本發(fā)明涉及一種堿性磷酸酶的活性檢測方法，尤其涉及的是一種基于熒光和比色雙重模式檢測堿性磷酸酶活性的方法、制備的傳感器及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

堿性磷酸酶(ALP)是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經(jīng)肝臟向膽外排出的一種酶。這些酶在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)過程的調(diào)控包括細(xì)胞周期，生長，凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著舉足輕重的作用。因此，堿性磷酸酶一直被視為重要的生物標(biāo)志物。正常血清堿性磷酸酶水平在20～140U/L之間，異常的堿性磷酸酶水平可能會導(dǎo)致一系列的疾病包括乳腺癌、前列腺癌、骨疾病、糖尿病和肝功能疾病。因此，尋找一個方便和靈敏的分析方法對堿性磷酸酶活性進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測是迫切需要的。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道多種檢測堿性磷酸酶活性的分析方法包括比色法，化學(xué)發(fā)光，電化學(xué)方法，表面增強(qiáng)共振拉曼散射方法和熒光法。在這些分析方法中，比色法和熒光法檢測具有靈敏度高、高效率、高通量、可直接測量和不需要任何先進(jìn)儀器等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為一個有吸引力和有前途的候選方法。

石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)，石墨烯家族的一個新成員，最近發(fā)現(xiàn)其屬于一類零維石墨復(fù)合材料分為單層、雙層和多層，伴隨著橫向尺寸小于100nm。與傳統(tǒng)半導(dǎo)體材料量子點(diǎn)相比，石墨烯量子點(diǎn)表現(xiàn)出優(yōu)異的化學(xué)惰性，易于生產(chǎn)以及展現(xiàn)出低的細(xì)胞毒性和良好的的生物相容性。另外，值得一提的是，由于量子約束和邊緣效應(yīng)，石墨烯量子點(diǎn)展現(xiàn)出較高的光致發(fā)光和緩慢的熱載流子弛豫，使它們的性質(zhì)不同于傳統(tǒng)的石墨烯片。石墨烯量子點(diǎn)的上述優(yōu)點(diǎn)使其在化學(xué)催化、藥物輸送系統(tǒng)、傳感器和成像等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。然而，石墨烯量子點(diǎn)的應(yīng)用發(fā)展仍處在初始階段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于熒光和比色雙重模式檢測堿性磷酸酶活性的方法、制備的傳感器及應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明的一種基于熒光和比色雙重模式檢測堿性磷酸酶活性的方法，包括以下步驟：

(1)制備石墨烯量子點(diǎn)；

(2)將堿性磷酸酶溶液投入到過量的L-抗壞血酸-2-磷酸溶液中，然后將混合物置于堿性緩沖溶液中共同孵育，生成L-抗壞血酸；

(3)往步驟(2)的混合物中加入雙蒸水、石墨烯量子點(diǎn)和硝酸銀溶液進(jìn)一步混合孵育；

(4)銀納米粒子逐步沉積在石墨烯量子點(diǎn)表面，石墨烯量子點(diǎn)表面的熒光強(qiáng)度逐步降低，石墨烯量子點(diǎn)表面沉積的銀納米粒子的吸光度逐漸增加；

(5)根據(jù)熒光強(qiáng)度或吸光度的變化，進(jìn)行堿性磷酸酶活性的定量檢測。

所述步驟(1)中，石墨烯量子點(diǎn)的直徑在10nm以下，平均直徑為1～3nm，其熒光光譜的最大激發(fā)波長Ex和最大發(fā)射波長Em分別為362nm和461nm。

石墨烯量子點(diǎn)可通過檸檬酸加熱得到，反應(yīng)溫度為220℃，反應(yīng)時(shí)間為20min，然后逐滴加入到0.25M的氫氧化鈉溶液中，充分?jǐn)嚢?0min，再用0.22μm的微孔濾膜過濾，3.5kDa的透析袋透析24h，真空冷凍干燥制得粉末。

所述步驟(2)中，共同孵育的條件是溫度為25～40℃，時(shí)間為10～20min。

所述步驟(2)中，堿性緩沖溶液中含有無水硫酸鎂，pH為9.8，所述堿性緩沖溶液選自三羥甲基氨基甲烷-硝酸緩沖溶液、二乙醇胺-硝酸緩沖溶液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液、碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液中的至少一種，所述硫酸鎂的濃度為0.2～2mM。

所述L-抗壞血酸-2-磷酸的溶液，用量為50μL，濃度為10～40mM；目標(biāo)物堿性磷酸酶溶液用量為20μL，緩沖液用量為200μL。

加入多余的雙蒸水的目的是將反應(yīng)體系的最終體積定在2mL，用作溶劑和定容。

所述步驟(3)中，混合孵育的條件為：溫度為20～40℃，時(shí)間為20～60min，pH大于6。

雙蒸水體積為1580μL，量子點(diǎn)溶液的濃度為6～10mg/mL，用量為50μL，硝酸銀溶液的濃度為10～40mM，用量為100μL。

所述L-抗壞血酸-2-磷酸、石墨烯量子點(diǎn)和硝酸銀溶液的體積比為1～3:1～3:1～6。

所述步驟(3)中，納米銀粒子沉積在量子點(diǎn)表面得到納米復(fù)合結(jié)構(gòu)，所述納米復(fù)合結(jié)構(gòu)的直徑在100nm以下，平均直徑在10～20nm，在415nm波長處有最大紫外吸收。

所述步驟(5)中，堿性酶活性的定量檢測過程具體如下：配置一系列不同濃度的堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到反應(yīng)體系中，監(jiān)測反應(yīng)體系吸光度或相對熒光強(qiáng)度的變化，根據(jù)吸光度的變化ΔA_415nm或相對熒光強(qiáng)度(F₀-F)/F₀隨堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液活性的變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到堿性磷酸酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將待測樣品加入到反應(yīng)體系中，監(jiān)測反應(yīng)體系吸光度的變化ΔA_415nm或相對熒光強(qiáng)度的變化(F₀-F)/F₀，根據(jù)堿性磷酸酶活性的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，推算出堿性磷酸酶的用量，從而實(shí)現(xiàn)待測樣品中堿性磷酸酶活性的定量檢測。

堿性磷酸酶用于催化L-抗壞血酸-2-磷酸(AA-P)反應(yīng)得到L-抗壞血酸(AA)，L-抗壞血酸(AA)與硝酸銀(AgNO₃)反應(yīng)生成納米銀粒子，納米銀粒子沉積在量子點(diǎn)表面得到納米復(fù)合結(jié)構(gòu)。L-抗壞血酸-2-磷酸溶液是過量的，石墨烯量子點(diǎn)和硝酸銀的量是已知的。

所述步驟(5)中，利用紫外可見光譜的比色法檢測，堿性磷酸酶活性在0.3～10U/L范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，檢測限為0.1U/L；利用熒光光譜的熒光法檢測，堿性磷酸酶活性在0.05～2.5U/L范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，檢測限為0.02U/L。

一種使用所述的檢測堿性磷酸酶活性的方法制備的傳感器。

如所述的一種傳感器在堿性磷酸酶抑制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的測定原理是：利用酶促反應(yīng)和GQDs@Ag納米復(fù)合結(jié)構(gòu)的光學(xué)特性。堿性磷酸酶催化L-抗壞血酸-2-磷酸(AA-P)去磷酸化，生成具有還原性的L-抗壞血酸(AA)，可與硝酸銀(AgNO₃)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，生成銀納米粒子沉積于石墨烯量子點(diǎn)表面，隨著堿性磷酸酶濃度的增加，銀納米殼的生成增加，檢測液的顏色在可見光下從無色變?yōu)辄S色，在365nm紫外燈下，量子點(diǎn)的熒光從明亮的藍(lán)色熒光到熒光逐漸淬滅。紫外可見分光光度計(jì)下，隨著納米銀粒子的生成增加，溶液在415nm處的吸光度逐漸增加。在熒光分光光度計(jì)下，隨著納米銀粒子在量子點(diǎn)表面的沉積增加，量子點(diǎn)的熒光淬滅程度增加，量子點(diǎn)在Ex＝362nm，Em＝461nm處的熒光強(qiáng)度減弱。因此，利用比色法和熒光法可以達(dá)到定量檢測的目的?；谧贤馕赵鰪?qiáng)和熒光淬滅的程度作為輸出信號，堿性磷酸酶活性可被定量檢測，同時(shí)能夠制成生物傳感器并將其應(yīng)用在堿性磷酸酶抑制劑的研究及其篩選中。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明基于堿性磷酸酶的酶促反應(yīng)、石墨烯量子點(diǎn)的熒光“開-關(guān)”效應(yīng)以及納米銀的紫外吸收特性建立了高靈敏度的雙重模式的堿性磷酸酶的檢測方法。不僅可以通過肉眼對目標(biāo)物堿性磷酸酶進(jìn)行可視化鑒別，也可用比色法和熒光法對堿性磷酸酶進(jìn)行定量檢測。雙重模式的檢測通過兩種方法輸出測定結(jié)果，減小了環(huán)境波動引起的誤差，保證了測定結(jié)果的可靠性，更適合實(shí)際應(yīng)用；

(2)相比之前報(bào)道的測定堿性磷酸酶的雙重傳感器存在的檢測限不夠低或者反應(yīng)時(shí)間過長的問題，該方法得到的堿性磷酸酶雙重傳感器可以在較短的時(shí)間內(nèi)完成高靈敏度的檢測；

(3)采用石墨烯量子點(diǎn)(GQDs)作為探針，具有合成簡單、造價(jià)低廉、綠色無毒、理化性質(zhì)穩(wěn)定和生物相容性良好等優(yōu)勢；GQDs@Ag納米復(fù)合結(jié)構(gòu)在反應(yīng)過程中生成，不需要預(yù)先合成，因此簡化了操作過程。首次利用納米銀粒子沉積于石墨烯量子點(diǎn)表面引起體系紫外吸收和熒光強(qiáng)度同時(shí)發(fā)生改變，來構(gòu)建堿性磷酸酶的雙重傳感器；

(4)同時(shí)能將該生物傳感器成功應(yīng)用于堿性磷酸酶抑制劑的研究和篩選。

附圖說明

圖1是本發(fā)明合成的量子點(diǎn)在不同激發(fā)波長處發(fā)射光譜的變化以及在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長對應(yīng)的發(fā)射光譜和激發(fā)光譜圖；

圖1A為不同激發(fā)波長對應(yīng)的熒光發(fā)射光譜圖，圖1B為最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長的熒光光譜圖；

圖2是本發(fā)明合成的量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度及不同批次的熒光光譜和測定堿性磷酸酶活性的比較；

圖2A在不同溫度下的熒光強(qiáng)度差異圖，圖2B是不同pH條件下的熒光強(qiáng)度的差異，圖2C是兩個不同批次量子點(diǎn)間熒光光譜的比較，圖2D是兩個不同批次量子點(diǎn)應(yīng)用于熒光法測定堿性磷酸酶活性的線性的比較；

圖3是本發(fā)明的原理的示意圖；

圖3A是反應(yīng)原理圖，圖3B是利用比色法和熒光法進(jìn)行堿性磷酸酶活性的檢測過程；

圖4是本發(fā)明的機(jī)制圖；

圖4A是分組實(shí)驗(yàn)示意圖，圖4B是各組的吸光度的示意圖，圖4C是各組的熒光強(qiáng)度示意圖；

圖5是量子點(diǎn)表面沉積納米銀前后的形貌對比圖；

圖5A是透射電鏡下量子點(diǎn)表面未沉積納米銀的形貌圖，圖5B是透射電鏡下量子點(diǎn)表面沉積納米銀的形貌圖，圖5C是量子點(diǎn)表面未沉積納米銀的原子力顯微鏡表征圖，圖5D是量子點(diǎn)表面沉積納米銀后的原子力顯微鏡表征圖；

圖6是量子點(diǎn)沉積納米銀前后元素變化的表征圖；

圖6A～C是量子點(diǎn)表面沉積納米銀后的能量色散x射線元素圖，圖6D是量子點(diǎn)表面未沉積納米銀的能量色散譜圖，圖6E是量子點(diǎn)表面沉積納米銀后的能量色散譜圖；

圖7是本發(fā)明中的最佳反應(yīng)條件；

圖7A是L-抗壞血酸-2-磷酸(AA-P)溶液的最佳反應(yīng)濃度，圖7B是硝酸銀(AgNO₃)溶液的最佳反應(yīng)濃度，圖7C是三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液的最佳反應(yīng)濃度，圖7D是抗壞血酸還原銀離子生成納米銀在石墨烯量子點(diǎn)表面沉積的最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間；

圖8是本發(fā)明中酶促反應(yīng)孵育時(shí)間的優(yōu)化；

圖9是本發(fā)明中最優(yōu)條件下的光譜圖和線性圖；

圖9A是不同濃度堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外吸收峰，圖9B是ΔA_415nm與堿性磷酸酶活性的響應(yīng)曲線，圖9B插圖是堿性磷酸酶活性在0.3～10U/L范圍的線性曲線圖，圖9C是不同濃度堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的石墨烯量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度，圖9D是相對熒光強(qiáng)度(F₀-F)/F₀與堿性磷酸酶活性的響應(yīng)曲線，圖9D插圖是堿性磷酸酶活性在0.05～2.5U/L范圍的線性曲線；

圖10是本發(fā)明用于檢測堿性磷酸酶活性的選擇性圖；

圖11是本發(fā)明應(yīng)用于堿性磷酸酶抑制劑的抑制效果圖。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

制備石墨量子點(diǎn)

稱取2g檸檬酸白色固體加熱至220℃，檸檬酸從白色固體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色黏稠液體、淡黃色液體，最后成橘黃色液體；隨后將橘黃色液體逐滴添加到50ml的0.25M氫氧化鈉溶液并充分?jǐn)嚢?0min；再用0.22μm的微孔濾膜過濾，3.5kDa的透析袋透析24h，再用真空冷凍干燥的方法制得粉末。如圖1A所示，合成的量子點(diǎn)在Ex＝362nm，Em＝461nm處對應(yīng)的熒光強(qiáng)度最大，如圖1B所示，Ex＝362nm對應(yīng)的發(fā)射光譜和Em＝461nm對應(yīng)的激發(fā)光譜呈鏡像對稱的關(guān)系。

實(shí)施例2

將實(shí)施例1制備得到的石墨量子點(diǎn)進(jìn)行穩(wěn)定性考察。

如圖2A所示，本實(shí)施例中將量子點(diǎn)放在20～100℃的溫度下孵育1h后測定熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)在溫度低于50℃時(shí)穩(wěn)定，高于50℃熒光強(qiáng)度顯著下降，因此，納米銀在石墨烯量子點(diǎn)表面沉積的反應(yīng)溫度不得超過50℃。

如圖2B所示，將量子點(diǎn)放在3～13的pH條件下孵育1h后測定熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)量子點(diǎn)在pH高于6時(shí)穩(wěn)定，低于6時(shí)熒光強(qiáng)度顯著下降，因此，納米銀在石墨烯量子點(diǎn)表面沉積的pH不得低于6。

如圖2C所示，對于兩個不同批次量子點(diǎn)間熒光強(qiáng)度的比較，發(fā)現(xiàn)不同批次合成的量子點(diǎn)熒光光譜大小形狀、最大發(fā)生波長以及最大波長處的熒光強(qiáng)度很接近。

如圖2D所示，兩個不同批次量子點(diǎn)應(yīng)用于熒光法測定堿性磷酸酶活性的線性的也很接近，說明該量子點(diǎn)合成方法重現(xiàn)性好。

其他實(shí)施方式和實(shí)施例1相同。

實(shí)施例3

本實(shí)施例將納米銀沉積在石墨烯量子點(diǎn)表面。如圖3所示，基于納米銀在石墨烯量子點(diǎn)表面沉積的比色法和熒光法雙模式的堿性磷酸酶活性分析方法的原理中顯示，在堿性磷酸酶的存在下，L-抗壞血酸-2-磷酸的磷酸基團(tuán)被水解，生成的抗壞血酸還原銀離子生成納米銀沉積在量子點(diǎn)表面，導(dǎo)致反應(yīng)溶液顏色逐漸加深，紫外吸收增強(qiáng)，石墨烯量子點(diǎn)的熒光減弱。基于這個原理，對堿性磷酸酶活性可以進(jìn)行比色法和熒光法雙模式的定量分析。

其他實(shí)施方式和實(shí)施例1相同。

實(shí)施例4

如圖4A所示，為了進(jìn)一步研究堿性磷酸酶傳感器的機(jī)制，本實(shí)施例用紫外可見分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)對不同體系的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證。試劑添加分為如下三組：實(shí)驗(yàn)組AA-P+ALP+GQDs+AgNO₃(a)，陽性對照組AA+GQDs+AgNO₃(b)，陰性對照組包括AA-P+ALP+AgNO₃(c)，AA-P+GQDs+AgNO₃(d)，ALP+GQDs+AgNO₃(e)和AA-P+ALP+GQDs(f)。與陽性對照組(曲線b)相比，陰性對照組(曲線b c d e)并沒有導(dǎo)致紫外和熒光強(qiáng)度的顯著改變，實(shí)驗(yàn)組(曲線a)能夠?qū)е嘛@著的紫外吸光度增強(qiáng)和熒光淬滅，其與陽性對照組結(jié)果類似。一系列結(jié)果表明磷酸化抗壞血酸經(jīng)過酶促反應(yīng)產(chǎn)生抗壞血酸，隨后與硝酸銀反應(yīng)生成銀納米粒子，沉積于石墨烯量子點(diǎn)表面，從而導(dǎo)致體系紫外和熒光發(fā)生光學(xué)改變。另外，如圖4B和圖4C所示，照片顯示的顏色變化與紫外和熒光的光學(xué)變化基本保持一致，進(jìn)一步表明銀納米粒子沉積于石墨烯量子點(diǎn)表面而形成GQD@Ag納米復(fù)合結(jié)構(gòu)。

通過透射電鏡觀察反應(yīng)前后石墨烯量子點(diǎn)的形態(tài)變化，如圖5A所示，反應(yīng)前石墨烯量子點(diǎn)的粒徑在2nm左右，如圖5B所示，反應(yīng)后粒徑增大到13nm左右。通過原子力顯微鏡觀察，如圖5C所示，可以看到當(dāng)僅含有量子點(diǎn)時(shí)，量子點(diǎn)的高度在0.4nm左右，如圖5D所示，當(dāng)納米銀沉積在量子點(diǎn)表面時(shí)，高度增加至13nm左右，因此推測生成的銀納米粒子沉積于石墨烯量子點(diǎn)表面致使粒徑變大。通過能量色散x射線元素圖觀察反應(yīng)后量子點(diǎn)表面的形貌和元素，如圖6A、6B和6C所示，可以看到反應(yīng)后碳元素和銀離子同時(shí)存在，納米銀沉積在量子點(diǎn)表面。通過能量色散譜圖觀察反應(yīng)前后量子點(diǎn)表面的元素變化，如圖6D所示，當(dāng)僅含有量子點(diǎn)時(shí)，可以看到碳元素的峰存在而觀察不到銀元素的峰，如圖6E所示，反應(yīng)后可以看到量子點(diǎn)表面碳元素和銀元素的峰同時(shí)存在，因此，通過能量色散x射線元素圖和能量色散譜圖可以進(jìn)一步證明銀納米粒子在石墨烯量子點(diǎn)表面的沉積。

其他實(shí)施方式和實(shí)施例3相同。

實(shí)施例5

為了得到最佳性能，優(yōu)化了體系的相關(guān)參數(shù)包括磷酸化抗壞血酸濃度、硝酸銀濃度、緩沖溶液的濃度、體系的孵育時(shí)間以及酶促反應(yīng)孵育時(shí)間。如圖7A和7B所示，隨著磷酸化抗壞血酸和硝酸銀濃度增加，相對熒光強(qiáng)度逐漸增加，在磷酸化抗壞血酸濃度達(dá)到0.6mM和硝酸銀濃度達(dá)到1.2mM，反應(yīng)體系達(dá)到動態(tài)平衡，相對熒光強(qiáng)度不再增加，因此分別選擇0.6mM磷酸化抗壞血酸和1.2mM硝酸銀作為反應(yīng)體系的最佳條件。如圖7C所示，Tris濃度在0～7mM范圍內(nèi)被研究，發(fā)現(xiàn)Tris濃度在1mM時(shí)石墨烯量子點(diǎn)的相對熒光強(qiáng)度最大，因此選擇1mM的Tris作為緩沖溶液的最優(yōu)濃度。另外，反應(yīng)體系的孵育時(shí)間、酶促反應(yīng)孵育時(shí)間也被優(yōu)化。如圖7D所示，體系孵育時(shí)間在0～45min范圍內(nèi)，隨著時(shí)間增加其相對熒光強(qiáng)度也增加，隨后達(dá)到動態(tài)平衡。因此，選擇45min作為體系的最佳孵育時(shí)間。如圖8所示，酶促反應(yīng)孵育時(shí)間在1～30min范圍內(nèi)，隨著時(shí)間增加其相對熒光也增加，15min后達(dá)到動態(tài)平衡，因此選擇15min作為酶促反應(yīng)的最佳孵育時(shí)間。

基于GQDs@Ag納米復(fù)合物的紫外吸光和相對熒光強(qiáng)度的改變作為輸出信號，在最優(yōu)的反應(yīng)條件下，采用不同濃度堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液利用比色法和熒光法來檢測堿性磷酸酶傳感器的線性范圍和檢測限。如圖9A所示，GQDs@Ag納米復(fù)合物的紫外吸收峰隨著堿性磷酸酶活性增加而不斷增大，圖中由下至上，濃度依次由0增加到50U/L，如圖9B所示，ΔA _415nm與堿性磷酸酶活性的響應(yīng)曲線，如圖9B插圖，堿性磷酸酶活性在0.3～10U/L范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(Y＝0.0862X-0.0068，R²＝0.9961)，檢測限為0.1U/L。另外，如圖9C所示，石墨烯量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度隨著堿性磷酸酶活性的增加而逐漸下降，圖中由上至下，濃度依次由0增加到5.0U/L。如圖9D所示，相對熒光強(qiáng)度(F₀-F)/F₀與堿性磷酸酶活性的響應(yīng)曲線，如圖9D插圖所示，堿性磷酸酶活性在0.05～2.5U/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(Y＝0.1526X+0.0547，R²＝0.9899)，檢測限為0.02U/L。

其他實(shí)施方式和實(shí)施例4相同。

實(shí)施例6

選擇性是評價(jià)本生物傳感器發(fā)明性能的一個重要的參數(shù)。因此，選擇了其他一些可能有干擾的生物酶和蛋白質(zhì)來評價(jià)該堿性磷酸酶生物傳感器的選擇性。用八組示例分別用熒光和吸光強(qiáng)度做對比實(shí)驗(yàn)，如圖10中1-8所示，第一組為空白組無任何酶，第二組加入谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT，100U/L)，第三組加入谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST，100U/L)，第四組加入胰蛋白酶(Try，100U/L)，第五組加入葡萄糖氧化酶(GOx，100U/L)，第六組加入人血清白蛋白(HSA，1.0mg/mL)，第七組加入胎牛血清白蛋白(BSA，1.0mg/mL)，第八組為堿性磷酸酶(ALP，10U/L)。將第二組至第七組分別加入到含有堿性磷酸酶(ALP，10U/L)的反應(yīng)體系中，測定反應(yīng)體系吸光度和相對熒光強(qiáng)度的變化。如圖10A所示，與不含有其他生物酶或蛋白質(zhì)的堿性磷酸酶反應(yīng)體系相比，包含了其他生物酶和蛋白的堿性磷酸酶反應(yīng)體系可以引起相似的吸光度和相對熒光強(qiáng)度的變化。它們之間的差異可以被忽略，因此可以說明該發(fā)明對堿性磷酸酶的選擇性良好。另外，如圖10B所示，加入了其他生物酶和蛋白的堿性磷酸酶反應(yīng)體系和單獨(dú)的堿性磷酸酶反應(yīng)體系一樣，在可見光下觀察發(fā)現(xiàn)溶液由無色變?yōu)辄S色，在365nm紫外光下觀察發(fā)現(xiàn)溶液熒光明顯減弱，進(jìn)一步證明了本發(fā)明對堿性磷酸酶的高選擇性檢測。

其他實(shí)施方式和實(shí)施例5相同。

實(shí)施例7

利用上述堿性磷酸酶傳感器，可篩選出潛在的堿性磷酸酶抑制劑。磷酸二氫鉀，一個典型的抑制劑，被用于測試該傳感器篩選堿性磷酸酶抑制劑的能力。將磷酸化抗壞血酸、堿性磷酸酶和不同濃度的磷酸二氫鉀溶液在三羥甲基氨基甲烷溶液中37℃孵育15min后，再加入1580μL的水、50μL量子點(diǎn)和100μL硝酸銀室溫繼續(xù)孵育45min。將磷酸化抗壞血酸、堿性磷酸酶和硝酸銀的終濃度分別為0.6mM、50U/L、1.2mM。如圖11所示，磷酸二氫鉀的終濃度范圍為0～1000μM，隨著磷酸二氫鉀濃度的增加堿性磷酸酶被抑制的程度呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢，達(dá)到600μM后逐漸趨于平衡，磷酸二氫鉀的半數(shù)抑制效應(yīng)IC₅₀＝194.51μM。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：該傳感器可應(yīng)用于堿性磷酸酶抑制劑的研究和篩選。

其他實(shí)施方式和實(shí)施例5相同。

實(shí)施例8

本實(shí)施例用于測定未知濃度堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品的濃度：配置不同濃度的堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將50μL濃度為24mM磷酸化抗壞血酸溶液和20μL不同濃度的堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液或未知濃度堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于200μL含0.5mM無水硫酸鎂的pH9.8的三羥甲基氨基甲烷-硝酸緩沖溶液或二乙醇胺-硝酸緩沖溶液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液或碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液體系中37℃孵育15min，再加入1580μL的雙蒸水、50μL的量子點(diǎn)和的100μL濃度為24mM硝酸銀室溫繼續(xù)孵育45min。用紫外可見分光光度計(jì)測定溶液在415nm處吸光度，利用吸光度隨堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測定出細(xì)胞裂解液中堿性磷酸酶的濃度。或者用熒光分光光度計(jì)測定溶液在Ex＝362nm，Em＝461nm處對應(yīng)的熒光強(qiáng)度，利用相對熒光強(qiáng)度隨堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度的變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測定出未知濃度堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品的濃度。

其他實(shí)施方式和實(shí)施例5相同。

實(shí)施例9

本實(shí)施例用于測定細(xì)胞里堿性磷酸酶的濃度：配置不同濃度的堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將50μL濃度為24mM磷酸化抗壞血酸溶液和20μL不同濃度的堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液或細(xì)胞裂解液置于200μL含0.5mM無水硫酸鎂的pH9.8的三羥甲基氨基甲烷-硝酸緩沖溶液或二乙醇胺-硝酸緩沖溶液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液或碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液體系中37℃孵育15min，再加入1580μL的水、50μL的量子點(diǎn)和的100μL濃度為24mM硝酸銀室溫繼續(xù)孵育45min。用紫外可見分光光度計(jì)測定溶液在415nm處吸光度，利用吸光度隨堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度的變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測定出細(xì)胞裂解液中堿性磷酸酶的濃度?；蛘哂脽晒夥止夤舛扔?jì)測定溶液在Ex＝362nm，Em＝461nm處對應(yīng)的熒光強(qiáng)度，利用熒光強(qiáng)度隨堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度的變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測定出細(xì)胞裂解液中堿性磷酸酶的濃度。再利用BCA試劑盒測定細(xì)胞裂解液中BSA蛋白的濃度，堿性磷酸酶的濃度和BSA蛋白的濃度的比值即為單位細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶的濃度。

其他實(shí)施方式和實(shí)施例5相同。

實(shí)施例10

本實(shí)施例用于測定血漿里堿性磷酸酶的濃度：配置不同濃度的堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將50μL濃度為24mM磷酸化抗壞血酸溶液和20μL不同濃度的堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)品溶液或血漿置于200μL含0.5mM無水硫酸鎂的pH9.8的三羥甲基氨基甲烷-硝酸緩沖溶液或二乙醇胺-硝酸緩沖溶液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液或碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液體系中37℃孵育15min，再加入1580μL的水、50μL的量子點(diǎn)和的100μL濃度為24mM硝酸銀室溫繼續(xù)孵育45min。用紫外可見分光光度計(jì)測定溶液在415nm處吸光度，利用吸光度隨堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度的變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測定出血漿中堿性磷酸酶的濃度?；蛘哂脽晒夥止夤舛扔?jì)測定溶液在Ex＝362nm，Em＝461nm處對應(yīng)的熒光強(qiáng)度，利用熒光強(qiáng)度隨堿性磷酸酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度的變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而測定出血漿中堿性磷酸酶的濃度。

其他實(shí)施方式和實(shí)施例5相同。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。