本發(fā)明涉及基于老年癡呆癥的尿液代謝標志物鑒定方法。

背景技術(shù)：

老年性癡呆(AD)是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD不僅嚴重影響人類的身體健康和生活質(zhì)量，同時也給患者家庭和社會帶來沉重負擔。AD是一種復雜性疾病，其發(fā)生發(fā)展是一種連續(xù)的病理生理過程，由于其發(fā)病的不可逆性，AD基礎(chǔ)和臨床研究的窗口應該前移，因此對AD早期的發(fā)生發(fā)展機制、早期診斷和早期干預就尤為重要。目前，AD的診斷標準主要包括量表的簡易精神狀態(tài)評價量表(MMSE)測試，以及amyloid-β的神經(jīng)元成像。開心散是中醫(yī)益智、安神定驚、治療健忘的基本方，具有養(yǎng)心、益智、益氣、安神定志和祛痰之功效，主要用于治療心氣不足，神志不寧，健忘失眠，心怯怔忡等證，是治療癡呆的經(jīng)典方劑?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果證明，開心散四味藥材均能在不同程度上起到益智的作用，開心散對AD的治療有多靶點、多方位的優(yōu)勢，但開心散治療AD的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制仍然不清楚。反映藥物作用效果的生物標志物尚未闡明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有老年癡呆癥的尿液代謝標志物無法準確鑒定的缺點，而提出一種基于老年癡呆癥的尿液代謝標志物鑒定方法。

一種基于老年癡呆癥的尿液代謝標志物鑒定方法具體過程為：

步驟一、老年癡呆大鼠模型的建立及評價；

步驟二、利用生物標記物評價開心散對AD大鼠模型建立不同階段的干預作用。

本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明對開心散干預AD的機制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進行評價。以氯化鋁聯(lián)合D-半乳糖誘導老年性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)大鼠模型及開心散為研究對象，運用UPLC-MS技術(shù)和代謝組學方法分析AD發(fā)生發(fā)展的潛在代謝生物標記物以及基于生物標記物評價開心散對AD大鼠模型不同階段干預作用。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)，經(jīng)純化后的樣品在液相色譜和質(zhì)譜部分進行分離和離子化，經(jīng)由檢測器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用利用了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補，結(jié)合了色譜對復雜樣品的高分離能力和質(zhì)譜的高選擇性，高靈敏度及能夠提供相對分子量和結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點。它對化合物的結(jié)構(gòu)破壞性很小，因而，適合生物分子和有機分子的分離。與其他分析方法相比，質(zhì)譜具有更高的靈敏度。因為質(zhì)譜和色譜靈敏度基本相同，質(zhì)譜的進樣系統(tǒng)可以用分離效果很好的色譜來實現(xiàn)，質(zhì)譜作為色譜的鑒定儀也有分離好，速度快，應用廣等優(yōu)點。

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有高分離度，可快速分離能的LC與高靈敏度的MS或是MS結(jié)合，即可定性也可定量。超高效液相色譜技術(shù)的快速發(fā)展，其優(yōu)勢更加得以凸顯，樣品分析時間大大縮短，從小時縮短為數(shù)分鐘。同時超高效液相使用比傳統(tǒng)液相更小的粒徑，可達到獲得更好的分離效果。在質(zhì)譜方面，本實驗所選用的G2-Si質(zhì)譜借助高效T-Wave離子淌度技術(shù)，可提供高水平的選擇性、特異性和靈敏度。這些技術(shù)的發(fā)展，助推代謝組學技術(shù)平臺向更高的靈敏度、高通量及高分辨率方向發(fā)展。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)可直接分析尿液樣本、需要除去蛋白的血液樣本、組織樣本、或是直接檢測腦脊液樣本，可適用于中等及弱極性樣本的分離。將液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應用于老年癡呆的研究中，利用其能發(fā)現(xiàn)差異標記物并追溯其相關(guān)標記物信息，描述代謝產(chǎn)物在疾病發(fā)生發(fā)展中的變化，從小分子代謝產(chǎn)物終端闡 釋疾病病理生理學機制，有助于AD生物標記物的發(fā)現(xiàn)。

附圖說明

圖1a為AD大鼠模型Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果圖；與空白對照組比較，^*P<0.05，^**P<0.01；

圖1b為AD模型大鼠Morris水迷宮空間搜索實驗結(jié)果圖；；與空白對照組比較，^*P<0.05，^**P<0.01；

圖2a為空白對照組(模型復制第91天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果(×40)圖；

圖2b為AD大鼠模型第1組(模型復制第16天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果(×40)圖；

圖2c為AD大鼠模型第2組(模型復制第46天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果(×40)圖；

圖2d為AD大鼠模型第3組(模型復制第61天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果(×40)圖；

圖2e為AD大鼠模型第4組(模型復制第91天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果(×40)圖；

圖3a為空白對照組(模型復制第91天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果(×100)圖；

圖3b為AD大鼠模型第1組(模型復制第16天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果(×100)圖；

圖3c為AD大鼠模型第2組(模型復制第46天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果(×100)圖；

圖3d為AD大鼠模型第3組(模型復制第61天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果(×100)圖；

圖3e為AD大鼠模型第4組(模型復制第91天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)HE染色結(jié)果(×100)圖；

圖4a為空白對照組(模型復制第91天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)Aβ_1-40免疫組化結(jié)果(×100)圖；

圖4b為AD大鼠模型第1組(模型復制第16天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)Aβ_1-40免疫組化結(jié)果(×100)圖；

圖4c為AD大鼠模型第2組(模型復制第46天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)Aβ_1-40免疫組化結(jié)果(×100)圖；

圖4d為AD大鼠模型第3組(模型復制第61天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)Aβ_1-40免疫組化結(jié)果(×100)圖；

圖4e為AD大鼠模型第4組(模型復制第91天)大鼠腦組織海馬CA3區(qū)Aβ_1-40免疫組化結(jié)果(×100)圖；

圖5a為空白對照組(模型復制第91天)大鼠腦組織皮層Aβ_1-40免疫組化結(jié)果(×100)圖；

圖5b為AD大鼠模型第1組(模型復制第16天)大鼠腦組織皮層Aβ_1-40免疫組化結(jié)果(×100)圖；

圖5c為AD大鼠模型第2組(模型復制第46天)大鼠腦組織皮層Aβ_1-40免疫組化結(jié)果(×100)圖；

圖5d為AD大鼠模型第3組(模型復制第61天)大鼠腦組織皮層Aβ_1-40免疫組化結(jié)果(×100)圖；

圖5e為AD大鼠模型第4組(模型復制第91天)大鼠腦組織皮層Aβ_1-40免疫組化結(jié) 果(×100)圖；

圖6為大鼠腦組織免疫組化測得Aβ_1-40蛋白表達含量(與空白對照組比較，^*P<0.05， ^**P<0.01)結(jié)果圖；

圖7為AD模型復制過程中各組大鼠血清中T-SOD水平(^*P<0.05，^**P<0.01,與空白組比較)結(jié)果圖；

圖8為AD模型復制過程中各組大鼠腦組織中T-SOD水平(^*P<0.05，^**P<0.01,與空白組比較)結(jié)果圖；

圖9為AD模型復制過程中各組大鼠血清中GSH-PX活力(^*P<0.05，^**P<0.01，與空白組比較)結(jié)果圖；

圖10為AD模型復制過程中各組大鼠腦組織中GSH-PX活力(^*P<0.05，^**P<0.01，與空白組比較)結(jié)果圖；

圖11為AD模型復制過程中各組大鼠血清中MDA水平(^*P<0.05，^**P<0.01，與空白組比較)結(jié)果圖；

圖12為AD模型復制過程中各組大鼠腦組織中MDA水平(*P<0.05，**P<0.01，與空白組比較)結(jié)果圖；

圖13為AD模型復制過程中各組大鼠血清中IL-6水平(*P<0.05，**P<0.01，與空白組比較)

圖14為AD大鼠模型復制過程中各組大鼠腦組織中IL-6水平(^*P<0.05，^**P<0.01，與空白組比較)結(jié)果圖。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的一種基于老年癡呆癥的尿液代謝標志物鑒定方法具體過程為：

步驟一、老年癡呆大鼠模型的建立及評價；

步驟一一、利用腹腔注射D-半乳糖聯(lián)合灌胃三氯化鋁誘導大鼠，建立AD大鼠模型；

步驟一二、利用行為學、組織病理學及臨床生化指標評價AD大鼠模型的建立過程；

步驟二、利用生物標記物評價開心散對AD大鼠模型建立不同階段的干預作用；

步驟二一、制備開心散凍干粉和開心散灌胃溶液，得到體內(nèi)含有開心散的大鼠；

步驟二二、對空白組大鼠和D大鼠模型進行分組及設(shè)計；

取9周齡雄性Wistar大鼠100只(體重260±20g)，適應環(huán)境一周，先將動物進行Morris水迷宮初篩，通過初篩，去除先天癡呆(潛伏期平均值>50s)和游泳姿勢不良者，將合格大鼠隨機分為空白對照組10只，AD大鼠模型組1-4組各10只，開心散干預組(人體等效12倍量，5.4g/kg)1-4組各10只。

AD大鼠模型組和干預組于每天下午2：00按1.2.3項下復制AD大鼠模型，空白對照組每天給予等量生理鹽水；空白對照組于實驗第85d，AD模型1-4組、開心散干預組1-4組分別于實驗第10d，40d，55d，85d，進行6天行為學評價(Morris水迷宮)。

AD大鼠模型的復制具體過程為：

大鼠灌胃給予氯化鋁(aluminum chloride，AlCl₃)(28mg/kg/day)，同時腹腔注射D-半乳糖(D-galactose，D-gal)(63mg/kg/day)，共90天；

步驟二三、根據(jù)步驟二二對空白組大鼠和AD大鼠模型進行尿液樣品采集及前處理，得到濾液；

步驟二四、對步驟二三得到的濾液經(jīng)UPLC-MS分析處理，鑒定潛在的生物標記物；

步驟二五、對步驟二四鑒定的潛在生物標記物進行潛在生物標記物的篩選、鑒定及開心散對AD大鼠模型建立不同階段大鼠尿液生物標記物的影響。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：所述步驟一一中利用腹腔注射D-半乳糖聯(lián)合灌胃三氯化鋁誘導大鼠，建立AD大鼠模型；具體過程為：

實驗動物

Wistar大鼠，雄性，9周齡，體重260±20g，由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。室溫飼養(yǎng)，動物自由攝食飲水。

1.1實驗方法

1.1.1實驗分組及設(shè)計；Wistar大鼠70只，適應環(huán)境一周，先將動物進行Morris水迷宮初篩，去除先天癡呆(潛伏期平均值>50s)和游泳姿勢不良者，將合格大鼠隨機分為空白對照組10只，AD模型1-4組(M 1-4)各10只。AD模型組于每天下午2：00按1.1.2項下復制AD大鼠模型，空白對照組每天給予等量生理鹽水。

1.1.2AD大鼠模型的建立；大鼠灌胃給予氯化鋁(aluminumchloride，AlCl3)(28mg/kg/day)，同時腹腔注射D-半乳糖(D-galactose，D-gal)(63mg/kg/day)，共90天。

Morris水迷宮結(jié)果顯示，從實驗的第90天之后，AD大鼠模型逃避潛伏期時間延長及穿越平臺次數(shù)減少，與空白對照大鼠相比具有顯著性差異；HE染色及免疫組化結(jié)果顯示，模型大鼠腦組織神經(jīng)元細胞減少，壞死神經(jīng)元增多并出現(xiàn)Aβ_1-40陽性反應的棕黃色斑塊；臨床生化指標顯示，模型大鼠血清中的T-SOD水平在第16天、第46天、第61天成極顯著性上升趨勢，第91天產(chǎn)生了極顯著下降；在腦組織中T-SOD含量呈下降趨勢。與空白組大鼠相比，模型組血清中的GSH-PX含量顯著上升；腦組織中GSH-PX含量明顯下降。模型組大鼠的血清及腦中的IL-6含量與空白對照組大鼠相比均顯著上升。

綜合上述評價指標，說明利用灌胃氯化鋁聯(lián)合腹腔注射D-半乳糖的方法誘導大鼠，使AD大鼠模型逐漸出現(xiàn)的學習認知能力下降，腦組織神經(jīng)元受損，Aβ陽性斑塊氧化應激損傷及炎癥反應，與人類老年癡呆的病理特征相似。并明確誘導大鼠第15天大鼠進入輕度認知障礙前期(pre-MCI期)，誘導大鼠第45天大鼠進入輕度認知障礙期(MCI期)，造模第60天進入輕度認知障礙中期(MCI中期)，誘導大鼠第90天大鼠進入癡呆期(AD)，得到AD大鼠模型；

大鼠為Wistar大鼠，雄性，9周齡，體重260±20g，由黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。室溫飼養(yǎng)，動物自由攝食飲水。

所述步驟一二中利用行為學、組織病理學及臨床生化指標評價AD大鼠模型的建立過程；具體過程為：

a)根據(jù)Morris水迷宮行為學對AD大鼠模型的建立過程進行評價：

所述Morris水迷宮實驗用來評價大鼠(實驗動物)的空間學習記憶能力，通過實驗大鼠(動物)學習在水中尋找隱藏平臺并分析其(大鼠)尋找平臺所用時間來判斷其(大鼠)記憶功能的好壞，其中定位航行實驗中得到的逃避潛伏期(即大鼠從入水到找到平臺的時間)值與學習記憶能力成反比；而空間搜索實驗中，穿越平臺的次數(shù)與學習記憶能力成正比；

1)定位航行實驗；與空白組大鼠相比，AD大鼠模型各組大鼠在定位航行實驗的逃避潛伏期時間均有延長，但模型第4組(M 4)大鼠的逃避潛伏期時間顯著延長，5天訓練中其中第1天、第4天和第5天AD模型有顯著性差異(P<0.05)，第2天和第3天 AD模型有極顯著性差異(P<0.01)；而AD模型第1組(M 1)僅在訓練第3天有顯著性差異(P<0.05)，AD模型第2、3組(M 2、M 3)僅在訓練第4天有顯著性差異(P<0.05)，具體結(jié)果見圖1a；

2)空間搜索實驗；在最后一天(90天)撤去水中隱藏平臺的空間搜索實驗中，與空白對照組相比，各模型組大鼠穿越平臺的次數(shù)均有所降低，但AD模型第4組大鼠穿越平臺次數(shù)顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義，結(jié)果有顯著差異(P<0.05)，而模型第1、2、3組的結(jié)果并無顯著差異(P>0.05)，具體結(jié)果見圖1b；

提示腹腔注射D-gal聯(lián)合灌胃AlCl₃影響了模型大鼠的學習記憶能力，其毒性長期累積造成了模型大鼠認知功能障礙加劇，以第90天達到最大；

b)腦組織病理學結(jié)果

1)腦組織HE染色結(jié)果；結(jié)果顯示：空白對照組(Control；圖2a，圖3a)大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細胞排列緊密，形態(tài)規(guī)則，層次清晰，數(shù)量較多；細胞體大而飽滿，核仁清晰。AD模型1-4組大鼠隨著造模的進程，腦組織海馬區(qū)逐漸出現(xiàn)病變情況。與空白對照組相比，模型1組(M 1；圖2b，圖3b)即AD大鼠模型建立的第16天的AD大鼠模型大鼠腦組織神經(jīng)元變化并不明顯；AD大鼠模型建立的第46天(M 2；圖2c，圖3c)大鼠腦組織開始出現(xiàn)神經(jīng)元細胞數(shù)量明顯減少，細胞排列松散，胞間出現(xiàn)空隙；造模第61天(M3；圖2d，圖3d)可見海馬CA3區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元大量丟失；AD大鼠模型建立的第91天(M4；圖2e，圖3e)大鼠腦組織神經(jīng)元細胞核呈現(xiàn)固縮狀，胞漿深紫，核膜胞膜界限模糊。

2)腦組織Aβ_1-40免疫組化結(jié)果；免疫組化結(jié)果顯示：空白對照組(Control；圖4a，圖5a)大鼠腦組織皮層及海馬區(qū)Aβ_1-40反應呈陰性，AD模型1組即造模第16天大鼠腦組織中開始出現(xiàn)Aβ_1-40陽性反應的棕黃色斑塊，陽性反應物多聚集在神經(jīng)元胞體，未見較大的陽性斑塊積聚。由圖4a、4b、4c、4d、4e，圖5a、5b、5c、5d、5e可見各模型組大鼠腦組織Aβ_1-40陽性表達的棕黃色逐漸增多，以第91天斑塊變化差異最明顯。對Aβ_1-40蛋白的相對含量(陽性目標面密度)進行統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，隨著模型的復制進程，AD模型1-4組大鼠腦組織Aβ_1-40蛋白相對含量逐漸增加，第16天(M 1)大鼠腦組織中已出現(xiàn)與正常組差異顯著的Aβ_1-40蛋白累積，至造模的第91天(M 4)達到最多；各AD模型組的統(tǒng)計學數(shù)據(jù)與空白組相比，差異具有顯著性(圖6)。

提示腹腔注射D-gal聯(lián)合灌胃AlCl₃造成了模型大鼠腦組織神經(jīng)元的損傷，腦內(nèi)Aβ沉積加劇，逐漸表現(xiàn)出AD的腦內(nèi)病理樣變。

c)臨床化學指標評價結(jié)果

1)氧化損傷相關(guān)指標含量的測定；氧化應激損傷被認為是AD發(fā)展的一個重要因素，氧化應激來源于自由基的過度積累。自由基能導致神經(jīng)元過氧化損傷，引起神經(jīng)元內(nèi)Aβ的聚集，過量的沉積加劇神經(jīng)元的損傷，導致神經(jīng)細胞退行性變而發(fā)生AD^[i][ii]。機體在正常狀態(tài)下有一個由酶組成的抗氧化防御系統(tǒng)，幫助清除氧自由基而防止氧化損傷^[iii]。谷 胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和超氧化物岐化酶(SOD)就是氧自由基清除劑。所以對機體內(nèi)GSH-PX以及SOD的含量進行測試可以間接反映機體清除自由基的能力。氧自由基會攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，在生物膜質(zhì)中發(fā)生的氧自由基鏈式反應，會損害生物膜及其功能，以致形成細胞透明性病變、纖維化，大面積細胞損傷造成神經(jīng)、組織、器官等損傷，引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應，并形成脂質(zhì)過氧化物，而丙二醛(MDA)就是脂質(zhì)過氧化反應的終產(chǎn)物。故對機體內(nèi)MDA的含量進行測試可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的程度^[iv]。

與空白組比較，模型組血清中第16天、第46天、第61天的T-SOD水平成極顯著性上升趨勢(P<0.01)，第91天產(chǎn)生了極顯著下降(P<0.01)，見圖7；而腦組織中T-SOD含量在整個造模過程中呈下降趨勢，見圖8。與空白組比較，模型組血清中第16天、第46天、第61天和第91天的GSH-PX呈高水平表達(P<0.01)，見圖9；腦組織中GSH-PX含量則處于下降趨勢，在第91天具有顯著性差異(P<0.05)，見圖10。推測其可能的原因，T-SOD與GSH-PX主要分布于肝臟和血液中，腹腔注射D-半乳糖在體內(nèi)產(chǎn)生氧化應激時，血液中反饋性上調(diào)T-SOD及GSH-PX水平以減少氧化損傷。而腦中可能分布較少，所以并未有反饋性上調(diào)現(xiàn)象。與空白組比較，MDA在整個造模過程中則一直處于高水平表達，尤其在腦組織中各個階段都有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，見圖11，圖12。以上結(jié)果提示氯化鋁與D-半乳糖聯(lián)合刺激造成體內(nèi)氧自由基清除能力下降，表明了機體受到了造模導致的氧化應激損傷。

2)炎癥相關(guān)指標含量的測定；炎性反應也是AD的病因之一^[v]，AD患者腦中的病理特點之一為膠質(zhì)細胞介導的炎性反應，膠質(zhì)細胞經(jīng)Aβ刺激后，會誘導促炎因子的合成和分泌，而白細胞介素6(IL-6)就是一種促炎因子^[vi]。也就是說機體內(nèi)IL-6水平的上升，表明著炎性反應的發(fā)生。

與空白組相比，模型組血清中IL-6含量具有明顯上升趨勢，差異具有顯著性(P<0.05)，見圖13；腦中IL-6水平在模型復制早期如第16天和第46天升高明顯(P<0.01)，但隨著時間延長有降低趨勢，見圖14。以上結(jié)果提示氯化鋁與D-半乳糖聯(lián)合刺激造成機體炎癥反應發(fā)生，表明了機體受到了造模導致的炎癥反應損傷。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一或二不同的是：所述步驟二一中制備開心散凍干粉和開心散灌胃溶液，得到體內(nèi)含有開心散的大鼠；具體過程為：

步驟二一一、開心散凍干粉的制備；

按原方比例，即藥材粗粉按質(zhì)量份數(shù)比為：人參：茯苓：遠志：石菖蒲＝3:3:2:2，稱取500g藥材粗粉，混勻，用6倍量的質(zhì)量濃度為70％乙醇加熱回流提取2次，每次2h，合并濾液，濃縮，并用冷凍干燥法干燥，得疏松粉末，密封置于干燥器中備用并計算出粉率，出粉率為23.4％；以4粒準1g計算，每人每天給生藥量21粒＝5g/天，大鼠等倍給藥量為5g×0.018/0.2kg＝0.45g/kg；

步驟二一二、開心散灌胃溶液的制備；

取開心散凍干粉適量，溶于適量蒸餾水中，配制成生藥濃度為0.54g/mL(開心散干預組)的開心散灌胃溶液，大鼠灌胃10mL/kg體重。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至五之一相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一至三之一不同的是：所述步驟二三中根據(jù)步驟二二對空白組大鼠和AD大鼠模型進行尿液樣品采集及前處理，得到濾液；具體過程為：

實驗開始后，于AD大鼠模型復制第15天(M 1)、第45天(M 2)、第60天(M 3)、第90天(M 4)晚8:00將AD大鼠模型和空白組大鼠于置于大鼠代謝籠中，次日早8:00 收集夜尿；

對收集得到的尿液樣品于4℃，13000rpm離心15min后取上層清液，蒸餾水稀釋一倍，混懸振蕩30s后，0.22μm微孔濾膜過濾，得到濾液。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至三之一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一至四之一不同的是：所述步驟二四中對步驟二三得到的濾液經(jīng)UPLC-MS分析處理，鑒定潛在的生物標記物；具體過程為：

濾液經(jīng)UPLC-MS分析得到代謝指紋圖譜，代謝指紋圖譜數(shù)據(jù)采用Waters QI軟件進行預處理，如色譜峰提取、峰對齊及歸一化等。進行多變量分析前對每個檢測峰的離子強度進行標準化處理，然后將峰面積、樣品名稱和離子強度組成的數(shù)據(jù)導入EZinfo 2.0進行多維模式識別分析，包括PCA和OPLS-DA等，鑒定潛在的生物標記物；

AD大鼠模型建立過程第15天尿液中共鑒定出35個潛在的生物標記物；第45天尿液中共鑒定出48個潛在的生物標記物；第60天尿液中共鑒定出40個潛在的生物標記物；第90天尿液中共鑒定出42個潛在的生物標記物；其中，第15天及45天重疊標記物10個，15天與60天重疊標記物3個，15天與90天重疊標記物8個，45天與60天共重疊標記物13個，45天與90天重疊標記物16個，60天與90天重疊標記物11個，順-4-癸烯酸為從AD大鼠模型建立的起始階段就出現(xiàn)直至癡呆期的標記物。如表1、表2、表3、表4；

所述UPLC-MS為超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；

表1 AD模型大鼠復制第15天尿液中潛在生物標記物的具體信息表

注：“↑↓”在模型中代謝水平上升或下降

表2 AD模型大鼠第45天尿液中潛在生物標記物的具體信息表

注：“↑↓”在模型中代謝水平上升或下降。

表3 AD模型大鼠第60天尿液中潛在生物標記物的具體信息表

注：“↑↓”在模型中代謝水平上升或下降。

表4 AD模型大鼠第90天尿液中潛在生物標記物的具體信息表

注：“↑↓”在模型中代謝水平上升或下降。

色譜分析條件為：

色譜儀：Acquity^TM UPLC液相色譜儀(四元梯度泵-在線真空脫氣機-自動進樣器-二極管陣列檢測器-柱溫箱)；色譜柱：ACQUITYUPLC^TM HSS T3column(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm)(Waters集團公司，美國)；流動相：流動相A為0.1％甲酸乙腈，流動相B為0.1％ 甲酸水；柱溫預設(shè)：45℃；樣品倉溫度預設(shè)：4℃；流速：0.4mL/min；進樣體積：2μL；色譜儀流出液不經(jīng)分流直接注入質(zhì)譜儀進行正負離子掃描分析；梯度洗脫程序見表5。

表5超高效液相梯度洗脫條件

流動相A:0.1％甲酸乙腈；流動相B:0.1％甲酸水

質(zhì)譜分析條件

正離子掃描模式：電噴霧離子源(ESI)：采用Synapt^TM G2-Si質(zhì)譜分析系統(tǒng)(高分辨四級桿串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀)；脫溶劑氣流量：800L/h；脫溶劑氣溫度：450℃；錐孔反吹氣流量：50L/h；離子源溫度：110℃；錐孔電壓：20V；毛細管電壓：3.0kV；鎖定質(zhì)量溶液：采用美國Waters公司Lockspray校正系統(tǒng)進行在線質(zhì)量校正，亮氨酸-腦啡肽(leueine-enkephalin，[M+H]+＝556.2771)，溶液濃度為1ng/μL，流速為5μL/min；質(zhì)量掃描范圍：m/z 50-1000Da，掃描時間0.2s；以centriod模式進行數(shù)據(jù)采集；工作站：MassLynx V4.1工作站。

負離子掃描模式：脫溶劑氣流量：800L/h；脫溶劑氣溫度：450℃；錐孔反吹氣流量：50L/h；離子源溫度：110℃；錐孔電壓：20V；毛細管電壓：3.0kV；鎖定質(zhì)量溶液：采用美國Waters公司Lockspray校正系統(tǒng)進行在線質(zhì)量校正，亮氨酸-腦啡肽(leueine-enkephalin，[M-H]-＝554.2771)，溶液濃度為1ng/μL，流速為5μL/min；其余參數(shù)條件同正離子掃描模式。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至四之一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一至五之一不同的是：所述步驟二五中對步驟二四鑒定的潛在生物標記物進行潛在生物標記物的篩選、鑒定及開心散對AD大鼠模型建立不同階段大鼠尿液生物標記物的影響；

步驟二五一、篩選出潛在生物標記物；

為了找到對代謝輪廓變化起關(guān)鍵性作用的內(nèi)源性代謝物，進一步對各不同時期AD模型組大鼠與空白組大鼠尿液代謝輪廓數(shù)據(jù)進行OPLS-DA分析，并獲得能夠直觀反映對代謝輪廓軌跡變化貢獻率的S-Plot以及VIP-Plot；PCA分析一般用來初步分析各組樣品間的總體分布狀況及是否有離群樣本存在，而配對偏最小二乘判別分析(Orthonal Partial Least Square-Discriminate Analysis,OPLS-DA)則進一步放大了組間差異，使得相關(guān)信息更為集中地表現(xiàn)在第一主成分上。在VIP散點圖中，離子碎片呈V型排列，頂端離子(VIP值大)，對代謝輪廓軌跡產(chǎn)生變化的貢獻率大。在S-Plot圖中，距離原點越遠的離子對代謝輪廓軌跡產(chǎn)生變化的貢獻度越大，越有可能是潛在的特征代謝物。同時對各組所獲得信息數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，比較AD模型組和空白組各離子含量差別是否具有統(tǒng)計學意義， 基于P<0.05作為篩查條件，并利用其在引起組內(nèi)聚類和組間分離的貢獻度VIP值來作為其在疾病發(fā)展過程中的重要程度的評價因子，篩選出這些差異離子(P<0.05)作為潛在生物標記物集合；

AD造模過程第15天尿液中共鑒定出35個潛在的生物標記物；第45天尿液中共鑒定出48個潛在的生物標記物；第60天尿液中共鑒定出40個潛在的生物標記物；第90天尿液中共鑒定出42個潛在的生物標記物。其中，第15天及45天重疊標記物10個，15天與60天重疊標記物3個，15天與90天重疊標記物8個，45天與60天共重疊標記物13個，45天與90天重疊標記物16個，60天與90天重疊標記物11個，順-4-癸烯酸(cis-4-Decenoic acid)為從AD的起始階段就出現(xiàn)直至癡呆期的標記物。

步驟二五二、對潛在生物標記物進行鑒定；

對潛在的生物標記物，利用Progenesis QI軟件峰提取(Peak picking)過程中得到的保留時間(RT)和質(zhì)核比(m/z)數(shù)據(jù)，結(jié)合軟件中化合物鑒定功能(Indentify compounds)與代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(HMDB：http://www.hmdb.ca/)搜索，對這些差異離子(P<0.05)進行初步確認；再通過UPLC-MS/MS技術(shù)對潛在的離子在一定碰撞能下進行二級數(shù)據(jù)掃描，獲得二級質(zhì)譜信息，最終通過碎片信息及其可能的裂解方式進行匹配，或結(jié)合文獻報道，鑒定或表征各潛在生物標記物；

步驟二五三、根據(jù)步驟二五一和步驟二五二確定開心散對AD大鼠模型建立不同階段大鼠尿液生物標記物的影響。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至五之一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一至六之一不同的是：所述步驟二五三中根據(jù)步驟二五一和步驟二五二確定開心散對AD大鼠模型建立不同階段大鼠尿液生物標記物的影響；具體過程為：

根據(jù)以上步驟，AD大鼠模型建立過程第15天(輕度認知障礙前期)尿液中共鑒定出35個潛在的生物標記物，與空白組比較，標記物含量顯著上升的20個，含量顯著下降的15個；

AD大鼠模型建立過程第45天(輕度認知障礙期)尿液中共鑒定出48個潛在的生物標記物，與空白組比較，標記物含量顯著上升的21個，含量顯著下降的27個；

AD大鼠模型建立過程第60天(輕度認知障礙中期)尿液中共鑒定出40個潛在的生物標記物，與空白組比較，標記物含量顯著上升的22個，含量顯著下降的18個；

AD大鼠模型建立過程第90天(癡呆期)尿液中共鑒定出42個潛在的生物標記物，與空白組比較，標記物含量顯著上升的18個，含量顯著下降的24個；

開心散對AD大鼠模型建立的第15天大鼠尿液生物標記物的影響的過程為：

在D-gal聯(lián)合AlCl₃誘導的AD大鼠模型建立過程第15天尿液的35個潛在的生物標記物中，開心散對其中31個具有調(diào)節(jié)作用，7個具有統(tǒng)計學意義，包括3-甲基二氧吲哚(3-Methyldioxyindole)，蘇氨脯氨酸(Threoninyl-Proline)，N-乙?；?4-O-乙酰神經(jīng)氨酸(N-Acetyl-4-O-acetylneuraminic acid)，咪唑丙酸(Imidazolepropionic acid)，3-羥癸二酸(3-Hydroxysebacic acid)，色氨酸(L-Tryptophan)，甲硫蛋氨酸(Methionyl-Methionine)；見表6。

表6開心散干預AD模型復制第15天大鼠尿液潛在生物標志物回調(diào)趨勢表

注：↑↓Maker相對含量在模型組中上升或者下降趨勢；+or-藥物回調(diào)或者沒有回調(diào)作用；與模型組比較，^#P<0.05，^##P<0.01。

開心散對AD大鼠模型建立的第45天大鼠尿液生物標記物的影響的過程為：

模型復制過程第45天(輕度認知障礙期)尿液中共鑒定出48個潛在的生物標記物，開心散對其中34個具有調(diào)節(jié)作用，21個具有統(tǒng)計學意義，包括甲酰鄰氨基苯甲酸(Formylanthranilic acid)，十二碳二元酸(Dodecanedioic acid)，2-甲基馬尿酸(2-Methylhippuric acid)，異高香草酸(Isohomovanillic acid)，5-甲氧色醇(5-Methoxytryptophol)，褪黑素(Melatonin)，香草丙酮酸(Vanilpyruvic acid)，4-羥基-5-(苯基)-戊酸-O-葡萄糖苷酸(4-Hydroxy-5-(phenyl)-valeric acid-O-glucuronide)，鄰苯三酚-2-O-葡萄糖苷酸(Pyrogallol-2-O-glucuronide)，高檸檬酸(Homocitric acid)，二甲基精氨酸(Dimethyl-L-arginine)，3,4-二羥基苯基乙醛(3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyde)，酪氨酸(L-Tyrosine)，肉堿(L-Carnitine)，酪氨酸胺(Tyrosinamide)，5-羥色醇 (5-Hydroxytryptophol)，4-(2-氨基苯基)-2，4-二氧丁酸(4-(2-Aminophenyl)-2,4-dioxobutanoic acid)，犬尿胺(Kynuramine)，犬尿酸(Kynurenic acid)，2-羥癸酸(2-Hydroxydecanedioic acid)，色氨酸(L-Tryptophan)；見表7。

表7開心散干預AD模型復制第45天大鼠尿液潛在生物標志物回調(diào)趨勢表

Table 7Trend ofAD urine potential biomarkers called back after KXS administration on 45th day

注：↑↓Maker相對含量在模型組中上升或者下降趨勢；+or-藥物回調(diào)或者沒有回調(diào)作用；與模型組比較，^#P<0.05，^##P<0.01。

開心散對AD大鼠模型建立第60天大鼠尿液生物標記物的影響；

模型復制過程第60天(輕度認知障礙中期)尿液中共鑒定出40個潛在的生物標記物，開心散對其中29個具有調(diào)節(jié)作用，9個具有統(tǒng)計學意義，包括3,4-二羥苯基乙醛(3,4-Dihydroxyphenylacetaldehyde)，4,6-二羥基喹啉(4,6-Dihydroxyquinoline)，羥脯氨?；?異亮氨酸(Hydroxyprolyl-Isoleucine)，2-辛烯酸(2-Octenoic acid)，(9s,10s)-10-羥-9-(膦羧氧基)十八碳酯((9S,10S)-10-hydroxy-9-(phosphonooxy)octadecanoate)，二甲基精氨酸(Dimethyl-L-arginine)，4-羧苯基甘氨酸(4-Carboxyphenylglycine)，丙二酰肉堿(Malonylcarnitine)，3-甲氧基酪氨酸(3-Methoxytyrosine)。見表8。

表8開心散干預AD模型復制第60天大鼠尿液潛在生物標志物回調(diào)趨勢表

注：↑↓Maker相對含量在模型組中上升或者下降趨勢；+or-藥物回調(diào)或者沒有回調(diào)作用；與模型組比較，^#P<0.05，^##P<0.01。

開心散對AD大鼠模型建立第90天大鼠尿液生物標記物的影響；

AD模型復制過程第90天(癡呆期)尿液中共鑒定出42個潛在的生物標記物，開心散對其中22個具有調(diào)節(jié)作用，7個具有統(tǒng)計學意義，包括羥脯氨?；M氨酸(Hydroxyprolyl-Histidine)，2-異丙基蘋果酸(2-Isopropylmalic acid)，4,6-二羥喹啉(4,6-Dihydroxyquinoline)，十二烷二酸(Dodecanedioic acid)，3-甲基二氧吲哚(3-Methyldioxyindole)，2-辛烯酸(2-Octenoic acid)，腎上腺乙醇酰胺(Adrenoyl ethanolamide)。見表9。

表9開心散干預AD模型復制第90天大鼠尿液潛在生物標志物回調(diào)趨勢表

注：↑↓Maker相對含量在模型組中上升或者下降趨勢；+or-藥物回調(diào)或者沒有回調(diào)作用；與模型組比較，^#P<0.05，^##P<0.01。

分析開心散對各階段標記物的調(diào)節(jié)情況，其中第15天及45天重疊標記物6個，15天與60天重疊標記物3個，15天與90天重疊標記物5個，45天與60天共重疊標記物10個，45天與90天重疊標記物5個，60天與90天重疊標記物6個。

其它步驟及參數(shù)與具體實施方式一至六之一相同。