本發(fā)明涉及一種用于銀杏葉提取物中有機(jī)酸含量的測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
：銀杏葉為銀杏科植物銀杏(GinkgobilobaL.)的干燥葉，味微苦，性平，具有益心、活血止痛、斂肺平喘、化濕止瀉的功效。銀杏葉提取物臨床上用于治療心腦血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。銀杏葉提取物成分復(fù)雜，目前的質(zhì)量控制指標(biāo)僅有兩類成分：黃酮醇苷類和內(nèi)酯類，兩者總含量為30％。另有7成成分未被列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。已有文獻(xiàn)報(bào)道，銀杏葉提取物除了黃酮醇苷和內(nèi)酯成分外，還含有原花青素、有機(jī)酸、雙黃酮、異黃酮等成分。因此，為了逐步增加銀杏葉提取物中的可測(cè)成分，逐步提高和完善銀杏葉提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)除黃酮醇苷和內(nèi)酯成分之外的其他成分進(jìn)行研究，就顯得尤為重要。文獻(xiàn)“高效液相色譜法測(cè)定銀杏果中有機(jī)酸的含量”(分析科學(xué)學(xué)報(bào),2011,27(3):336-338.)報(bào)道了白果中含有草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸，并用一種色譜條件同時(shí)測(cè)定了這7種小分子有機(jī)酸。色譜條件流動(dòng)相為3％甲醇-0.01mol/LK2HPO4，即用到了緩沖鹽體系。本發(fā)明人團(tuán)隊(duì)在研究中發(fā)現(xiàn)，雖然白果中含有上述7種小分子有機(jī)酸，但銀杏葉提取物中卻不含這些有機(jī)酸，但含有至少5種其他的有機(jī)酸類成分，包括莽草酸、沒食子酸、原兒茶酸、6-羥基犬尿喹啉酸(6-HKA)和對(duì)羥基苯甲酸。這些有機(jī)酸類成分均具有較好的生物活性：莽草酸具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗血栓、抗HIV等作用，是合成抗禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒藥物“達(dá)菲”的重要原料；沒食子酸具有抗腫瘤、保肝、抗真菌感染等作用；原兒茶酸具有抗炎、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗病毒、促進(jìn)干細(xì)胞增殖分化等多種功效；6-HKA是高效的谷氨酸受體拮抗劑，對(duì)神經(jīng)興奮性損傷具有很好的保護(hù)作用；對(duì)羥基苯甲酸具有抗菌消炎的作用。在測(cè)定銀杏葉提取物中的有機(jī)酸含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)干擾測(cè)定最主要的成分是原花青素。因此，準(zhǔn)確測(cè)定有機(jī)酸含量的前提是對(duì)有機(jī)酸類成分進(jìn)行純化。有機(jī)酸常用的純化方式有兩種，一是用堿水提取，提取液調(diào)酸性后用有機(jī)溶劑萃取；另一種是用陰離子交換樹脂進(jìn)行純化。兩者方法都用到了腐蝕性溶劑或毒性溶劑，前者包括氫氧化鈉、乙酸乙酯，后者包括氫氧化鈉、甲醇等。并且這兩種方法都不能有效的去除銀杏葉提取物中的原花青素，并且有機(jī)酸也有損失。去除原花青素最佳的方法是用聚酰胺樹脂，可以完全吸附這類成分，但同時(shí)，也會(huì)損失部分有機(jī)酸，如6-羥基犬尿喹啉酸(6-HKA)。專利“一種天然6-羥基犬尿喹啉酸提取物的制備方法及其應(yīng)用”(CN201410007590.0)說明了6-HKA必須要用含酸的70％乙醇才能將吸附在聚酰胺樹脂上的6-HKA完全洗脫下來，而此時(shí)，部分原花青素成分也會(huì)被洗脫下來，從而干擾測(cè)定。大孔樹脂純化法是一種常用的純化原花青素的方法，但原花青素的極性跨度很大，單體成分，如兒茶素微溶于冷水，而高聚體原花青素，易溶于冷水，并且原花青素的聚合度越高，極性越大，因此大孔樹脂可以用于吸附原花青素，但極性較大的高聚體原花青素和有機(jī)酸成分用水或低濃度乙醇水溶液就可以洗脫下來，仍然無法完全去除干擾。綜上所述，準(zhǔn)確測(cè)定銀杏葉提取物中的有機(jī)酸含量對(duì)于控制銀杏葉提取物的質(zhì)量，提高銀杏葉提取物的標(biāo)準(zhǔn)，有著重大的意義；而找到一種去除原花青素，準(zhǔn)確測(cè)定銀杏葉提取物中有機(jī)酸的方法是目前醫(yī)藥行業(yè)人員極為關(guān)心的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種銀杏葉提取物中有機(jī)酸含量測(cè)定方法，目的在于能夠定量測(cè)定銀杏葉提取物中有機(jī)酸的含量，以達(dá)到銀杏葉提取物的質(zhì)量更加可控的目標(biāo)。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案具體如下：一種銀杏葉提取物中有機(jī)酸含量測(cè)定方法，包括如下步驟：(1)銀杏葉提取物的前處理方法：取銀杏葉提取物，用含牛血清白蛋白的水溶液超聲提取，過濾；濾液濃縮干燥，得有機(jī)酸提取物；(2)供試品溶液的制備：有機(jī)酸提取物用含0.05～0.4％磷酸的水溶液溶解定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；(3)對(duì)照品溶液的制備：精密稱取莽草酸、沒食子酸、原兒茶酸、6-羥基犬尿喹啉酸、對(duì)羥基苯甲酸的標(biāo)準(zhǔn)品適量，用流動(dòng)相(乙腈:0.1％磷酸水溶液(V/V)：3.5:96.5)溶解，即得；(4)高效液相色譜分析：分別吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀，按如下色譜條件測(cè)定，得五種有機(jī)酸的對(duì)照品色譜圖和供試品的色譜圖；色譜條件為：固定相是以辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1％磷酸水溶液；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)0～6min為215nm，6～25min為254nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10ul；流速為1.0ml/min；采用等度洗脫，流動(dòng)相A的體積分?jǐn)?shù)為3.5％，流動(dòng)相B的體積分?jǐn)?shù)為96.5％。本發(fā)明制備方法中：步驟1)中，銀杏葉提取物的前處理方法為，取銀杏葉提取物100mg，用含0.1～10g/L牛血清白蛋白的水溶液5～100ml，20～70℃超聲提取5min～3h，過濾；濾液濃縮干燥，得有機(jī)酸提取物。步驟1)中銀杏葉提取物最佳前處理方法優(yōu)選為，取銀杏葉提取物100mg，用含1g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃超聲提取1h，過濾；濾液濃縮干燥，得有機(jī)酸提取物。步驟2)中供試品溶液的制備方法優(yōu)選為，有機(jī)酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。本發(fā)明提供的一種銀杏葉提取物中有機(jī)酸含量測(cè)定方法，具有如下優(yōu)勢(shì)：1.本發(fā)明與常用的純化有機(jī)酸的方法相比，未用到強(qiáng)腐蝕性和毒性的溶劑，整個(gè)前處理過程只用乙醇和水，環(huán)保無污染。2.本發(fā)明用牛血清白蛋白來去除原花青素，用含磷酸的水溶液來制樣，充分去除了干擾有機(jī)酸主峰色譜行為的雜質(zhì)，大大改善了色譜峰的色譜行為和分離效果，從而達(dá)到了準(zhǔn)確定量有機(jī)酸的目的。3.本發(fā)明測(cè)定方法使用的色譜條件中的流動(dòng)相為乙腈:0.1％磷酸水溶液(V/V)：3.5:96.5，未用到緩沖鹽體系，更有利于色譜柱的平衡、后處理和保存。附圖說明：圖1為混合對(duì)照品色譜圖，1號(hào)峰為莽草酸、2號(hào)峰為沒食子酸、3號(hào)峰為原兒茶酸、4號(hào)峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號(hào)峰為對(duì)羥基苯甲酸圖2為純化方法1(本發(fā)明方法)制備的樣本色譜圖，1號(hào)峰為莽草酸、2號(hào)峰為沒食子酸、3號(hào)峰為原兒茶酸、4號(hào)峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號(hào)峰為對(duì)羥基苯甲酸圖3為純化方法2制備的樣本色譜圖，1號(hào)峰為莽草酸、2號(hào)峰為沒食子酸、3號(hào)峰為原兒茶酸、4號(hào)峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號(hào)峰為對(duì)羥基苯甲酸圖4為純化方法3制備的樣本色譜圖，1號(hào)峰為莽草酸、2號(hào)峰為沒食子酸、3號(hào)峰為原兒茶酸、4號(hào)峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號(hào)峰為對(duì)羥基苯甲酸圖5為不用牛血清白蛋白前處理的樣本色譜圖，1號(hào)峰為莽草酸、2號(hào)峰為沒食子酸、3號(hào)峰為原兒茶酸、4號(hào)峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號(hào)峰為對(duì)羥基苯甲酸圖6為用0.3g/L牛血清白蛋白前處理的樣本色譜圖，1號(hào)峰為莽草酸、2號(hào)峰為沒食子酸、3號(hào)峰為原兒茶酸、4號(hào)峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號(hào)峰為對(duì)羥基苯甲酸圖7為用70％甲醇制樣樣本的色譜圖，1號(hào)峰為莽草酸、2號(hào)峰為沒食子酸、3號(hào)峰為原兒茶酸、4號(hào)峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號(hào)峰為對(duì)羥基苯甲酸圖8為用含0.05％磷酸的水溶液制樣樣本的色譜圖，1號(hào)峰為莽草酸、2號(hào)峰為沒食子酸、3號(hào)峰為原兒茶酸、4號(hào)峰為6-羥基犬尿喹啉酸、5號(hào)峰為對(duì)羥基苯甲酸具體實(shí)施方式實(shí)施例1不同純化方法對(duì)有機(jī)酸測(cè)定的影響純化方法1：100mg銀杏葉提取物，用含1g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃超聲提取60min，過濾；濾液用HPD5000大孔樹脂吸附，水洗、10％乙醇洗脫，收集合并吸附殘液、水洗部位和10％乙醇洗脫部位，濃縮干燥，用0.1％磷酸溶解殘?jiān)?，并定容?0ml。純化方法2：100mg銀杏葉提取物，用10mlpH值13的水溶液提取，提取液用濃鹽酸調(diào)pH值至1，再用100ml乙酸乙酯萃取2次。合并兩次乙酸乙酯溶液，濃縮干燥，用0.1％磷酸溶解殘?jiān)?，并定容?0ml。純化方法3：100mg銀杏葉提取物，用10ml水提取，提取液用陰離子交換樹脂吸附，水洗后，用1mol/L氫氧化鈉70％甲醇溶液洗脫，收集洗脫溶液，濃縮干燥，用0.1％磷酸溶解殘?jiān)?，并定容?0ml。色譜條件為：固定相是以辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1％磷酸水溶液；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)0～6min為215nm，6～25min為254nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10ul；流速為1.0ml/min；采用等度洗脫，流動(dòng)相A的體積分?jǐn)?shù)為3.5％，流動(dòng)相B的體積分?jǐn)?shù)為96.5％。結(jié)果見附圖1～4，附圖1為混合對(duì)照品色譜圖，5個(gè)主峰峰型良好，無雜峰干擾；圖2為純化方法1(本發(fā)明方法)制備的樣本色譜圖，5個(gè)主峰峰型良好，無雜峰干擾；圖3為純化方法2制備的樣本色譜圖，1號(hào)峰幾乎沒有，2號(hào)峰有雜峰干擾并且峰面積明顯小于圖2中的2號(hào)峰面積，4號(hào)峰峰面積也明顯減小，說明用純化方法2制備樣本，莽草酸、沒食子酸和6-HKA有損失；圖4為純化方法3制備的樣本色譜圖，1號(hào)峰有雜峰干擾，5號(hào)峰消失，4號(hào)峰面積減小，說明用純化方法2制備樣本，6-HKA和對(duì)羥基苯甲酸有損失。實(shí)施例2銀杏葉提取物中有機(jī)酸類成分的定性和定量取銀杏葉提取物100mg，分別用含1.0g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃超聲提取1h，過濾；濾液濃縮干燥，得有機(jī)酸提取物；有機(jī)酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；續(xù)濾液按實(shí)施例1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。上述方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，包括儀器精密度，重復(fù)性，中間精密度，線性，加樣回收率，耐用性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物中含有莽草酸、沒食子酸、原兒茶酸、6-HKA、對(duì)羥基苯甲酸，不含阿魏酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、咖啡酸、對(duì)香豆酸、香草酸、抗壞血酸、D-葡萄糖醛酸、奎寧酸。由表1～表4結(jié)果說明，本發(fā)明方法可以同時(shí)定量測(cè)定銀杏葉提取物中5種有機(jī)酸的含量，方法學(xué)驗(yàn)證所有指標(biāo)均符合藥典規(guī)定，該方法準(zhǔn)確、可靠。由表5結(jié)果說明，不同批次的銀杏葉提取物均含有莽草酸、沒食子酸、原兒茶酸、6-HKA、對(duì)羥基苯甲酸這5種有機(jī)酸，5種有機(jī)酸總含量約為2.2％～3.0％。表15種有機(jī)酸回歸方程表2加樣回收試驗(yàn)結(jié)果表3精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表510批次銀杏葉提取物有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果批號(hào)莽草酸沒食子酸原兒茶酸6-HKA對(duì)羥基苯甲酸總含量1403280.942％0.103％0.827％0.321％0.092％2.285％1305131.235％0.109％1.135％0.276％0.110％2.865％1502011.057％0.126％0.941％0.283％0.095％2.502％1406210.826％0.104％1.249％0.313％0.105％2.597％1409020.994％0.093％1.472％0.294％0.113％2.966％1401011.026％0.117％0.923％0.300％0.107％2.473％1308120.918％0.101％0.837％0.285％0.102％2.243％1501080.938％0.115％1.540％0.299％0.109％3.001％1310100.947％0.109％1.313％0.306％0.096％2.771％1209220.953％0.124％0.930％0.288％0.117％2.412％實(shí)施例3牛血清白蛋白用量的考察取銀杏葉提取物100mg，分別用含0、0.1、0.3、1.0、3.0、10g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃超聲提取1h，過濾；濾液濃縮干燥，得有機(jī)酸提取物；有機(jī)酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；續(xù)濾液按實(shí)施例1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見附圖2、附圖5和附圖6。附圖2為用1.0g/L牛血清白蛋白前處理的樣本色譜圖，5個(gè)主峰峰型良好，無雜峰干擾，用3.0或10g/L牛血清白蛋白前處理的樣本色譜圖同附圖2。附圖5為不用牛血清白蛋白前處理的樣本色譜圖，1、2、4號(hào)峰有明顯的雜峰干擾；附圖6為用0.3g/L牛血清白蛋白前處理的樣本色譜圖1和2號(hào)峰有明顯的雜峰干擾，用0.1g/L牛血清白蛋白前處理的樣本色譜圖基本同附圖6。說明牛血清白蛋白用量在1.0g/L以上，才能去除1～4號(hào)峰的雜峰干擾。實(shí)施例4提取溶劑量的考察取銀杏葉提取物100mg，分別用5、10、20、50、100ml含1.0g/L牛血清白蛋白的水溶液，50℃超聲提取1h，過濾；濾液濃縮干燥，得有機(jī)酸提取物；有機(jī)酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；續(xù)濾液按實(shí)施例1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。表6結(jié)果說明，提取溶劑量為5ml，仍有部分有機(jī)酸未能提取出來，因此，選擇提取溶劑量為10ml。表6提取溶劑量的考察提取溶劑量(ml)5種有機(jī)酸總含量(％)52.029102.285202.288502.2861002.290實(shí)施例5提取溫度的考察取銀杏葉提取物100mg，用含1.0g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，分別在20、30、40、50、60、70℃超聲提取1h，過濾；濾液濃縮干燥，得有機(jī)酸提取物；有機(jī)酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；續(xù)濾液按實(shí)施例1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。表7結(jié)果說明，提取溫度低于50℃時(shí)，部分有機(jī)酸未能提取出來，因此，選擇提取溫度50℃。表7提取溫度的考察提取溫度(℃)5種有機(jī)酸總含量(％)201.863301.906402.080502.285602.281702.283實(shí)施例6提取時(shí)間的考察取銀杏葉提取物100mg，用含1.0g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃分別超聲提取0.5、1、2h、3h，過濾；濾液濃縮干燥，得有機(jī)酸提取物；有機(jī)酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；續(xù)濾液按實(shí)施例1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。表8結(jié)果說明，提取時(shí)間為0.5h時(shí)，部分有機(jī)酸未能提取出來，因此，選擇提取時(shí)間1h。表8提取時(shí)間的考察提取時(shí)間(h)5種有機(jī)酸總含量(％)0.51.64212.28622.29032.285實(shí)施例7制備供試品溶液的磷酸濃度考察取銀杏葉提取物100mg，用含1.0g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃超聲提取1h，過濾；濾液用HPD5000大孔樹脂吸附，水洗，10％乙醇洗脫，收集合并吸附殘液、水洗部位和10％乙醇洗脫部位，濃縮干燥，得有機(jī)酸提取物；有機(jī)酸提取物分別用70％甲醇、水、含0.05、0.1、0.2、0.4％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，搖勻，濾過，取續(xù)濾液；續(xù)濾液按實(shí)施例1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見附圖2、附圖7和附圖8。附圖2為用含0.1％磷酸的水溶液制樣樣本的色譜圖，5個(gè)主峰峰型良好，無雜峰干擾，用0.2或0.4％磷酸的水溶液制樣樣本的色譜圖同附圖2。附圖7為用70％甲醇制樣樣本的色譜圖，4號(hào)峰有明顯的雜峰干擾；附圖8為用含0.05％磷酸的水溶液制樣樣本的色譜圖，1號(hào)峰有雜峰干擾，用水制樣樣本的色譜圖同附圖8。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3