本發(fā)明涉及一種可實(shí)現(xiàn)人血清白蛋白鑒定及絕對(duì)定量的檢測(cè)試劑盒及測(cè)定方法，屬于檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人血清白蛋白是含585個(gè)氨基酸殘基的單鏈蛋白質(zhì)，約占血漿總蛋白的40～60％，是血漿中主要載體，起維持滲透壓、pH緩沖、載體和營(yíng)養(yǎng)作用，許多水溶性差的物質(zhì)可以通過與其結(jié)合而被運(yùn)輸，如，膽紅素、長(zhǎng)鏈脂肪酸、膽汁酸鹽、前列腺素、類固醇激素、金屬離子及藥物等。目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)人血清白蛋白的主要方法有免疫雙擴(kuò)散法、免疫電泳法、雙縮尿法、鎢酸沉淀法和毛細(xì)管電泳法等。這些方法有易污染、背景值高的缺點(diǎn)，常使檢測(cè)靈敏度降低。檢索發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?01010134413.0的專利申請(qǐng)公開了一種檢測(cè)人乳中人血清白蛋白含量的方法，采用的高壓毛細(xì)管電泳法雖有較高準(zhǔn)確度，但常易受到分子量大小接近的蛋白干擾，使檢測(cè)特異性、靈敏度降低，并且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不適合痕/微量人血清白蛋白的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是提供一種人血清白蛋白檢測(cè)試劑盒，給出一種采用本試劑盒可以克服現(xiàn)有技術(shù)缺點(diǎn)的人血清白蛋白的鑒定和含量測(cè)定的方法。該試劑盒給出了檢測(cè)人血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和對(duì)含血清白蛋白樣品進(jìn)行酶解反應(yīng)的反應(yīng)試劑?？蓪?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和/或酶解反應(yīng)產(chǎn)物(或含內(nèi)標(biāo)物質(zhì))注入(超)高效液相色譜-質(zhì)譜儀中進(jìn)行人血清白蛋白含量測(cè)定。本發(fā)明提供了一種專屬性強(qiáng)、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便，可在臨床上用于樣品中人血清白蛋白含量測(cè)定的一種檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

技術(shù)方案：

一種可實(shí)現(xiàn)人血清白蛋白鑒定及絕對(duì)定量的試劑盒，其特征在于：包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包括特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段，肽段序列為：

該試劑盒還包括反應(yīng)試劑：

反應(yīng)試劑，由以下成分組成

所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特征肽段可單獨(dú)使用，或與其他特征肽段配成兩種或三種混合特征肽段使用。內(nèi)標(biāo)肽段與其他內(nèi)標(biāo)肽段配成兩種或多種混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)使用。

所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的內(nèi)標(biāo)肽段是特征肽段中任一、二或多個(gè)氨基酸上的C、H、O、N被同位素標(biāo)記后的肽段，其中，一個(gè)氨基酸上的C、H、O、N四個(gè)元素可同時(shí)被標(biāo)記，或任意1～3個(gè)元素被標(biāo)記。內(nèi)標(biāo)肽段可單獨(dú)使用，也可與其他特征肽段配成兩種或三種混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)使用。

所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段配成的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可以是單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)、雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或三混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可使用其中的一種、兩種或三種。

1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

①用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是特征肽段，是單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或配成雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或多混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，使用其中的一種或多種。

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)III

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)III

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

三混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

②用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的內(nèi)標(biāo)肽段是單一內(nèi)標(biāo)肽段，或配成多混合內(nèi)標(biāo)肽段，使用其中的一種、兩種或多種；

單一內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

單一內(nèi)標(biāo)肽段III

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段III

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

三混合內(nèi)標(biāo)肽段

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

③將上述特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段聯(lián)合使用，是單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)、雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或多混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，使用其中的一種、兩種或多種；

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)IV

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)V

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)VI

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)VII

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)VIII

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)IX

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)IV

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)V

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)VI

三混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)

④用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的人血清白蛋白檢測(cè)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是單劑、或是雙劑或多劑，根據(jù)上述方法自由組合或選擇其中的一種、兩種或多種。

所述標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成單劑、雙劑或多劑。

所述胰蛋白酶為序列級(jí)胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一種。

所述反應(yīng)試劑配成單劑。

利用上述的可實(shí)現(xiàn)人血清白蛋白鑒定及絕對(duì)定量的試劑盒所實(shí)施的人血清白蛋白含量測(cè)定方法，其特征在于：該方法步驟如下：

(1)將樣品加入碳酸氫銨，渦旋，加入二硫蘇糖醇，溫育振蕩，再加入碘乙酰胺，溫育振蕩，放置至室溫后，再加入胰蛋白酶，溫育振蕩，最后加入甲酸終止反應(yīng)。

(2)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和(1)步驟中最終酶解產(chǎn)物分別注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)或?qū)?nèi)標(biāo)物質(zhì)和(1)步驟中最終酶解產(chǎn)物(含內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，檢測(cè)后通過母離子和子離子的質(zhì)荷比(m/z)及特征肽段的保留時(shí)間(t_R)進(jìn)行定性鑒別，色譜峰峰面積變化測(cè)算出人血清白蛋白的絕對(duì)含量。

溫度控制在25～60℃范圍，溫育時(shí)間控制在0.5～12h，振蕩頻率控制在800～2500rmp，渦旋時(shí)間控制在2～10min，室溫控制在18-22℃范圍。

胰蛋白酶與被測(cè)樣品總蛋白量比例控制在1/1到1/100。

所述步驟(2)為：將特征肽段(一種或兩種)和(1)步驟中最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，或?qū)?nèi)標(biāo)物質(zhì)和(1)步驟中最終酶解產(chǎn)物(含內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，通過m/z和t_R進(jìn)行定性，色譜峰峰面積變化測(cè)算出人血清白蛋白的含量。

有益效果：本發(fā)明具有的有益效果為：本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法能對(duì)樣品中人血清白蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確靈敏的定性和絕對(duì)定量，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床上血樣、尿樣等人組織樣品中人血清白蛋白的檢測(cè)。

本發(fā)明包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(由特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段組成)和酶解反應(yīng)試劑；采用(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)，這是一類采用高效液相色譜分離，串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)碎片離子的設(shè)備，能快速、精確、靈敏的對(duì)微/痕量的人血清白蛋白進(jìn)行絕對(duì)定量。該方法具有操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。

目前，尚未開發(fā)出測(cè)定人血清白蛋白含量的特征肽段及其內(nèi)標(biāo)肽段和酶解反應(yīng)試劑的試劑盒。本發(fā)明成功的彌補(bǔ)了生物檢測(cè)領(lǐng)域的不足，能準(zhǔn)確地對(duì)含微/痕量人血清白蛋白的樣品進(jìn)行絕對(duì)定性鑒別及絕對(duì)定量，具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、靈敏度和準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)。

附圖說明

圖1為特征肽段1的二級(jí)質(zhì)譜圖(m/z＝1245.9)

圖2為特征肽段2的二級(jí)質(zhì)譜圖(m/z＝717.7)

圖3為特征肽段3的二級(jí)質(zhì)譜圖(m/z＝812.3)；

具體實(shí)施方式

通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的權(quán)利要求不僅限于實(shí)施例。

本發(fā)明包括人血清白蛋白檢測(cè)試劑盒和含量測(cè)定方法兩部分。

人血清白蛋白檢測(cè)試劑盒由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和反應(yīng)試劑兩部分組成：

1)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

①用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是特征肽段，可以是單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，或配成雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或多混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，可使用其中的一種或多種。

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)III

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)III

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

三混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

②用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明試劑盒的內(nèi)標(biāo)肽段(任一、二或多個(gè)氨基酸上的C、H、O或/和N被同位素標(biāo)記)，可以是單一內(nèi)標(biāo)肽段，或配成多混合內(nèi)標(biāo)肽段，可使用其中的一種、兩種或多種。

單一內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

單一內(nèi)標(biāo)肽段III

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段III

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

三混合內(nèi)標(biāo)肽段

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

③將上述特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段聯(lián)合使用，以下簡(jiǎn)稱“內(nèi)標(biāo)物質(zhì)”，更有利于人血清白蛋白的定性和定量檢測(cè)?？梢允菃我粌?nèi)標(biāo)物質(zhì)、雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或多混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可使用其中的一種、兩種或多種。

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)IV

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)V

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)VI

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)VII

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)VIII

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)IX

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)II

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)III

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)IV

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)V

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)VI

三混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)

④用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的人血清白蛋白檢測(cè)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以是單劑、也可以是雙劑或多劑，可根據(jù)上述方法自由組合或選擇其中的一種、兩種或多種。

(2)反應(yīng)試劑，用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法的反應(yīng)試劑是單劑，包括：

本發(fā)明測(cè)定人血清白蛋白含量的步驟如下：

(1)將樣品加入碳酸氫銨，振蕩混勻，加入二硫蘇糖醇，溫育振蕩，再加入碘乙酰胺，溫育振蕩，放置至室溫后，再加入胰蛋白酶，溫育振蕩，最后加入甲酸終止反應(yīng)。

(2)將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(或內(nèi)標(biāo)物質(zhì))和最終酶解產(chǎn)物(或含內(nèi)標(biāo)物質(zhì))分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，通過m/z和t_R進(jìn)行定性鑒別，色譜峰峰面積變化測(cè)算出樣品中人血清白蛋白的含量。

通常步驟(1)溫育溫度控制在25～60℃范圍，溫育時(shí)間控制在0.5～12h，振蕩頻率控制在800～2500rmp。胰蛋白酶與被測(cè)樣品總蛋白量比例控制在1/1到1/100，渦旋時(shí)間控制在2～10min。

所述步驟(2)將特征肽段(一種或兩種)和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，或?qū)?nèi)標(biāo)物質(zhì)和最終酶解產(chǎn)物(含內(nèi)標(biāo)肽段)分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，通過m/z及t_R進(jìn)行定性鑒別，通過色譜峰峰面積變化，采用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法測(cè)算出樣品中人血清白蛋白的含量。

實(shí)施例1：

樣品：人血漿

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

(1)樣品的制備：取人血漿0.2ml，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲處理5min，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤腚p混合內(nèi)標(biāo)肽段I，加100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1000rmp)5min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液400μL，60℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液400μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)30min，加入2mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，50℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液400μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

(2)將雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)。特征肽段1和2的檢出限均為1ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.26％，回收率為96.1％～101.1％(n＝6)。

實(shí)施例2：

樣品：人乳

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一內(nèi)標(biāo)肽段I：

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

1)樣品的制備：取人乳1.0ml，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲處理5min，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤?。?nèi)標(biāo)肽段I，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1200rmp)2min，加入150mmol/L二硫蘇糖醇溶液300μL，60℃溫育振蕩(1200rmp)30min，放置至室溫后，加入40mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1200rmp)40min，加入5mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，55℃振蕩(1500rmp)溫育45min，放置至室溫后，加入20％甲酸水溶液250μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)I和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，檢出限為1ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.14％，回收率為95.3％～100.8％(n＝6)。

實(shí)施例3：

樣品：人蛋白尿

雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

1)樣品的制備：取人蛋白尿10ml，離心，棄取上清液，殘?jiān)尤?ml細(xì)胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤?00mmol/L碳酸氫銨溶液1000μL，渦旋(1000rmp)5min，加入150mmol/L二硫蘇糖醇溶液100μL，50℃溫育振蕩(1200rmp)25min，放置至室溫后，加入40mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，35℃溫育振蕩(1000rmp)8h，加入0.3mg/ml胰蛋白酶溶液1000μL，35℃溫育振蕩(1500rmp)12h，放置至室溫后，加入20％甲酸水溶液500μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將雙混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，特征肽段1為1ng，特征肽段3的檢出限3ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.14％，回收率為95.7％～102.4％(n＝6)。

實(shí)施例4：

樣品：人乳

三混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)

三混合內(nèi)標(biāo)肽段：

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

1)樣品的制備：取1ml人乳，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲處理5min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤?。三混合?nèi)標(biāo)肽段，加入120mmol/L碳酸氫銨溶液700μL，渦旋(800rmp)10min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液300μL，50℃溫育振蕩(2000rmp)3h，放置至室溫后，加入10mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，25℃溫育振蕩(2500rmp)30min，加入2mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，55℃振蕩(1500rmp)溫育180min，放置至室溫后，加入5％甲酸水溶液500μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將三混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，特征肽段1、2和3的檢出限均為2ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于4.25％，回收率為96.1～101.7％(n＝6)。

實(shí)施例5：

樣品：人蛋白尿

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I

特征肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)II

特征肽段2 ETYGEMADCCAK

單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)III

特征肽段3 DVFLGMFLYEYAR

單一內(nèi)標(biāo)肽段III

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

1)樣品的制備：取人蛋白尿10ml，離心，棄取上清液，殘?jiān)尤?ml細(xì)胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤雴为?dú)內(nèi)標(biāo)肽段II，加入150mmol/L碳酸氫銨溶液60μL，渦旋(1000rmp)6min，加入10mmol/L二硫蘇糖醇溶液100μL，55℃溫育振蕩(1200rmp)30min，放置至室溫后，加入50mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)50min，加入2mg/ml胰蛋白酶溶液400μL，35℃溫育振蕩(1800rmp)10h，放置至室溫后，加入5％甲酸水溶液500μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)I、II、III與單一內(nèi)標(biāo)肽段混合后，與最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，特征肽段3檢出限為1ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.13％，回收率為96.0％～102.2％(n＝6)，特征肽段1和2作為佐證肽段。

實(shí)施例6：

樣品：人血清

雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)V

雙混合內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

1)樣品的制備：取人血清0.2ml，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲處理5min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤?0mmol/L碳酸氫銨溶液1600μL，渦旋(1000rmp)6min，加入10mmol/L二硫蘇糖醇溶液100μL，55℃溫育振蕩(1200rmp)30min，放置至室溫后，加入50mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)50min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液1000μL，55℃溫育振蕩(1800rmp)3.5h，放置至室溫后，加入5％甲酸水溶液800μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)V與最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，特征肽段1和3檢出限為1ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.68％，回收率為95.0％～98.2％(n＝6)，特征肽段2作為佐證肽段。

實(shí)施例6：

樣品：人全血

單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)VII

單一內(nèi)標(biāo)肽段I

內(nèi)標(biāo)肽段1 ALVLIAFAQYLQQCPFEDHVK

單一內(nèi)標(biāo)肽段II

內(nèi)標(biāo)肽段2 ETYGEMADCCAK

單一內(nèi)標(biāo)肽段III

內(nèi)標(biāo)肽段3 DVFLGMFLYEYAR

1)樣品的制備：取0.5ml人全血，加入1ml細(xì)胞裂解液，超聲處理15min，精密吸取1000μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘?jiān)尤雴我粌?nèi)標(biāo)肽段I、II和III，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液1000μL，渦旋(800rmp)5min，加入150mmol/L二硫蘇糖醇溶液500μL，60℃溫育振蕩(2000rmp)3h，放置至室溫后，加入100mmol/L碘代乙酰胺溶液500μL，35℃溫育振蕩(2500rmp)30min，加入2mg/ml胰蛋白酶溶液400μL，55℃振蕩(1500rmp)溫育240min，放置至室溫后，加入10％甲酸水溶液900μL，終止反應(yīng)，冷凍干燥，得到最終酶解產(chǎn)物。

2)將單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與單一內(nèi)標(biāo)肽段I和III混合后，與最終酶解產(chǎn)物分別注入(超)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中檢測(cè)，特征肽段1、2和3的檢出限均為2ng，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.49％，回收率為95.8～97.6％(n＝6)。

以上實(shí)施例中：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特征肽段單獨(dú)使用或與其他特征肽段配成兩種、三種混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使用。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特征肽段與其內(nèi)標(biāo)肽段配成的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可以是單一內(nèi)標(biāo)物質(zhì)、雙混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或三混合內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，可使用其中的一種、兩種或三種。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配成單劑、雙劑或多劑。

所述胰蛋白酶為序列級(jí)胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一種。上述替換的實(shí)施例在這里不做贅述。

總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒完全可以對(duì)樣品中人血清白蛋白進(jìn)行鑒定，并得出所需的絕對(duì)含量測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、特異性好、精密度高、不受內(nèi)、外源物質(zhì)的污染。

本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法具有專屬性強(qiáng)、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于樣品中人血清白蛋白含量測(cè)定。

蛋白序列

人血清白蛋白

MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYKTTLEKCCAAADPECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETFAEEGKKLVAASRAALGL

人血清白蛋白

MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYKTTLEKCCAAADPECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETFAEEGKKLVAASRAALGL