本發(fā)明屬于食品安全技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種測(cè)定乳/乳制品中游離中短鏈脂肪酸的方法。

背景技術(shù)：

原料乳和液體乳制品中含有多種游離脂肪酸，其中主要的中短鏈脂肪酸包括丁酸(C₄H₈O₂)、己酸(C₆H₁₂O₂)、辛酸(C₈H₁₆O₂)和癸酸(C₁₀H₂₀O₂)。中短鏈脂肪酸大多都具有明顯而強(qiáng)烈的風(fēng)味特征：丁酸的主體風(fēng)味描述為刺激性酸感、略具奶油臭，風(fēng)味閾值為0.24-4.8mg/L；己酸的主體風(fēng)味描述為汗臭味、腐臭味、山羊味等，風(fēng)味閾值為0.093-10mg/L；辛酸的主體風(fēng)味描述為辛辣味、山羊味，風(fēng)味閾值為0.91-19mg/L；癸酸的主體風(fēng)味描述為哈喇味、山羊味，風(fēng)味閾值為2.2-102mg/L。

原料乳和液體乳制品中的游離中短鏈脂肪酸對(duì)原料乳和液體乳制品的感官風(fēng)味影響非常明顯，因此對(duì)其品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。游離脂肪酸作為乳及乳制品的風(fēng)味物質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)前體，一部分來(lái)自于原料固有成分，如原料乳中的乳脂肪即三甘油酯混合物就是由長(zhǎng)鏈脂肪酸和中短鏈脂肪酸構(gòu)成。還有一部分游離脂肪酸可能是在加工制造過(guò)程中產(chǎn)生，比如酸奶的發(fā)酵過(guò)程中，乳脂肪被酶解產(chǎn)生游離脂肪酸，具有強(qiáng)烈的發(fā)酵特征風(fēng)味；在被嗜冷菌污染的液態(tài)乳(特別是貨架保質(zhì)期較長(zhǎng)的超高溫滅菌乳)中，脂肪水解產(chǎn)生的游離脂肪酸含量增加，最終造成產(chǎn)品出現(xiàn)脂肪氧化、酸敗等不良風(fēng)味。因此，無(wú)論是質(zhì)量安全還是風(fēng)味形成角度，中短鏈游離脂肪酸的含量都應(yīng)在乳品生產(chǎn)制造過(guò)程中予以監(jiān)測(cè)。

現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB5413.27-2010《嬰幼兒食品和乳品中脂肪酸的測(cè)定》中對(duì)乳品中的脂肪酸測(cè)定方法進(jìn)行了描述：①使用鹽酸-甲醇(由乙酰氯與甲醇反應(yīng)得到)使樣品中的游離脂肪酸甲酯化，用甲苯提取后，經(jīng)氣相 色譜儀分離檢測(cè)定量。②游離脂肪酸在三氟化硼催化下進(jìn)行甲酯化反應(yīng)，經(jīng)氣相色譜柱分離，以氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)定量。這兩種方法都是使用衍生化試劑將脂肪酸甲酯化，然后通過(guò)氣相色譜分離，使用外標(biāo)法定量。常用測(cè)定脂肪酸的衍生化方法雖然可以一次性檢出多種脂肪酸(包括短鏈、中鏈和長(zhǎng)鏈N端脂肪酸)，但步驟繁瑣、重復(fù)性和回收率相對(duì)不高，在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)檢測(cè)中具有一定局限性。

頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法聯(lián)用(HS-SPME-GC/MS)技術(shù)以其快速、方便、高效的優(yōu)點(diǎn)，成為原料乳和乳制品中游離脂肪酸的常見(jiàn)定量檢測(cè)方法。頂空固相微萃取(Headspace solid phase micro-extraction,HS-SPME)技術(shù)集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣為一體，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)原料乳和乳制品等復(fù)雜混合物中風(fēng)味化合物的定量分析。游離的中短鏈脂肪酸在固相微萃取裝置的涂層(萃取頭)中經(jīng)過(guò)萃取、濃縮、解吸后，在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中分離并鑒定。但是由于游離的中短鏈脂肪酸沸點(diǎn)低，原料乳和乳制品中風(fēng)味干擾物質(zhì)較多，因此需要對(duì)分離條件進(jìn)行優(yōu)化，以增加中短鏈脂肪酸在萃取頭上的單位時(shí)間吸附量。

盡管HS-SPME方法廣泛應(yīng)用于游離脂肪酸的檢測(cè)中，但關(guān)于使用HS-SPME對(duì)乳品中短鏈脂肪酸專項(xiàng)檢測(cè)條件的分析卻相對(duì)較少，而且均集中于單因素條件(如萃取時(shí)間等)。單因素分析是只改變一個(gè)可控因素，其他因素保持不變的研究；該方法簡(jiǎn)單、直觀，缺點(diǎn)是只考察了單個(gè)因素的變化對(duì)結(jié)果的單獨(dú)影響。綜合考慮多因素的影響常使用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可同時(shí)考慮幾種因素，從中尋找最佳因素水平組合；但正交試驗(yàn)方法不能在給出的區(qū)域里找到因素和響應(yīng)值之間一個(gè)明確的回歸方程，從而無(wú)法找到指定區(qū)域里因素的最佳組合以及響應(yīng)值的最優(yōu)值。該現(xiàn)象亟待解決。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)檢測(cè)中急需一種操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、精密 度高和萃取效率高的游離的中短鏈脂肪酸的測(cè)定方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有的甲酯化等衍生化方法和HS-SPME-GC/MS方法中操作繁瑣、準(zhǔn)確度低、精密度低和萃取效率低等缺陷而提供了一種測(cè)定乳/乳制品中游離中短鏈脂肪酸的方法，該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、精密度高和萃取效率高，適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和樣品監(jiān)控。

本發(fā)明提供了一種測(cè)定乳/乳制品中游離中短鏈脂肪酸的方法，該方法包括如下步驟：

(1)待測(cè)物加入內(nèi)標(biāo)物，采用頂空固相微萃取法同時(shí)萃取待測(cè)物中短鏈脂肪酸和內(nèi)標(biāo)物，再利用氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用儀檢測(cè)待測(cè)物中短鏈脂肪酸和內(nèi)標(biāo)物，得到待測(cè)物的中短鏈脂肪酸的峰面積和待測(cè)物的內(nèi)標(biāo)物的峰面積；

(2)脂肪酸標(biāo)樣加入內(nèi)標(biāo)物，采用頂空固相微萃取法同時(shí)萃取脂肪酸標(biāo)樣中的中短鏈脂肪酸和內(nèi)標(biāo)物，再利用氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用儀檢測(cè)脂肪酸標(biāo)樣中的中短鏈脂肪酸和內(nèi)標(biāo)物，得到脂肪酸標(biāo)樣中的中短鏈脂肪酸的峰面積和脂肪酸標(biāo)樣中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；

(3)采用下式定量計(jì)算待測(cè)物中游離中短鏈脂肪酸的含量，

m_i：待測(cè)物中游離中短鏈脂肪酸的含量，單位為毫克每升或毫克每百克；A_s：脂肪酸標(biāo)樣中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A_i：待測(cè)物中短鏈脂肪酸的峰面積；A_si：待測(cè)物中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A_r：脂肪酸標(biāo)樣中短鏈脂肪酸的峰面積；m_r：脂肪酸標(biāo)樣中短鏈脂肪酸含量，單位為毫克每升；

上述待測(cè)物為原料乳或液體乳制品；

上述內(nèi)標(biāo)物為庚酸的乙醇水溶液；

上述中短鏈脂肪酸為丁酸、己酸、辛酸和癸酸中的一種或多種，這里的脂肪酸標(biāo)樣為丁酸、己酸、辛酸和癸酸中的一種或多種的乙醇水溶液。

進(jìn)一步的，所述的待測(cè)物與所述的內(nèi)標(biāo)物的體積比為10:1～10³:1，進(jìn)一步優(yōu)選50:1～150:1，更進(jìn)一步優(yōu)選100:1。

進(jìn)一步的，在脂肪酸標(biāo)樣中，丁酸或己酸與乙醇水溶液的質(zhì)量體積比為10mg/L～200mg/L，進(jìn)一步優(yōu)選45mg/L～60mg/L；辛酸或癸酸與乙醇水溶液的質(zhì)量體積比為1mg/L～50mg/L，進(jìn)一步優(yōu)選1mg/L～20mg/L，所述乙醇水溶液，乙醇與水的體積比為5％。

進(jìn)一步的，所述的頂空固相微萃取條件通過(guò)對(duì)以下2次7項(xiàng)回歸方程取值獲得：

Y＝39.05+1.90X₁+4.28X₂+5.18X₃-0.92X₁X₂-1.14X₁X₃-2.17X₂X₃-2.54X₁²-7.40X₂²-4.09X₃²

其中，Y為中短鏈脂肪酸總含量，單位mg/kg；X₁為待測(cè)物與氯化鈉體積質(zhì)量比，取值范圍為1.0-10.0mL/g；X₂為振蕩平衡溫度，取值范圍為30-70℃；X₃為振蕩平衡萃取時(shí)間，取值范圍為15-60分鐘。

進(jìn)一步的，X₁取值范圍為6.40-6.80mL/g，X₂取值范圍為51.5-54.5℃，X₃取值范圍為45-50min。

優(yōu)先的，X₁為6.58mL/g，X₂為53.1℃，X₃為48min。

進(jìn)一步的，頂空固相微萃取的萃取頭為65μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯萃取頭，萃取頭在250℃下老化0.5h。

進(jìn)一步的，內(nèi)標(biāo)物中庚酸與乙醇水溶液的質(zhì)量體積比為0.1mg/mL～20mg/mL，進(jìn)一步優(yōu)選0.5mg/mL～5mg/mL；所述乙醇水溶液，乙醇與水的體積比為5％。

進(jìn)一步的，所述氣相色譜條件：毛細(xì)管柱的規(guī)格，長(zhǎng)度為30m、內(nèi)徑為0.25mm，液膜厚度0.25μm；載氣為He，流速為1mL/min；色譜柱起始柱溫為30℃，保持3min，以8℃/min升到70℃，再以6℃/min升到130℃， 最后以10℃/min升到230℃，保持5min；進(jìn)樣口溫度230℃，無(wú)分流進(jìn)樣，檢測(cè)器電壓800V。

進(jìn)一步的，所述質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，電子能量70eV；燈絲發(fā)射電流200A，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃；掃描模式Scan；自動(dòng)掃描時(shí)間0.3s，掃描間隔時(shí)間0.2s；質(zhì)量掃描范圍m/z 20～200。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明所述測(cè)定乳/乳制品中游離中短鏈脂肪酸的方法克服了現(xiàn)有的甲酯化等衍生化方法和頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法聯(lián)用方法中操作繁瑣、準(zhǔn)確度低、精密度低和萃取效率低等缺陷。本發(fā)明所述測(cè)定乳/乳制品中游離中短鏈脂肪酸的方法是一種準(zhǔn)確性較高的、同時(shí)檢測(cè)中短鏈脂肪酸的測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、精密度高和萃取效率高，適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和樣品監(jiān)控。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中短鏈脂肪酸總含量(Y)-氯化鈉用量(X₁)和平衡溫度(X₂)的響應(yīng)曲面圖。

圖2為實(shí)施例1中短鏈脂肪酸總含量(Y)-平衡溫度(X₂)和萃取時(shí)間(X₃)的響應(yīng)曲面圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。

實(shí)施例1

響應(yīng)面法優(yōu)化的衍生化條件通過(guò)下述步驟制得：

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

目標(biāo)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取1g的四種目標(biāo)脂肪酸(純度為色譜 級(jí))，分別配制成1L的母液貯存于4℃冰箱備用?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液即以該母液稀釋適當(dāng)梯度混合而成，使用前新鮮配制。

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取1g庚酸(純度為色譜級(jí))，配制成1L庚酸的乙醇水溶液，其質(zhì)量體積比為1mg/ml，乙醇水溶液的濃度為5％，貯存于4℃冰箱備用。

(2)樣品處理

取5mL UHT滅菌乳樣品A置于15mL頂空瓶中，加入適量(見(jiàn)下表1)氯化鈉和50μL內(nèi)標(biāo)溶液，立即旋緊瓶蓋。

混合脂肪酸標(biāo)樣：分別取丁酸、己酸、辛酸、癸酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中己酸、辛酸、癸酸終濃度分別為51.7mg/L、50.4mg/L、10.2mg/L、10.4mg/L。取該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml置于15mL頂空瓶中，加入50μL內(nèi)標(biāo)溶液，立即旋緊瓶蓋。

(3)響應(yīng)面方法優(yōu)化HS-SPME處理?xiàng)l件

待優(yōu)化的HS-SPME處理?xiàng)l件為：氯化鈉用量、振蕩平衡溫度、振蕩平衡萃取時(shí)間。使用響應(yīng)面方法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)條件優(yōu)化方案，見(jiàn)表1。

表1優(yōu)化衍生化條件的Box-Behnken設(shè)計(jì)方案

注-上標(biāo)A：1(10)表示HS-SPME固相微萃取條件的設(shè)定，其中1為因素的水平(各因素分別為-1、0、1三個(gè)水平)，10為因素的實(shí)際數(shù)據(jù)，即樣品與氯化鈉的比例為10mL/g。

上標(biāo)B：中心試驗(yàn)點(diǎn)。

(3)氣相色譜質(zhì)譜法

待已裝入樣品的頂空瓶在一定溫度下(見(jiàn)表1)振蕩平衡30分鐘后，將已經(jīng)老化好的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65μm，Supelco,Pennsylvania,USA)萃取頭裝入固相微萃取裝置，然后插入頂空瓶頂空處萃取，萃取時(shí)間見(jiàn)表1。

氣相色譜條件：毛細(xì)管柱采用VF-5ms(30m×0.25mm，液膜厚度0.25μm)；載氣為He，流速為1ml/min。色譜柱起始柱溫為30℃(保持3min)，以6℃/min升到60℃，再以6℃/min升到120℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min。進(jìn)樣口溫度230℃，無(wú)分流進(jìn)樣，檢測(cè)器電壓800V。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI電離)，電子能量70eV；燈絲發(fā)射電流200μA，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃；掃描模式Scan；自動(dòng)掃描時(shí)間0.3s，掃描間隔時(shí)間0.2s；質(zhì)量掃描范圍m/z20～200。

(4)定性及定量方法

定性：將目標(biāo)化合物的質(zhì)譜與Nist(National Institute of Standards and Technology，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)局，以下簡(jiǎn)稱Nist)譜庫(kù)中的質(zhì)譜對(duì)比，同時(shí)目標(biāo)脂肪酸在與待測(cè)物相同的GC-MS條件下分析標(biāo)準(zhǔn)樣品得到的保留時(shí)間和質(zhì)譜對(duì)比定性。

定量：以庚酸為內(nèi)標(biāo)物，定量方法為內(nèi)標(biāo)法。

根據(jù)經(jīng)優(yōu)化后的固相微萃取條件處理并檢測(cè)，樣品中目標(biāo)脂肪酸的含量按下式計(jì)算：

m_i：待測(cè)物中游離中短鏈脂肪酸的含量，單位為毫克每升或毫克每百克；A_s：脂肪酸標(biāo)樣中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A_i：待測(cè)物中短鏈脂肪酸的峰面積；A_si：待測(cè)物中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A_r：脂肪酸標(biāo)樣中短鏈脂肪酸的峰面積；m_r：脂肪酸標(biāo)樣中短鏈脂肪酸含量，單位為毫克每升；

本實(shí)施例中，通過(guò)計(jì)算得到UHT乳樣品A中丁酸含量為33.83mg/L，己酸含量為8.16mg/L，辛酸含量為1.54mg/L，癸酸含量為1.08mg/L，中短鏈脂肪酸總含量為44.61mg/L。

(5)結(jié)果分析

按照(2)、(3)、(4)中氣相色譜質(zhì)譜法對(duì)同一UHT滅菌乳樣品進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定其丁酸、己酸、辛酸、癸酸含量，得到的試驗(yàn)結(jié)果使用專業(yè)分析軟件Design-Expert分析，結(jié)果如圖1、圖2所示，圖1為實(shí)施例1中短鏈脂肪酸總含量(Y)-氯化鈉用量(X₁)和平衡溫度(X₂)的響應(yīng)曲面圖，圖2為實(shí)施例1中短鏈脂肪酸總含量(Y)-平衡溫度(X₂)和萃取時(shí)間(X₃)的響應(yīng)曲面圖。

響應(yīng)面法設(shè)定的變量參數(shù)通過(guò)對(duì)以下2次7項(xiàng)回歸方程分析獲得：

Y＝39.05+1.90X₁+4.28X₂+5.18X₃-0.92X₁X₂-1.14X₁X₃-2.17X₂X₃-2.54X₁² -7.40X₂²-4.09X₃²

其中，Y為中短鏈脂肪酸(丁酸、己酸、辛酸和癸酸)總含量，單位mg/kg；X₁為待測(cè)物與氯化鈉體積質(zhì)量比，待測(cè)物為原料乳或液體乳制品，取值范圍為1.0-10.0mL/g；X₂為萃取平衡溫度，取值范圍為30-70℃；X₃為萃取時(shí)間，取值范圍為15-60分鐘。

根據(jù)分析結(jié)果，響應(yīng)面方法優(yōu)化的衍生化條件為：樣品與氯化鈉體積質(zhì)量比為6.40～6.80mL/g，平衡溫度為51.5-54.5℃，萃取時(shí)間為45-50min。最優(yōu)化固相微萃取條件為：樣品與氯化鈉體積質(zhì)量比6.58mL/g，平衡溫度53.1℃，萃取時(shí)間48min。

實(shí)施例2

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

目標(biāo)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取1g的四種目標(biāo)脂肪酸(純度為色譜級(jí))，分別配制成1L的母液貯存于4℃冰箱備用?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液即以該母液稀釋適當(dāng)梯度混合而成，使用前新鮮配制。

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取20g庚酸(純度為色譜級(jí))，配制成1L庚酸的乙醇水溶液，其質(zhì)量體積比為20mg/ml，貯存于4℃冰箱備用。

(2)樣品處理

取5mL巴氏滅菌乳樣品B置于15mL頂空瓶中，加入0.76g氯化鈉和5μL內(nèi)標(biāo)溶液，立即旋緊瓶蓋。

混合脂肪酸標(biāo)樣：分別取丁酸、己酸、辛酸、癸酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中丁酸、己酸、辛酸、癸酸的終濃度分別為51.7mg/L、50.4mg/L、10.2mg/L、10.4mg/L。取該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml置于15mL頂空瓶中，加入5μL內(nèi)標(biāo)溶液，立即旋緊瓶蓋。

(3)固相微萃取

待已裝入樣品的頂空瓶在53.1℃振蕩平衡30分鐘后，將已經(jīng)老化好的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65μm，Supelco,Pennsylvania,USA)萃取頭裝入固相微萃取裝置，然后插入頂空瓶頂空處萃取，萃取時(shí)間48分鐘。

(4)氣相色譜質(zhì)譜法

氣相色譜條件：毛細(xì)管柱采用VF-5ms(30m×0.25mm，液膜厚度0.25μm)；載氣為He，流速為1ml/min。色譜柱起始柱溫為30℃(保持3min)，以10℃/min升到70℃，再以6℃/min升到130℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min。進(jìn)樣口溫度230℃，無(wú)分流進(jìn)樣，檢測(cè)器電壓800V。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI電離)，電子能量70eV；燈絲發(fā)射電流200μA，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃；掃描模式Scan；自動(dòng)掃描時(shí)間0.3s，掃描間隔時(shí)間0.2s；質(zhì)量掃描范圍m/z20～200。

(5)定性及定量方法

定性：將目標(biāo)化合物的質(zhì)譜與Nist譜庫(kù)中的質(zhì)譜對(duì)比，同時(shí)目標(biāo)脂肪酸在與待測(cè)物相同的GC-MS條件下分析標(biāo)準(zhǔn)樣品得到的保留時(shí)間和質(zhì)譜對(duì)比定性。

定量：以庚酸為內(nèi)標(biāo)物，定量方法為內(nèi)標(biāo)法。

樣品中目標(biāo)脂肪酸的含量按下式計(jì)算：

m_i：待測(cè)物中游離中短鏈脂肪酸的含量，單位為毫克每升或毫克每百克；A_s：脂肪酸標(biāo)樣中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A_i：待測(cè)物中短鏈脂肪酸的峰面積；A_si：待測(cè)物中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A_r：脂肪酸標(biāo)樣中短鏈脂肪酸的峰面積；m_r：脂肪酸標(biāo)樣中短鏈脂肪酸含量，單位為毫克每升；

本實(shí)施例中，通過(guò)計(jì)算得到巴氏滅菌乳樣品B中丁酸含量為15.47mg/L、己酸含量為7.74mg/L，辛酸含量為2.11mg/L，癸酸含量為1.29mg/L，中短鏈脂肪酸總含量為26.61mg/L。

實(shí)施例3

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

目標(biāo)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取1g的四種目標(biāo)脂肪酸(純度為色譜級(jí))，分別配制成1L的母液貯存于4℃冰箱備用?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液即以該母液稀釋適當(dāng)梯度混合而成，使用前新鮮配制。

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取0.1g庚酸(純度為色譜級(jí))，配制成1L庚酸的乙醇水溶液，其質(zhì)量體積比為0.1mg/ml，乙醇水溶液的濃度為5％，貯存于4℃冰箱備用。

(2)樣品處理

取5mL原料乳樣品C置于15mL頂空瓶中，加入0.78g氯化鈉和500μL內(nèi)標(biāo)溶液，立即旋緊瓶蓋。

混合脂肪酸標(biāo)樣：分別取丁酸、己酸、辛酸、癸酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中丁酸、己酸、辛酸、癸酸終濃度分別為10.3mg/L、10.1mg/L、1.02mg/L、1.04mg/L。取該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml置于15mL頂空瓶中，加入500μL內(nèi)標(biāo)溶液，立即旋緊瓶蓋。

(3)固相微萃取

待已裝入樣品的頂空瓶在53.1℃振蕩平衡30分鐘后，將已經(jīng)老化好的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65μm，Supelco,Pennsylvania,USA)萃取頭裝入固相微萃取裝置，然后插入頂空瓶頂空處萃取，萃取時(shí)間48分鐘。

(4)氣相色譜質(zhì)譜法

氣相色譜條件：毛細(xì)管柱采用VF-5ms(30m×0.25mm，液膜厚度0.25μm)；載氣為He，流速為1ml/min。色譜柱起始柱溫為30℃(保持3min)，以10℃/min升到70℃，再以6℃/min升到130℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min。進(jìn)樣口溫度230℃，無(wú)分流進(jìn)樣，檢測(cè)器電壓800V。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI電離)，電子能量70eV；燈絲發(fā)射電流200μA，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃；掃描模式Scan；自動(dòng)掃描時(shí)間0.3s，掃描間隔時(shí)間0.2s；質(zhì)量掃描范圍m/z20～200。

(5)定性及定量方法

定性：將目標(biāo)化合物的質(zhì)譜與Nist譜庫(kù)中的質(zhì)譜對(duì)比，同時(shí)目標(biāo)脂肪酸在與待測(cè)物相同的GC-MS條件下分析標(biāo)準(zhǔn)樣品得到的保留時(shí)間和質(zhì)譜對(duì)比定性。

定量：以庚酸為內(nèi)標(biāo)物，定量方法為內(nèi)標(biāo)法。

樣品中目標(biāo)脂肪酸的含量按下式計(jì)算：

m_i：待測(cè)物中游離中短鏈脂肪酸的含量，單位為毫克每升或毫克每百克；A_s：脂肪酸標(biāo)樣中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A_i：待測(cè)物中短鏈脂肪酸的峰面積；A_si：待測(cè)物中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A_r：脂肪酸標(biāo)樣中短鏈脂肪酸的峰面積；m_r：脂肪酸標(biāo)樣中短鏈脂肪酸含量，單位為毫克每升；

本實(shí)施例中，通過(guò)計(jì)算得到原料乳樣品C中丁酸含量為26.20mg/L、己酸含量為10.51mg/L，辛酸含量為2.48mg/L，癸酸含量為1.67mg/L，中短鏈脂肪酸總含量為33.86mg/L。

實(shí)施例4

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

目標(biāo)脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取1g的四種目標(biāo)脂肪酸(純度為色譜級(jí))，分別配制成1L的母液貯存于4℃冰箱備用?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液即以該母液稀釋適當(dāng)梯度混合而成，使用前新鮮配制。

內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取0.5g庚酸(純度為色譜級(jí))，配制成1L庚酸的乙醇水溶液，其質(zhì)量體積比為0.5mg/ml，乙醇水溶液的濃度為5％，貯存于4℃冰箱備用。

(2)樣品處理

取5mL發(fā)酵乳樣品D置于15mL頂空瓶中，加入1g氯化鈉和100μL內(nèi)標(biāo)溶液，立即旋緊瓶蓋。

混合脂肪酸標(biāo)樣：分別取丁酸、己酸、辛酸、癸酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中丁酸、己酸、辛酸、癸酸終濃度分別為206.8mg/L、201.4mg/L、20.4mg/L、20.8mg/L。取該混合標(biāo)準(zhǔn)溶液5ml置于15mL頂空瓶中，加入100μL內(nèi)標(biāo)溶液，立即旋緊瓶蓋。

(3)固相微萃取

待已裝入樣品的頂空瓶在53.1℃振蕩平衡30分鐘后，將已經(jīng)老化好的聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65μm，Supelco,Pennsylvania,USA)萃取頭裝入固相微萃取裝置，然后插入頂空瓶頂空處萃取，萃取時(shí)間48分鐘。

(4)氣相色譜質(zhì)譜法

氣相色譜條件：毛細(xì)管柱采用VF-5ms(30m×0.25mm，液膜厚度0.25μm)；載氣為He，流速為1ml/min。色譜柱起始柱溫為30℃(保持3min)，以10℃/min升到70℃，再以6℃/min升到130℃，最后以10℃/min升到230℃，保持5min。進(jìn)樣口溫度230℃，無(wú)分流進(jìn)樣，檢測(cè)器電壓800V。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI電離)，電子能量70eV；燈絲發(fā)射電 流200μA，離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃；掃描模式Scan；自動(dòng)掃描時(shí)間0.3s，掃描間隔時(shí)間0.2s；質(zhì)量掃描范圍m/z20～200。

(5)定性及定量方法

定性：將目標(biāo)化合物的質(zhì)譜與Nist譜庫(kù)中的質(zhì)譜對(duì)比，同時(shí)目標(biāo)脂肪酸在與待測(cè)物相同的GC-MS條件下分析標(biāo)準(zhǔn)樣品得到的保留時(shí)間和質(zhì)譜對(duì)比定性。

定量：以庚酸為內(nèi)標(biāo)物，定量方法為內(nèi)標(biāo)法。

樣品中目標(biāo)脂肪酸的含量按下式計(jì)算：

m_i：待測(cè)物中游離中短鏈脂肪酸的含量，單位為毫克每升或毫克每百克；A_s：脂肪酸標(biāo)樣中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A_i：待測(cè)物中短鏈脂肪酸的峰面積；A_si：待測(cè)物中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；A_r：脂肪酸標(biāo)樣中短鏈脂肪酸的峰面積；m_r：脂肪酸標(biāo)樣中短鏈脂肪酸含量，單位為毫克每升；

本實(shí)施例中，通過(guò)計(jì)算得到巴氏滅菌乳樣品B中丁酸含量為35.16mg/L、己酸含量為9.53mg/L，辛酸含量為2.28mg/L，癸酸含量為1.82mg/L，中短鏈脂肪酸總含量為48.79mg/L。

實(shí)施例5

(1)重新量取5mL巴氏滅菌乳樣品B，加入42.5μL濃度為1034mg/L的丁酸、5μL濃度為504mg/L的己酸、5μL濃度為510mg/L的辛酸、5μL濃度為520mg/L的癸酸，搖勻后作為滅菌乳樣品B的待測(cè)物，即加標(biāo)樣品。

(2)將步驟(1)所得的加標(biāo)樣品按照實(shí)施例2的步驟進(jìn)行固相微萃取、高效液相色譜測(cè)定、計(jì)算得到丁酸含量為24.06mg/L、己酸含量為 8.18mg/L，辛酸含量為2.57mg/L，癸酸含量為1.83mg/L，中短鏈脂肪酸總含量為36.64mg/L。

效果實(shí)施例1

本效果實(shí)施例證明在實(shí)施例1獲得的最優(yōu)化固相微萃取條件下，測(cè)得的中短鏈脂肪酸總含量最高。

采用Box-Behnken設(shè)計(jì)的固相微萃取條件(如表2)，其余實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)施例1檢測(cè)方法相同，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)得表2中實(shí)驗(yàn)編號(hào)為1～17的脂肪酸總濃度。由上述實(shí)驗(yàn)編號(hào)為1～17實(shí)驗(yàn)可知，實(shí)施例1中在最優(yōu)化固相微萃取條件下測(cè)得的中短鏈脂肪酸總含量最高。

表2優(yōu)化衍生化條件的試驗(yàn)結(jié)果

注：A為中心試驗(yàn)點(diǎn)。

效果實(shí)施例2

本效果實(shí)施例用于證明最優(yōu)化固相微萃取條件檢測(cè)發(fā)酵乳中脂肪酸數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，結(jié)果如表3所述。由表3可知，測(cè)定巴氏滅菌乳樣品B的回收率為97.2％。

表3優(yōu)化固相微萃取方法的回收率

效果實(shí)施例3

以實(shí)施例2為例，檢測(cè)使用最優(yōu)化條件檢測(cè)滅菌乳中總脂肪酸的精密 度。將同一樣品進(jìn)行固相微萃取處理后并進(jìn)樣，重復(fù)6次，結(jié)果如表4所述。

其中，平行樣品是指的將在實(shí)施例2同等條件下，檢測(cè)6次所得的檢測(cè)值；RSD為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation)，指標(biāo)準(zhǔn)偏差與計(jì)算結(jié)果算術(shù)平均值的比值。

表4優(yōu)化固相微萃取方法的精密度

以上所述實(shí)施方式僅表達(dá)了本發(fā)明的一種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不能脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。