本發(fā)明涉及柱前衍生化法和發(fā)酵乳制品中組胺的檢測方法。
背景技術(shù)：
：組胺是存在于食品中含量最多、也是對(duì)人類健康影響最大的一種生物胺，由組氨酸經(jīng)過脫羧酶的脫羧作用而形成。許多現(xiàn)代食品的成分中都含有組胺，這是由于生產(chǎn)原料中富含組氨酸和相應(yīng)的脫羧酶，在合適的工藝條件下，發(fā)生脫羧反應(yīng)而形成的。其中，魚類食品中組胺含量最多，乳制品(特別是發(fā)酵乳制品)中組胺含量僅次于魚類食品。適量的組胺在人體內(nèi)有釋放激素、刺激神經(jīng)等生理作用，只有在體內(nèi)積聚達(dá)到高水平或攝入量過高時(shí)才具有毒性。毒理學(xué)研究顯示，人口服組胺8-40mg即產(chǎn)生輕微中毒癥狀，超過40mg產(chǎn)生中等中毒癥狀，超過100mg產(chǎn)生嚴(yán)重中毒癥狀。因此，為保障人類健康和食品安全，準(zhǔn)確檢測乳制品中組胺含量是控制組胺攝入危害、制定科學(xué)高效的風(fēng)險(xiǎn)管理措施、降低組胺膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)的前提基礎(chǔ)。常見的組胺檢測分析方法包括高效液相色譜法(HPLC)、薄層液相色譜(TLC)和酶聯(lián)免疫分析等等。其中，HPLC方法因其簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定及高通量等優(yōu)點(diǎn)，是國內(nèi)外檢測組胺的主要方法。由于組胺沒有滿意的可見和紫外吸收，也沒有熒光成分，所以在使用HPLC方法測定時(shí)，需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化前處理。衍生化分為柱前衍生和柱后衍生。柱后衍生重復(fù)性好、耗時(shí)少，但所需儀器價(jià)格昂貴，難以推廣；因此，柱前衍生成為使用最廣泛的前處理方法。常見的柱前衍生劑有丹磺酰氯、鄰苯二甲醛、苯甲酰氯、二硝基甲酰氯等。丹磺酰氯(Dansylchloride，Dns-Cl)與其他衍生劑相比，可定量完成磺酰化反應(yīng)，且衍生物穩(wěn)定性好、靈敏度高、操作簡單、干擾不明顯，是檢測組胺一種較為理想的柱前衍生化試劑。盡管丹磺酰氯作為柱前衍生劑廣泛應(yīng)用于胺類的檢測中，但關(guān)于使用該方法對(duì)食品中常見生物胺(包括組胺)專項(xiàng)檢測的研究中對(duì)柱前衍生化條件的分析卻相對(duì)較少，而且均集中于單因素條件(如衍生試劑用量、衍生反應(yīng)時(shí)間等)。單因素分析是只改變一個(gè)可控因素，其他因素保持不變的研究；該方法簡單、直觀，但是只考察了單個(gè)因素的變化對(duì)結(jié)果的單獨(dú)影響。綜合考慮多因素的影響常使用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，可同時(shí)考慮幾種因素，從中尋找最佳因素水平組合；但正交試驗(yàn)方法不能在給出的區(qū)域里找到因素和響應(yīng)值之間一個(gè)明確的回歸方程，從而無法找到指定區(qū)域里因素的最佳組合以及響應(yīng)值的最優(yōu)值。該現(xiàn)象亟待解決。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)對(duì)發(fā)酵乳制品中組胺的含量進(jìn)行檢測時(shí)，不存在對(duì)柱前衍生化過程中諸多因素的優(yōu)化研究，以及在影響檢測結(jié)果的諸多因素中無法找到因素的最佳組合和最優(yōu)值的缺陷，提供了一種柱前衍生化法和發(fā)酵乳制品中組胺的檢測方法。本發(fā)明確定的柱前衍生化法能夠處理成分相對(duì)復(fù)雜的發(fā)酵乳制品，在使用高效液相色譜-柱前衍生方法對(duì)乳制品中組胺含量檢測的過程中，柱前衍生化條件簡便、高效、準(zhǔn)確性和精度均較高，能夠滿足實(shí)驗(yàn)室、工廠等需要精確檢測乳制品中組胺含量的要求。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題。本發(fā)明提供了一種柱前衍生化法，其包括下述步驟：(1)將待測樣品進(jìn)行預(yù)處理：待測樣品在濃度為0.4～0.8mol/L高氯酸水溶液中混合反應(yīng)20～45分鐘后，1000～2500G離心8～15分鐘，取上清液，再用所述高氯酸水溶液配制成濃度為50～250g/L的預(yù)處理后的待測樣品；其中，所述待測樣品為發(fā)酵乳制品；(2)將預(yù)處理后的待測樣品中加入內(nèi)標(biāo)溶液后，在衍生化條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)后，除去衍生化反應(yīng)過程中的丙酮，再用溶劑萃取，取萃取相， 即得柱前衍生化反應(yīng)后的待測樣品；其中，所述溶劑為能溶解組胺但不溶于水的有機(jī)溶劑；所述預(yù)處理后的待測樣品和內(nèi)標(biāo)溶液的體積比為30:1～70:1；所述的衍生化條件為在pH值在8-12的取值范圍內(nèi)，通過對(duì)以下2次7項(xiàng)回歸方程取值獲得：Y＝29.92+2.62X1+1.48X2+1.52X3-2.19X2X3-3.39X12-2.64X22其中，Y為組胺含量，單位mg/kg；X1為丹磺酰氯溶液中丹磺酰氯的濃度，丹磺酰氯溶液中的溶劑為丙酮，取值范圍為1.0-10.0g/L；X2為衍生化反應(yīng)溫度，取值范圍為40-60℃；X3為衍生化反應(yīng)時(shí)間，取值范圍為15-60分鐘。步驟(1)中，所述高氯酸水溶液的濃度較佳地為0.55～0.65mol/L，更佳地為0.6mol/L。步驟(1)中，所述混合反應(yīng)的時(shí)間較佳地為25～35分鐘，更佳地為30分鐘。步驟(1)中，所述離心的條件較佳地為1800～2200G，8～12分鐘，更佳地為2000G，10分鐘。步驟(1)中，所述預(yù)處理后的待測樣品的濃度較佳地為100～250g/L，更佳地為100～200g/L。步驟(1)中，所述發(fā)酵乳制品一般是指乳在發(fā)酵劑(菌種)作用下發(fā)酵而成的乳制品，較佳地選自為干酪、發(fā)酵乳和發(fā)酵稀奶油中的一種或多種，更佳地選自干酪和/或發(fā)酵乳。所述干酪為天然干酪和/或再制干酪。按照本領(lǐng)域常規(guī)，所述發(fā)酵乳在進(jìn)行預(yù)處理前，一般先攪拌均勻；所述干酪為片狀或塊狀時(shí)，在預(yù)處理前一般先進(jìn)行絞碎。步驟(1)中，所述的混合反應(yīng)的操作較佳地為通過恒溫震蕩器進(jìn)行震蕩。步驟(1)中，較佳地，在預(yù)處理過程中使用高氯酸水溶液進(jìn)行多次混合反應(yīng)，更佳地使用高氯酸水溶液進(jìn)行3次混合反應(yīng)。根據(jù)本領(lǐng)域常識(shí)，將 多次混合反應(yīng)后的產(chǎn)物再進(jìn)行上述離心過程，取上清液進(jìn)行合并。步驟(1)中，所述預(yù)處理過程較佳地按下述步驟進(jìn)行：將4～6g的所述待測樣品在15～50mL、0.4～0.8mol/L高氯酸水溶液中混勻，震蕩20～45min后，1000～2500G離心8～15min，取上清液，采用0.4～0.8mol/L高氯酸水溶液稀釋至50mL即可；更佳地按下述步驟進(jìn)行：將5g所述待測樣品溶于15mL，0.6mol/L高氯酸水溶液，振蕩30min后，2000G離心10min，取上清液，采用0.6mol/L的高氯酸水溶液將濾液稀釋至50mL即可。步驟(2)中，所述內(nèi)標(biāo)溶液為采用丹磺酰氯作為柱前衍生化法的衍生劑時(shí)，本領(lǐng)域內(nèi)常用的內(nèi)標(biāo)溶液，較佳地為濃度為100mg/L的1,7-庚二胺的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。所述內(nèi)標(biāo)溶液較佳地通過下述步驟制的：①稱取1,7-庚二胺(1,7-heptanediamine)標(biāo)準(zhǔn)品適量溶于0.1mol/L鹽酸中，配制成1000mg/L的母液；②使用0.1mol/L鹽酸將所述母液稀釋成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液即可。所述1,7-庚二胺較佳地為色譜級(jí)。步驟(2)中，所述丙酮較佳地通過35～45℃的氮?dú)獯党?，更佳地通過40℃的氮?dú)獯党?。步驟(2)中，所述溶劑較佳地為正戊烷、己烷和正庚烷中的一種或多種，更佳地為正庚烷。步驟(2)中，所述預(yù)處理后的待測樣品和所述溶劑的體積比較佳地為1:10～1:4。步驟(2)中，進(jìn)一步優(yōu)選，所述X1為7.08～7.48g/L，所述pH值為10.0，所述X2為48.02-49.47℃，所述X3為60分鐘；更優(yōu)選，所述X1為7.25g/L，所述pH值為10.0，所述X2為49.0℃，所述X3為60分鐘。本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵乳制品中組胺的檢測方法，其包括下述步驟：(1)將按照所述柱前衍生化反應(yīng)處理后的待測樣品先去除溶劑后，加入甲醇溶解，再經(jīng)0.22μm或0.45μm膜過濾，得進(jìn)料樣品；(2)將步驟(1)中所述進(jìn)料樣品再進(jìn)行高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行檢測，即可。高效液相色譜法(HPLC)是色譜法的重要分支，是以液體(不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等)為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器(最常用的是紫外檢測器或熒光檢測器)進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分析。步驟(1)中，所述去除溶劑的方式較佳地為氮?dú)獯蹈?。步驟(2)中，所述的高效液相色譜法(HPLC)中，較佳地色譜柱為C18反相色譜柱；更佳地色譜柱為型號(hào)AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，其中，內(nèi)徑250mm×4.6mm，粒徑5μm。步驟(2)中，所述檢測較佳地采用高效液相色譜-熒光檢測器進(jìn)行檢測。其中，所述熒光檢測器的激發(fā)波長較佳地為330～380nm，更佳地為350nm。所述熒光檢測器的發(fā)射波長較佳地為470～560nm，更佳地為520nm。步驟(2)中，所述的檢測較佳地使用梯度洗脫的方法，流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為甲醇。所述梯度洗脫的方法為本領(lǐng)域常規(guī)。其中，較佳地，所述流動(dòng)相A或所述流動(dòng)相B的洗脫的梯度條件如下，時(shí)間min0714202730353645流動(dòng)相A％4535303010004545流動(dòng)相B％55657070901001005555步驟(2)中，較佳地，所述進(jìn)料樣品的流速為0.5～1.5mL/min，更佳地為1.0mL/min。步驟(2)中，較佳地，檢測時(shí)的柱溫為20～30℃，更佳地為25℃。步驟(2)中，較佳地，檢測時(shí)的進(jìn)樣體積為15～25μL，更佳地為20μL。步驟(2)中，較佳地，所述高效液相色譜法檢測后，待測樣品中組胺含量的按照式(1)進(jìn)行計(jì)算：式(1)其中，c為待測樣品中組胺含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；A為待測樣品中組胺的峰面積；A’為組胺標(biāo)樣的峰面積；A’i為標(biāo)準(zhǔn)樣中內(nèi)標(biāo)的峰面積；Ai為待測樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積；20為轉(zhuǎn)換系數(shù)。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明確定的柱前衍生化法能夠處理成分相對(duì)復(fù)雜的發(fā)酵乳制品，衍生化條件簡便、高效、準(zhǔn)確性和精密度均較高，具有更好的預(yù)測性能夠滿足實(shí)驗(yàn)室、工廠等需要精確檢測乳制品中組胺含量的要求。附圖說明圖1為實(shí)施例1組胺含量(Y)-丹磺酰氯濃度(X1)和pH值(X4)的響應(yīng)曲面圖。圖2為實(shí)施例1組胺含量(Y)-衍生化反應(yīng)溫度(X2)和衍生化反應(yīng)時(shí)間(X3)的響應(yīng)曲面圖，其中，圓點(diǎn)為響應(yīng)面方法擬合誤差大于5％的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)心點(diǎn)數(shù)據(jù)代表高于擬合值，空心點(diǎn)數(shù)據(jù)代表低于擬合值。具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。實(shí)施例1響應(yīng)面法優(yōu)化的衍生化條件通過下述步驟制得：1、配制溶液(1)組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取組胺標(biāo)準(zhǔn)品(色譜級(jí))適量溶于0.1mol/L鹽酸中，配制成1000mg/L的母液，置4℃冰箱保存。使用0.1mol/L鹽酸將母液稀釋成100mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。(2)內(nèi)標(biāo)溶液準(zhǔn)確稱取1,7-庚二胺(1,7-heptanediamine，色譜級(jí))標(biāo)準(zhǔn)品適量溶于0.1mol/L鹽酸中，配制成1000mg/L的母液，置4℃冰箱保存。使用0.1mol/L鹽酸將母液稀釋成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。2、待測樣品的預(yù)處理取稱重5g絞碎的天然干酪X(市售產(chǎn)品，瑞士大孔天然干酪，生產(chǎn)廠家為德國多美鮮公司)，加入15ml，0.6mol/L高氯酸水溶液混勻、振蕩30min后2000G離心10min，取上清液。按以上步驟使用高氯酸提取樣品3次，合并上清液并過濾至容量瓶。用0.6mol/L的高氯酸水溶液將濾液稀釋至50ml，搖勻待用。預(yù)處理后待測樣品的濃度為100.25g/L。3、響應(yīng)面方法優(yōu)化前處理?xiàng)l件待優(yōu)化的衍生化條件為：pH值、衍生化試劑(丹磺酰氯)濃度、衍生化反應(yīng)溫度及時(shí)間。使用響應(yīng)面方法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)條件優(yōu)化方案，見表1。表1優(yōu)化衍生化條件的Box-Behnken設(shè)計(jì)方案注：A：-1(1)表示衍生化實(shí)驗(yàn)條件的設(shè)定，其中-1為因素的水平(各因素分別為-1、0、1三個(gè)水平)，1為因素的實(shí)際數(shù)據(jù)，即丹磺酰氯濃度為1mg/L。B：中心試驗(yàn)點(diǎn)。4、樣品的衍生化反應(yīng)(1)待測樣品的衍生化反應(yīng)取上述預(yù)處理后的待測樣品0.5mL加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液后，采用上述步驟3中響應(yīng)面方法所得的實(shí)驗(yàn)編號(hào)1～29所得條件進(jìn)行衍生化反應(yīng)后，在40℃下氮?dú)獯党ケ?，加?mL正庚烷萃取，吸取上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤? 1mL甲醇完全溶解。經(jīng)0.45μm濾膜過濾后待測。其中，加入1.5mL碳酸鹽緩沖液(碳酸鹽緩沖液的pH值即為體系中所需pH)加入2mL丹磺酰氯溶液(溶劑為丙酮，溶液濃度為步驟3中表1中的濃度)。(2)組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化反應(yīng)取組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL，加入10μL內(nèi)標(biāo)后，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。衍生化反應(yīng)的步驟同上述(1)待測樣品的衍生化反應(yīng)。5、液相色譜測定使用高效液相色譜(HPLC)及熒光檢測器檢測衍生化處理后的樣品。色譜柱為C18反相色譜柱(型號(hào)為AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，內(nèi)徑250mm×4.6mm，粒徑5μm)，熒光檢測器的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為350nm和520nm。流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫程序按表2進(jìn)行：表2高效液相色譜檢測組胺的梯度洗脫程序時(shí)間min0714202730353645流動(dòng)相A％4535303010004545流動(dòng)相B％55657070901001005555柱前衍生化法反應(yīng)后的待測樣品的流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：20μL。6、計(jì)算根據(jù)經(jīng)優(yōu)化后的衍生化條件反應(yīng)，測得數(shù)據(jù)如下：待測樣品中組胺的峰面積為34009，組胺標(biāo)樣的峰面積為17820，標(biāo)準(zhǔn)樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為4047，待測樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為4344。按式(1)計(jì)算樣品中組胺的含量為35.56mg/kg：式(1) 其中，c為待測樣品中組胺含量，單位為毫克每千克(mg/kg)；A為待測樣品中組胺的峰面積；A’為組胺標(biāo)樣的峰面積；A’i為標(biāo)準(zhǔn)樣中內(nèi)標(biāo)的峰面積；Ai為待測樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積；20為轉(zhuǎn)換系數(shù)。7、結(jié)果分析根據(jù)表2中檢測組胺的梯度洗脫程序?qū)ν桓衫覙悠愤M(jìn)行試驗(yàn)并測定其組胺含量，得到的試驗(yàn)結(jié)果使用專業(yè)分析軟件Design-Expert分析，結(jié)果如圖1、圖2所示，圖1為實(shí)施例1組胺含量(Y)-丹磺酰氯濃度(X1)和pH值(X4)的響應(yīng)曲面圖；圖2為實(shí)施例1組胺含量(Y)-衍生化反應(yīng)溫度(X2)和衍生化反應(yīng)時(shí)間(X3)的響應(yīng)曲面圖，圖2中的圓點(diǎn)為響應(yīng)面方法擬合誤差大于5％的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(其中，實(shí)心點(diǎn)數(shù)據(jù)代表高于擬合值，空心點(diǎn)數(shù)據(jù)代表低于擬合值)。響應(yīng)面法設(shè)定的變量參數(shù)在pH值在8-12的取值范圍內(nèi)，通過對(duì)以下2次7項(xiàng)回歸方程分析獲得：Y＝29.92+2.62X1+1.48X2+1.52X3-2.19X2X3-3.39X12-2.64X22其中，Y為組胺含量，單位mg/kg；X1為丹磺酰氯溶液中丹磺酰氯的濃度，丹磺酰氯溶液中的溶劑為丙酮，取值范圍為1.0-10.0g/L；X2為衍生化反應(yīng)溫度，取值范圍為40-60℃；X3為衍生化反應(yīng)時(shí)間，取值范圍為15-60分鐘。根據(jù)分析結(jié)果，響應(yīng)面方法優(yōu)化的衍生化條件為：丹磺酰氯濃度為7.08～7.48g/L，pH值為10.0，衍生反應(yīng)溫度為48.02-49.47℃，衍生反應(yīng)時(shí)間為60min。最優(yōu)化衍生化條件為：丹磺酰氯濃度7.25g/L，pH值10.0，衍生反應(yīng)溫度49.0℃，衍生反應(yīng)時(shí)間60min。實(shí)施例2(1)樣品預(yù)處理取稱重5g已攪拌均勻的發(fā)酵乳樣品A(市售產(chǎn)品，內(nèi)蒙古老酸奶，生產(chǎn)廠家為蒙牛公司)，加入15mL，0.6mol/L高氯酸水溶液混勻、振蕩30min后2000G離心10min，取上清液。按以上步驟使用高氯酸提取樣品3次，合并上清液并過濾至容量瓶。用0.6mol/L的高氯酸水溶液將濾液稀釋至50mL，搖勻待用。預(yù)處理后待測樣品的濃度為100.10g/L。(2)衍生化反應(yīng)取上述樣液0.5mL加入實(shí)施例1制得的10μL內(nèi)標(biāo)溶液后，再加入1.5mL，pH10.0的碳酸鹽緩沖液和2mL，7.25g/L丹磺酰氯溶液(溶劑為丙酮)，在49.0℃下反應(yīng)60min，在40℃下氮吹除去丙酮，加入3mL正庚烷萃取，吸取上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?mL甲醇完全溶解。經(jīng)0.45μm濾膜過濾后待測。取實(shí)施例1制得的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL，加入10μL內(nèi)標(biāo)后，同上述衍生化步驟。(3)高效液相色譜測定使用高效液相色譜(HPLC)及熒光檢測器測定衍生化處理后的樣品。色譜柱為C18反相色譜柱(型號(hào)為AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，內(nèi)徑250mm×4.6mm，粒徑5μm)，熒光檢測器的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為350nm和520nm。流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫程序按實(shí)施例1表2進(jìn)行。(4)計(jì)算待測樣品中組胺的峰面積為2545，組胺標(biāo)樣的峰面積為17820，標(biāo)準(zhǔn)樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為4047，待測樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為3918。按實(shí)施例1式(1)計(jì)算得到發(fā)酵乳樣品A組胺含量為2.95mg/kg。實(shí)施例3(1)樣品預(yù)處理取稱重5g已絞碎的天然干酪B(市售產(chǎn)品，切達(dá)干酪，生產(chǎn)廠家為英 國庫姆城堡公司)，加入15mL，0.6mol/L高氯酸水溶液混勻、振蕩30min后2000G離心10min，取上清液。按以上步驟使用高氯酸提取樣品3次，合并上清液并過濾至容量瓶。用0.6mol/L的高氯酸水溶液將濾液稀釋至50mL，搖勻待用。預(yù)處理后待測樣品的濃度為104.77g/L。(2)衍生化反應(yīng)取上述樣液0.5mL加入實(shí)施例1制得的10μL內(nèi)標(biāo)溶液后，再加入1.5mL，pH10.0的碳酸鹽緩沖液和2mL，7.25g/L丹磺酰氯溶液(溶劑為丙酮)，在49.0℃下反應(yīng)60min，在40℃下氮吹除去丙酮，加入3mL正庚烷萃取，吸取上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?mL甲醇完全溶解。經(jīng)0.45μm濾膜過濾后待測。取實(shí)施例1制得的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL，加入10μL內(nèi)標(biāo)后，同上述衍生化步驟。(3)高效液相色譜測定使用高效液相色譜(HPLC)及熒光檢測器測定衍生化處理后的樣品。色譜柱為C18反相色譜柱(型號(hào)為AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，內(nèi)徑250mm×4.6mm，粒徑5μm)，熒光檢測器的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為350nm和520nm。流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫程序按實(shí)施例1表2進(jìn)行。(4)計(jì)算待測樣品中組胺的峰面積為56644，組胺標(biāo)樣的峰面積為17820，標(biāo)準(zhǔn)樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為4047，待測樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為4151。按實(shí)施例1式(1)計(jì)算得到天然干酪B組胺含量為61.98mg/kg。實(shí)施例4(1)樣品預(yù)處理取稱重5g已絞碎的再制干酪C(市售產(chǎn)品，圣茉莉奶酪，生產(chǎn)廠家為法國博格瑞公司)，加入15mL，0.6mol/L高氯酸水溶液混勻、振蕩30min后2000G離心10min，取上清液。按以上步驟使用高氯酸提取樣品3次，合并 上清液并過濾至容量瓶。用0.6mol/L的高氯酸水溶液將濾液稀釋至50mL，搖勻待用。預(yù)處理后待測樣品的濃度為102.52g/L。(2)衍生化反應(yīng)取上述樣液0.5mL加入實(shí)施例1制得的10μL內(nèi)標(biāo)溶液后，再加入1.5mL，pH10.0的碳酸鹽緩沖液和2mL，7.25g/L丹磺酰氯溶液(溶劑為丙酮)，在49.0℃下反應(yīng)60min，在40℃下氮吹除去丙酮，加入3mL正庚烷萃取，吸取上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?mL甲醇完全溶解。經(jīng)0.45μm濾膜過濾后待測。取實(shí)施例1制得的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL，加入10μL內(nèi)標(biāo)后，同上述衍生化步驟。(3)高效液相色譜測定使用高效液相色譜(HPLC)及熒光檢測器測定衍生化處理后的樣品。色譜柱為C18反相色譜柱(型號(hào)為AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，內(nèi)徑250mm×4.6mm，粒徑5μm)，熒光檢測器的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為350nm和520nm。流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫程序按實(shí)施例1表2進(jìn)行。(4)計(jì)算待測樣品中組胺的峰面積為18780，組胺標(biāo)樣的峰面積為17820，標(biāo)準(zhǔn)樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為4047，待測樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為4135。按實(shí)施例1式(1)計(jì)算得到再制干酪C組胺含量為20.63mg/kg。實(shí)施例5(1)樣品預(yù)處理取稱重5g已攪拌均勻的發(fā)酵乳樣品D(市售產(chǎn)品，牦牛酸奶，生產(chǎn)廠家為青海西寧大美公司)，加入15mL，0.6mol/L高氯酸水溶液混勻、振蕩30min后2000G離心10min，取上清液。按以上步驟使用高氯酸提取樣品3次，合并上清液并過濾至容量瓶。用0.6mol/L的高氯酸水溶液將濾液稀釋至50mL，搖勻待用。預(yù)處理后待測樣品的濃度為100.46g/L。(2)衍生化反應(yīng)取上述樣液0.5mL加入實(shí)施例1制得的10μL內(nèi)標(biāo)溶液后，再加入1.5mL，pH10.0的碳酸鹽緩沖液和2mL，7.25g/L丹磺酰氯溶液(溶劑為丙酮)，在49.0℃下反應(yīng)60min，在40℃下氮吹除去丙酮，加入3mL正庚烷萃取，吸取上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?mL甲醇完全溶解。經(jīng)0.45μm濾膜過濾后待測。取實(shí)施例1制得的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL，加入10μL內(nèi)標(biāo)后，同上述衍生化步驟。(3)高效液相色譜測定使用高效液相色譜(HPLC)及熒光檢測器測定衍生化處理后的樣品。色譜柱為C18反相色譜柱(型號(hào)為AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，內(nèi)徑250mm×4.6mm，粒徑5μm)，熒光檢測器的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為350nm和520nm。流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫程序按實(shí)施例1表2進(jìn)行。(4)計(jì)算待測樣品中組胺的峰面積為3829，組胺標(biāo)樣的峰面積為17820，標(biāo)準(zhǔn)樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為4047，待測樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為4219。按實(shí)施例1式(1)計(jì)算得到發(fā)酵乳樣品D組胺含量為4.12mg/kg。實(shí)施例6本實(shí)施例6采用的衍生化條件為實(shí)施例1得出的最優(yōu)化衍生化條件。(1)樣品預(yù)處理取稱重5g絞碎的天然干酪X(市售產(chǎn)品，瑞士大孔天然干酪，生產(chǎn)廠家為德國多美鮮公司)，分別加入15mL，0.6mol/L高氯酸水溶液混勻、振蕩30min后2000G離心10min，取上清液。按以上步驟分別使用高氯酸提取樣品3次，合并上清液并過濾至容量瓶。用0.6mol/L的高氯酸水溶液將濾液稀釋至50mL并搖勻。預(yù)處理后待測樣品的濃度為100.25g/L。(2)衍生化反應(yīng)取上述樣液0.5mL加入實(shí)施例1制得的10μL內(nèi)標(biāo)溶液后，再加入1.5mL，pH10.0的碳酸鹽緩沖液和2mL，7.25g/L丹磺酰氯溶液(溶劑為丙酮)，在49.0℃下反應(yīng)60min，在40℃下氮吹除去丙酮，加入3mL正庚烷萃取，吸取上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?mL甲醇完全溶解。經(jīng)0.45μm濾膜過濾后待測。取實(shí)施例1制得的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5mL，加入10μL內(nèi)標(biāo)后，同上述衍生化步驟。(3)高效液相色譜測定使用高效液相色譜(HPLC)及熒光檢測器測定衍生化處理后的樣品。色譜柱為C18反相色譜柱(型號(hào)為AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱，內(nèi)徑250mm×4.6mm，粒徑5μm)，熒光檢測器的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為350nm和520nm。流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為甲醇，梯度洗脫程序按實(shí)施例1表2進(jìn)行。(4)計(jì)算待測樣品中組胺的峰面積為34009，組胺標(biāo)樣的峰面積為17820，標(biāo)準(zhǔn)樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為4047，待測樣品中內(nèi)標(biāo)的峰面積為4344。按實(shí)施例1式(1)計(jì)算得到發(fā)酵乳樣品X組胺含量為35.56mg/kg。實(shí)施例7(1)重新稱重5g絞碎的天然干酪X(市售產(chǎn)品，瑞士大孔天然干酪，生產(chǎn)廠家為德國多美鮮公司)，按照實(shí)施例6的步驟進(jìn)行樣品預(yù)處理，樣品預(yù)處理后加入實(shí)施例1中的組胺標(biāo)準(zhǔn)母液50μL搖勻，作為干酪樣品的加標(biāo)樣液待用。(2)將步驟(1)所得的干酪樣品的加標(biāo)樣液按照實(shí)施例6的步驟進(jìn)行衍生化反應(yīng)、高效液相色譜測定、計(jì)算得到天然干酪X組胺含量為44.88mg/kg。實(shí)施例8(1)重新稱重5g已攪拌均勻的發(fā)酵乳樣品A(市售產(chǎn)品，內(nèi)蒙古老酸 奶，生產(chǎn)廠家為蒙牛公司)，按照實(shí)施例2的步驟進(jìn)行樣品預(yù)處理，樣品預(yù)處理后加入實(shí)施例1中的組胺標(biāo)準(zhǔn)母液5μL搖勻，作為發(fā)酵乳樣品的加標(biāo)樣液待用。(2)將步驟(1)所得的發(fā)酵乳樣品的加標(biāo)樣液按照實(shí)施例2的步驟進(jìn)行衍生化反應(yīng)、高效液相色譜測定、計(jì)算得到發(fā)酵乳樣品A組胺含量為3.84mg/kg。效果實(shí)施例1本效果實(shí)施例證明在實(shí)施例1獲得的最優(yōu)化衍生條件下，測得的組胺的衍生化轉(zhuǎn)化率最高。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)的衍生化條件(如表3)，其余實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)施例6檢測方法相同，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測得表3中實(shí)驗(yàn)編號(hào)為1～29的組胺的濃度。由上述實(shí)驗(yàn)編號(hào)為1～29的實(shí)驗(yàn)可知，實(shí)施例6中在最優(yōu)化衍生化條件下測得的組胺的含量最高。表3優(yōu)化衍生化條件的試驗(yàn)結(jié)果注：1為中心試驗(yàn)點(diǎn)。效果實(shí)施例2本效果實(shí)施例用于證明最優(yōu)化衍生化條件檢測發(fā)酵乳中組胺數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，結(jié)果如表4所述。其中，實(shí)施例7、8加標(biāo)樣液中組胺標(biāo)準(zhǔn)含量為換算成乳制品的加標(biāo)樣液中組胺的含量。由表4可知，以實(shí)施例6、7為一組，測定天然干酪X的回收率為93.17％；以實(shí)施例2、8為一組，測定發(fā)酵乳樣品A的回收率為88.59％。表4效果實(shí)施例3以實(shí)施例6為例，檢測使用最優(yōu)化條件檢測發(fā)酵乳中所得組胺數(shù)據(jù)的精密度。在實(shí)施例6步驟(3)中，將衍生化處理后的待測樣品重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果如表5所述。其中，平行樣品是指的將在實(shí)施例6同等條件下，檢測6次所得的檢測值；RSD為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relativestandarddeviation)，指標(biāo)準(zhǔn)偏差與計(jì)算結(jié)果算術(shù)平均值的比值。表5當(dāng)前第1頁1 2 3