本發(fā)明涉及微電極生物傳感技術(shù)，具體地說，涉及一種原位活體檢測(cè)植物miRNA的微電極生物傳感器及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物microRNA(miRNA)是一類重要的具有調(diào)控作用的小分子，它是一種非編碼RNA，長(zhǎng)約20～25個(gè)核苷酸。研究結(jié)果表明，miRNA在高等植物中普遍存在。miRNA的靶基因很多都是植物中起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，miRNA通過對(duì)這些靶基因的調(diào)節(jié)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素響應(yīng)、抗逆抗病等多個(gè)方面起到了至關(guān)重要的作用。例如在白菜受蕪菁花葉病毒侵染后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生miR1885，miR1885通過調(diào)控生長(zhǎng)素受體—核苷酸綁定位點(diǎn)—亮氨酸富集區(qū)(TIR-NBS-LRR)類抗病基因介導(dǎo)了白菜抵御病毒侵染的過程。在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)miRNA可以通過阻斷生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，提高植株對(duì)細(xì)菌侵染疾病的抗性。

目前miRNA的檢測(cè)方法主要有高通量測(cè)序、定量PCR等。高通量方法有助于獲得樣本中所有miRNA的總體表達(dá)圖譜，但檢測(cè)過程較為復(fù)雜，并且靈敏度低，難以實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。定量PCR方法靈敏度較高，并且檢測(cè)范圍較寬，但是miRNA樣品的準(zhǔn)備要求較高的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并且需要昂貴的信號(hào)讀出設(shè)備，因此具有一定的局限性?，F(xiàn)有的幾種檢測(cè)方法均為離體取樣，需要損壞植物材料，經(jīng)過復(fù)雜的處理過程提取其中的RNA樣品，樣本處理過程中會(huì)造成RNA樣品的大量丟失。如植物材料較為珍貴，則其損壞會(huì)對(duì)科學(xué)研究造成巨大損失。并且隨著研究的深入，人們希望獲得植物活體內(nèi)這些調(diào)控分子的即時(shí)信息，從而更加準(zhǔn)確、清晰的了解植物的生理變化規(guī)律。而目前還沒有對(duì)植物體內(nèi)miRNA進(jìn)行原位活體檢測(cè)的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種基于生物傳感技術(shù)的植物miRNA的原位活體檢測(cè)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中離體取樣檢測(cè)、處理過程復(fù)雜、對(duì)植物樣本破壞較大等缺陷。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供的一種活體在線檢測(cè)植物miRNA的微電極生物傳感器具有三電極體系，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對(duì)電極，金工作電極，所述金工作電極上電沉積金納米粒子，并修飾有能識(shí)別目標(biāo)miRNA的DNA探針。電極裸露導(dǎo)電部分長(zhǎng)3-10mm。

所述金納米粒子直徑為10-50nm。優(yōu)選金納米粒子直徑為10-30nm。

所述DNA探針是指末端巰基化的DNA探針。用于miRNA識(shí)別的DNA探針序列根據(jù)目標(biāo)miRNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，保證傳感器檢測(cè)的特異性。

修飾方法為滴涂有能識(shí)別目標(biāo)miRNA的DNA探針-亞甲基藍(lán)復(fù)合物。

進(jìn)一步地，所述能識(shí)別目標(biāo)miRNA的DNA探針-亞甲基藍(lán)復(fù)合物的制備方法為：將DNA探針序列放入10^-4-10^-5M的亞甲基藍(lán)溶液中10-20min，形成DNA-亞甲基藍(lán)復(fù)合物。

本發(fā)明將能識(shí)別目標(biāo)miRNA的DNA探針-亞甲基藍(lán)復(fù)合物滴涂到沉積了金納米粒子的金工作電極表面，室溫放置8-16h，固定DNA探針，后用去離子水沖洗掉未吸附的DNA探針分子。

本發(fā)明含有上述金工作電極的微電極生物傳感器的電極外觀具有穿透植物組織的能力，長(zhǎng)度為30-50mm，電極裸露導(dǎo)電部分長(zhǎng)3-10mm。

本發(fā)明提供了上述微電極生物傳感器在原位活體檢測(cè)植物miRNA中的應(yīng)用。

檢測(cè)部位為植物的根、莖、葉或果實(shí)。

所述植物為農(nóng)作物、花卉、蔬菜、林木等。檢測(cè)目標(biāo)材料是植物生長(zhǎng)的不同時(shí)期和不同環(huán)境。

本發(fā)明提供了一種原位活體檢測(cè)植物miRNA的方法，包括：

(1)將上所述微電極生物傳感器連接至電化學(xué)工作站，與不同濃度的目標(biāo)miRNA標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，在工作電壓下通過計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)，利用電化學(xué)脈沖伏安法檢測(cè)雜交前后MB的峰電流值變化，由濃度與電流關(guān)系獲得穩(wěn)定的檢測(cè)目標(biāo)miRNA的工作曲線；

(2)將上述微電極生物傳感器插入待測(cè)植物組織，連接電化學(xué)工作站，利用電化學(xué)脈沖伏安法檢測(cè)雜交前后MB的峰電流值變化，導(dǎo)入工作曲線，計(jì)算被測(cè)樣本內(nèi)的miRNA。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種基于微型生物傳感技術(shù)的植物體內(nèi)miRNA的活體在線監(jiān)測(cè)方法，從而更全面、深入地了解植物體內(nèi)miRNA的調(diào)節(jié)規(guī)律及作用機(jī)制。本發(fā)明通過在工作電極電沉積金納米粒子后，將末端巰基化的能識(shí)別目標(biāo)miRNA的DNA探針放入亞甲基藍(lán)MB溶液中孵育，形成DNA-亞甲基藍(lán)復(fù)合物，再將該復(fù)合物滴涂至沉積了金納米粒子的工作電極表面，得到DNA探針修飾的工作電極。應(yīng)用含有該工作電極的微電極生物傳感器對(duì)活體植物監(jiān)測(cè)，利用電化學(xué)脈沖伏安法檢測(cè)雜交前后MB的峰電流值變化，從而達(dá)到對(duì)microRNA定量檢測(cè)的目的，對(duì)被檢測(cè)樣本不造成本質(zhì)傷害，得到的數(shù)據(jù)結(jié)果可實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確的反映植物體內(nèi)目標(biāo)miRNA的含量變化，實(shí)際應(yīng)用操作簡(jiǎn)便，易于掌握。

附圖說明

圖1為本發(fā)明所述微電極生物傳感器三電極體系外觀結(jié)構(gòu)以及。金工作電極制備示意圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1工作電極的制備

(1)微電極陣列通過微機(jī)電加工技術(shù)(MEMS)制備，包括Ag/AgCl的參比電極，鉑對(duì)電極及金工作電極，微電極長(zhǎng)5cm，其中裸露導(dǎo)電部分長(zhǎng)約3-10mm；將微電極置于0.5M稀硫酸溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描(-0.2～1.6V)得到典型的循環(huán)伏安譜圖，確保電極表面清潔。

(2)在金工作電極上通過電沉積方法沉積直徑為10nm的金納米粒子，以增強(qiáng)傳感器的檢測(cè)靈敏度。

(3)DNA探針序列(5`-ggcatacagggagccaggca-3`)根據(jù)GmMIR160A的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，末端巰基化，以便固定在金工作電極上。將PBS(100mM,pH 7.0)配制好的5μL 50nM末端巰基化的DNA探針序列放入10^-5M的亞甲基藍(lán)溶液中10min，形成DNA-亞甲基藍(lán)復(fù)合物，再將DNA-亞甲基藍(lán)復(fù)合物逐步滴涂到沉積了金納米粒子的工作電極表面，室溫放置16h，固定DNA探針。后用去離子水清洗干凈，得到DNA探針修飾的工作電極，儲(chǔ)存在4℃下。

實(shí)施例2微電極生物傳感器的應(yīng)用

(1)分別配制0、0.01,0.1,0.5,1,5,10μM miRNA的PBS(pH＝7.0)標(biāo)準(zhǔn)溶液，用實(shí)施例1制得的修飾有探針DNA單鏈的微電極與不同濃度的miRNA標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，通過脈沖伏安法檢測(cè)雜交前后MB的峰電流值變化，得到一組濃度與峰電流的關(guān)系曲線，制作miRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線I(μA)＝1.45log c(pM)+3.09(R＝0.9857)。

(2)植物樣本的培養(yǎng)：選擇水培15天的大豆幼苗，設(shè)置對(duì)照組和處理組，用50mM氯化鈉對(duì)其進(jìn)行鹽脅迫處理不同時(shí)間。每個(gè)處理組設(shè)置30個(gè)重復(fù)。

(3)將微電極插入不同處理時(shí)間段(0h，6h,12h,24h,48h)待測(cè)大豆幼苗的嫩莖中，連接電化學(xué)工作站，通過脈沖伏安法記錄不同時(shí)間段鹽脅迫處理后大豆幼苗嫩莖中的GmMIR160A的即時(shí)濃度。通過將電流值代入工作曲線，求得待測(cè)樣品的即時(shí)GmMIR160A濃度。

(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比

切取微電極檢測(cè)部位的部分組織進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(所用上下游引物序列分別為5`-CTCATCGAAGCATCAAT-3`；5`-CGCCATCCACAAAGGTCAT-3`)，與傳感器檢測(cè)的即時(shí)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，如下表所示。結(jié)果表明該微電極傳感檢測(cè)的結(jié)果在48h內(nèi)的變化趨勢(shì)與定量PCR的趨勢(shì)一致，但結(jié)果更為準(zhǔn)確，并且反應(yīng)了植物活體內(nèi)的即時(shí)miRNA濃度，結(jié)果更加可靠。

表1測(cè)試結(jié)果對(duì)比

對(duì)比例1

(1)微電極先進(jìn)行清潔處理，然后將PBS(100mM,pH 7.0)配制好的5μL 50nM末端巰基化的DNA探針序列放入10^-5M的亞甲基藍(lán)溶液中10min，形成DNA-亞甲基藍(lán)復(fù)合物，再將DNA-亞甲基藍(lán)復(fù)合物逐步滴涂到工作電極表面(不沉積金納米粒子)，室溫放置16h，后用去離子水清洗干凈，得到DNA探針修飾的工作電極，儲(chǔ)存在4℃下。

(2)用制備的微電極與不同濃度的miRNA標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，通過脈沖伏安法檢測(cè)雜交前后MB的峰電流值變化，得到一組濃度與峰電流的關(guān)系曲線，制作miRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線為I(μA)＝0.815log c(pM)+4.21(R＝0.9822)，與本發(fā)明制備的傳感器相比，靈敏度降低。

(3)選擇水培15天的大豆幼苗，將微電極插入50mM氯化鈉鹽脅迫處理不同時(shí)間段(0h，6h)待測(cè)大豆幼苗的嫩莖中，連接電化學(xué)工作站，通過脈沖伏安法記錄不同時(shí)間段鹽脅迫處理后大豆幼苗嫩莖中的GmMIR160A的即時(shí)濃度。通過將電流值代入工作曲線，求得待測(cè)樣品的即時(shí)GmMIR160A濃度，檢測(cè)值偏低，并與PCR結(jié)果偏差較大。

表2測(cè)試結(jié)果對(duì)比

對(duì)比例2

(1)微電極清潔好后，在金工作電極上通過電沉積方法沉積直徑為200nm的金納米粒子，以增強(qiáng)傳感器的檢測(cè)靈敏度。

(2)將PBS(100mM,pH 7.0)配制好的5μL 50nM末端巰基化的DNA探針序列放入10^-5M的亞甲基藍(lán)溶液中10min，形成DNA-亞甲基藍(lán)復(fù)合物，再將DNA-亞甲基藍(lán)復(fù)合物逐步滴涂到沉積了200nm金納米粒子的工作電極表面，室溫放置16h，后用去離子水清洗干凈，得到DNA探針修飾的工作電極，儲(chǔ)存在4℃下。

(3)用制備的微電極與不同濃度的miRNA標(biāo)準(zhǔn)溶液反應(yīng)，通過脈沖伏安法檢測(cè)雜交前后MB的峰電流值變化，得到一組濃度與峰電流的關(guān)系曲線，制作miRNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線為I(μA)＝1.106log c(pM)+5.89(R＝0.9885)，與本發(fā)明制備的傳感器相比，靈敏度降低。

(4)選擇水培15天的大豆幼苗，將微電極插入50mM氯化鈉鹽脅迫處理不同時(shí)間段(0h，6h)待測(cè)大豆幼苗的嫩莖中，連接電化學(xué)工作站，通過脈沖伏安法記錄不同時(shí)間段鹽脅迫處理后大豆幼苗嫩莖中的GmMIR160A的即時(shí)濃度。通過將電流值代入工作曲線，求得待測(cè)樣品的即時(shí)GmMIR160A濃度，檢測(cè)值偏低，并與PCR結(jié)果偏差較大。

表3測(cè)試結(jié)果對(duì)比

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110> 北京農(nóng)業(yè)信息技術(shù)研究中心

<120> 一種原位活體檢測(cè)植物miRNA的微電極生物傳感器及其應(yīng)用

<130> KHP161116906.4

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcatacagg gagccaggca 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctcatcgaag catcaat 17

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgccatccac aaaggtcat 19