cè)粘附的二氧化硅微球即為第一電介質(zhì)微球，未與紅細(xì)胞粘附的二氧化硅微球即為第二電介質(zhì)微球。進(jìn)一步地，二氧化硅微球和紅細(xì)胞的質(zhì)量濃度比為2:1，該質(zhì)量濃度比下，紅細(xì)胞兩側(cè)對稱粘附兩個二氧化硅微球的概率增大，保證較優(yōu)的實驗條件，滿足測量需求。

在本發(fā)明較佳的實施例中，孵化溫度優(yōu)選為4℃，孵化時間優(yōu)選為40min。4℃環(huán)境下，保證紅細(xì)胞的形態(tài)不發(fā)生改變，同時該孵化時間下，保證二氧化硅微球和紅細(xì)胞的充分粘附。

樣品池處理步驟：

在樣品池底部形成干血清蛋白層，優(yōu)選為：蓋玻片和載玻片使用1～2％的牛血清蛋白溶液浸泡15～30min晾干，形成底部涂覆有少量牛血清蛋白的樣品池。在樣品池底部形成干血清蛋白層，能夠減少二氧化硅微球與樣品池底部的非特異性粘附力，利于控制紅細(xì)胞上的二氧化硅微球的兩種粘附到樣品池底部的狀態(tài)，減少測量的影響因素，保證測量的準(zhǔn)確性。

在本發(fā)明較佳的實施例中，在無塵的環(huán)境中晾干樣品池，避免雜質(zhì)污染樣品池。樣品池晾干后，使用50～100μm厚塑料片墊在蓋玻片和載玻片之間形成樣品室。

添加步驟：

稀釋孵化溶液至紅細(xì)胞的濃度為1×10³～2×10³個/μl，然后滴加入樣品室后密封樣品池。優(yōu)選地，采用加拿大樹膠對樣品池進(jìn)行封閉，減少氣流對測量的影響，保證測量的準(zhǔn)確性和精密度。

光阱剛度標(biāo)定步驟：使用不同光功率下的掃描光鑷捕捉未粘附在紅細(xì)胞上的二氧化硅微球，對掃描光鑷的光阱剛度進(jìn)行標(biāo)定。

光鑷在對微小粒子進(jìn)行捕獲時，微小粒子受到一個指向光阱中心的力的作用，這一捕獲力即為光阱力。光阱力與微小粒子偏離光阱中心的位移成正比，即

F＝-k_x·Δx， (1)

式中，F(xiàn)為光阱力，k_x為光阱剛度，Δx為微小粒子偏離光阱中心的位移。

因此，光阱剛度的標(biāo)定是測量光阱力的基礎(chǔ)。光阱剛度的標(biāo)定方法包括功率譜分析法、流體力學(xué)方法、熱運動分析法、外加周期力法等。在本發(fā)明較佳的實施例中，采用熱運動分析法標(biāo)定掃描光鑷對二氧化硅微球的光阱剛度。

熱運動分析法的標(biāo)定原理為：用光阱捕獲一個微小粒子時，從顯微鏡中可明顯觀察到，此微小粒子做受限的布朗運動。微小粒子的運動范圍基本上都在光阱的簡諧范圍內(nèi)，且目標(biāo)微粒在光阱中的布朗運動滿足Boltzmann(玻爾茲曼)分布。樣品池中的溫度不是很高，光阱的軸向深度不是很淺的時候，光阱中微小粒子布朗運動不會躍出光阱的簡諧范圍，光阱中心附近的勢場為簡諧勢場E(x)，E(x)的計算公式如下：

假設(shè)光阱捕獲住的微小粒子的偏離光阱中心的偏離量為x，此時微小粒子的勢能為E(x)，根據(jù)微小粒子在光阱中的位置分布滿足Boltzmann分布，則此處微小粒子處在該處的幾率p(x)如下：

式中，p(x)為微小粒子的概率，k_B為玻爾茲曼常數(shù)，a是歸一化常數(shù)，T是開氏溫度。

通過實驗大量測量光阱中二氧化硅小球的位置，統(tǒng)計二氧化硅微球的位置分布機(jī)率，利用公式(3)得到E(x)值，既而得到掃描光鑷的光阱剛度。采用不同光功率的掃描光鑷對二氧化硅微粒進(jìn)行捕獲，得到光功率和光阱剛度的關(guān)系曲線。結(jié)果表明，光功率和光阱剛度的線性關(guān)系良好，與理論結(jié)果相一致，因此該標(biāo)定方法簡單可行，測量結(jié)果準(zhǔn)確。

拉伸步驟：

使用掃描光鑷捕獲紅細(xì)胞任意一側(cè)的二氧化硅微球，連續(xù)拉伸紅細(xì)胞，擬合得到紅細(xì)胞的相對伸長量與光阱力的關(guān)系曲線，該關(guān)系曲線的斜率為k。其中，紅細(xì)胞的相對伸長量為紅細(xì)胞被拉伸后的伸長長度與紅細(xì)胞的直徑的比值，關(guān)系曲線的斜率k為相對伸長量與光阱力的比值。

計算步驟：

計算紅細(xì)胞的剪切模量，計算公式如下：

其中，H為紅細(xì)胞的剪切模量，k為紅細(xì)胞的相對伸長量與光阱力的關(guān)系曲線的斜率，d為紅細(xì)胞的直徑，B為扭曲剪切模量，B＝2×10^-19Nm。

在本發(fā)明較佳的實施例中，采用聲光偏轉(zhuǎn)器掃描光鑷，即AOD掃描光鑷進(jìn)行光阱剛度的標(biāo)記和紅細(xì)胞的拉伸。掃描光鑷的核心部件是光束偏轉(zhuǎn)器，通常使用掃描振鏡、聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD)、電光偏轉(zhuǎn)器等器件。

本發(fā)明實施例采用AOD掃描光鑷，AOD掃描光鑷系統(tǒng)如圖1所示。激光源11發(fā)射的激光束通過聲光偏轉(zhuǎn)器2調(diào)制光的傳播路徑，經(jīng)過透鏡13、二色鏡14，在倒置顯微鏡15的像平面上快速掃描，通過計算機(jī)20控制光阱移動17，使激光束在幾個固定點之間快速切換。其在樣品池18內(nèi)中形成陣列光鑷，可以捕獲微?；蚴沁M(jìn)行動態(tài)操作，通過控制光鑷的掃描速度，可以使被捕獲的粒子沿光束的掃描軌跡運動。相比于單光鑷和雙光鑷的操作，使用AOD掃描光鑷可以極大地簡化操作步驟，對提高操作的效率和操作的精準(zhǔn)度。

如圖2所示為紅細(xì)胞的拉伸過程，在孵化后，兩個二氧化硅微球1粘附在紅細(xì)胞2沿直徑方向的兩側(cè)，其中紅細(xì)胞2一側(cè)的二氧化硅微球1非特異性地粘附在樣品池底部4，采用AOD掃描光鑷3捕獲另一側(cè)的二氧化硅微球1，將其從樣品池的底部拉離，連續(xù)拉伸紅細(xì)胞2。優(yōu)選地，沿兩個二氧化硅微球1連線的方向連續(xù)拉伸紅細(xì)胞2。進(jìn)一步優(yōu)選地，計算機(jī)操作紅細(xì)胞2的拉伸速率小于或等于0.02μm/s，在此拉伸速率下，二氧化硅微球1與樣品池的粘附力可忽略不計，此時，紅細(xì)胞2受到的拉力大小與光阱力相等，使得測量的結(jié)果更為精確。

每個紅細(xì)胞2的連續(xù)拉伸過程都被攝像器記錄和保存下來。拉伸過程中，光阱力，即施加到紅細(xì)胞2上的拉力不斷增大，通過二氧化硅微球1中心和光阱中心的位移值Δx，結(jié)合標(biāo)定得到的光阱剛度，可以得到拉伸過程的實時光阱力。

通過圖像分析軟件分析拉伸視頻，得到紅細(xì)胞2的相對伸長量與光阱力的關(guān)系曲線，對該關(guān)系曲線進(jìn)行擬合，得到關(guān)系曲線的斜率k，代入公式(4)中，計算得到紅細(xì)胞2的剪切模量。

在本發(fā)明較佳的實施例中，使用CMOS鏡頭記錄紅細(xì)胞2的拉伸過程。CMOS全稱為Complementary Metal-Oxide-Semicondoctor，中文學(xué)名為互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體，用其制成的CMOS鏡頭能夠快速處理不斷變化的影像，其靈敏度更高，能夠?qū)崿F(xiàn)對納米粒子圖像的更精確測定，是測量結(jié)果更為精準(zhǔn)可靠。

本發(fā)明實施例還提供一種血液輸氧能力測量方法，其包括利用上述紅細(xì)胞剪切模量的測量方法測量得到待測血液的紅細(xì)胞剪切模量。測量得到的紅細(xì)胞剪切模量越大，紅細(xì)胞的變形能力越小，血液的輸氧能力越差。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實施例

本實施例提供的一種紅細(xì)胞剪切模量的測量方法。

S1：樣品池的處理

蓋玻片和載波片使用1％的牛血清蛋白溶液浸泡20min晾干，使用100μm厚塑料片墊在蓋玻片和載玻片之間形成樣品室。

S2：樣品清洗

實驗用二氧化硅微球溶液原濃度為2.5％w/v，使用真空采血管采集健康捐贈者的血液作為測量樣品，分別取100μl二氧化硅微球和10μl血樣進(jìn)行清洗。二氧化硅微球溶液和血液樣品分別使用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋，二氧化硅微球采用超聲清洗15min，7000rpm離心10min收集，重復(fù)3次；紅細(xì)胞采用攪動分散、2500rpm離心10min收集，重復(fù)2次。

S3：孵化

將清洗過的二氧化硅微球重新分散在0.1ml PBS中、紅細(xì)胞重新分散在2.5ml PBS中，配得質(zhì)量濃度比為2:1的溶液，等比例混合均勻，在4℃環(huán)境靜置40min得到孵化溶液。

S4：添加樣品

將孵化溶液稀釋100倍滴加入樣品室后密封樣品池。

S5：標(biāo)定光阱剛度

使用光鑷捕獲未粘附于紅細(xì)胞的二氧化硅微球，此時二氧化硅小球僅受光阱力而無任何外力。采用熱運動分析法標(biāo)定不同光功率下的光鑷光阱剛度。

如圖3所示為光阱剛度的標(biāo)定過程。采用激光功率P為200mW的光鑷捕獲懸浮的二氧化硅微球，受捕獲的二氧化硅微球在光阱中的運動軌跡如圖3(a)所示，二氧化硅微球的位置分布概率如圖3(b)所示，擬合得到光阱勢能，如圖3(c)所示，即可得到光阱剛度。熱運動分析法標(biāo)定不同光功率下的光鑷光阱剛度，結(jié)果如圖3(d)所示，結(jié)果表明，光鑷光阱剛度和激光功率成良好的線性關(guān)系。該結(jié)果與理論計算結(jié)果相一致，表明上述標(biāo)定方法準(zhǔn)確可行。通過線性擬合可以得到不同光功率下的光鑷光阱剛度。

S5：拉伸紅細(xì)胞

使用光鑷捕獲粘附到紅細(xì)胞上的兩個二氧化硅微球之一，如圖2所示，用較大的力把二氧化硅微球拉離樣品池底部，沿著兩個二氧化硅微球的連線方向連續(xù)拉伸紅細(xì)胞，并用CMOS鏡頭記錄拉伸過程；使用圖像分析軟件分析實驗視頻。得到光阱力和紅細(xì)胞的相對伸長量之間的關(guān)系曲線；通過對關(guān)系曲線的線性擬合可以得到曲線斜率k，利用斜率k帶入計算公式(4)可得出紅細(xì)胞膜的剪切剪切模量。

如圖4所示，選取直徑為7.70μm、6.87μm、7.07μm、7.25μm和7.18μm的紅細(xì)胞作為重復(fù)測量對象，分別用光鑷對上述紅細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)拉伸，得到五條紅細(xì)胞相對伸長量和光阱力關(guān)系曲線。對上述關(guān)系曲線進(jìn)行擬合，得到圖4中的關(guān)系曲線斜率k分別為0.0448、0.0433、0.03、0.036和0.031。

將斜率k代入公式(4)計算得到紅細(xì)胞剪切模量分別為7.61μN(yùn)/m、8.48μN(yùn)/m、14.48μN(yùn)/m、10.86μN(yùn)/m和13.43μN(yùn)/m。因此，通過重復(fù)測量多個紅細(xì)胞，得到它們的平均剪切模量為H＝10.95±2.67μN(yùn)/m。該方法測得的紅細(xì)胞剪切模量與其他文獻(xiàn)公布的同類細(xì)胞的測量結(jié)果基本一致。

綜上所述，本發(fā)明實施例提供的紅細(xì)胞剪切模量的測量方法，可以實現(xiàn)紅細(xì)胞受力面積均一化，減少修飾試劑對測量結(jié)果的影響。使用掃描光鑷技術(shù)對紅細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)拉伸，不需要頻繁移動樣品臺。采用熱運動分析法分析光阱剛度并計出紅細(xì)胞拉伸過程中施加于細(xì)胞上的拉力，操作步驟少，操作方法簡單，可操作性強(qiáng)，能夠極大地縮短紅細(xì)胞剪切模量的測量時間。同時，該測量方法的費用低、效率高、測量結(jié)果的精度高，具有良好的應(yīng)用前景。

以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細(xì)描述并非旨在限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。