本發(fā)明涉及顯微鏡載物片的制備領(lǐng)域，具體涉及一種精子電鏡標(biāo)本的制片方法。

背景技術(shù)：

由于電鏡產(chǎn)生的電子束穿透能力很弱，必須把標(biāo)本切成厚度小于0.1μm以下的薄片才適用，這樣的薄片稱為超薄切片，常用的超薄切片厚度是50-70nm。而超薄切片技術(shù)是制備超薄切片最常用、最基本的制備技術(shù)。其制作過(guò)程基本需要經(jīng)過(guò)取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片和染色等步驟。

實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了降低不可控因素的干擾，通常是針對(duì)性的對(duì)觀察目標(biāo)進(jìn)行處理，避免夾雜其它干擾因素。例如，在雄性生殖能力的實(shí)驗(yàn)研究中，經(jīng)常需要制作精子的電鏡標(biāo)本，也需要使用超薄切片技術(shù)，目前常規(guī)的制作方法是將精子從附睪中取出，然后用PBS液沖洗，離心，棄掉上清液，然后將離心后的精子用戊二醛固定，最后于電鏡室制作標(biāo)本，用于超微機(jī)構(gòu)的觀察。但是該法存在較大缺陷，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)將觀察目標(biāo)精子直接從附睪中取出，精子暴露在外，且電鏡標(biāo)本制作過(guò)程中需要多種液體對(duì)固定好的樣本進(jìn)行沖洗，這必然導(dǎo)致精子樣本被沖散，則會(huì)使得精子樣本量不足夠多，最后將不能成功制作電鏡標(biāo)本，這樣的情況出現(xiàn)時(shí)，需要重新制片，加大了工作量，還導(dǎo)致制片過(guò)程中使用到的原料的浪費(fèi)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種精子電鏡標(biāo)本的制片方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)制備精子標(biāo)本過(guò)程中，精子暴露在外容易被試劑沖散，導(dǎo)致制片失敗的技術(shù)問(wèn)題。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供如下基礎(chǔ)技術(shù)方案：一種精子電鏡標(biāo)本的制片方法，包括以下步驟：

a、從經(jīng)過(guò)滅菌處理的實(shí)驗(yàn)鼠中分離附睪，并將附睪從實(shí)驗(yàn)鼠的腹部取出，使用PBS液清洗，至液體清澈，無(wú)血液殘留，將附睪剪短，保留附睪尾，將其置于濃度為2.5%的戊二醛中浸泡；

b、將步驟c處理后的附睪尾置于3～5℃的環(huán)境下放置20～26h后，制作電鏡標(biāo)本即可。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明突破現(xiàn)有常規(guī)技術(shù)操作方法，直接采用附睪組織來(lái)觀察精子，這樣一來(lái)省去了使用離心將精子從附睪中取出的步驟，最終制備的標(biāo)本是附睪尾和精子的結(jié)合，精子不直接暴露在附睪外，附睪尾對(duì)精子的移動(dòng)進(jìn)行限制，在使用PBS液清洗時(shí)，PBS液更多的是接觸到附睪，最終經(jīng)過(guò)戊二醛浸泡固定，這樣避免精子直接接觸到制片過(guò)程中使用的試劑，進(jìn)而大大降低了精子被試劑沖散的可能，提高了制片的成功率，避免制片過(guò)程中使用到的各種原料的浪費(fèi)，還提高了工作效率。本方案和現(xiàn)有技術(shù)相比，還無(wú)需將精子從附睪中取出，進(jìn)而也就不需要離心操作，減少了工作環(huán)節(jié)，操作簡(jiǎn)單易行。

進(jìn)一步，作為對(duì)基礎(chǔ)方案的優(yōu)化方案一：步驟a中附睪尾在戊二醛中浸泡的時(shí)間為1～2h。使用戊二醛浸泡附睪尾的目的是盡可能使細(xì)胞中的各種細(xì)胞器以及大分子結(jié)構(gòu)保持生活狀態(tài)，并且牢固地固定在它們?cè)瓉?lái)所在的位置上，有助于電鏡觀察。而為了達(dá)到更好的固定效果，本方案通過(guò)實(shí)踐證明將附睪尾浸泡1～2h的固定效果最佳，基本無(wú)細(xì)胞離散和失活的現(xiàn)象發(fā)生。

進(jìn)一步，作為對(duì)基礎(chǔ)方案和優(yōu)化方案一的優(yōu)化：步驟b中將保留下的附睪尾修成1mm×1mm×2mm大小長(zhǎng)條形。因?yàn)槲於┑臐B透能力較弱，如果修整后的附睪尾太大，則附睪尾的內(nèi)部將不能得到良好的浸泡固定。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)一步說(shuō)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件和步驟的實(shí)驗(yàn)方法，按照本領(lǐng)域的常規(guī)方法和條件操作。

實(shí)施例1：

一種精子電鏡標(biāo)本的制片方法，包括以下步驟：

a、通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段使實(shí)驗(yàn)鼠窒息，將實(shí)驗(yàn)鼠用濃度為75%的酒精浸泡滅菌后，在實(shí)驗(yàn)鼠的腹部剪開(kāi)一道V形切口，使附睪暴露；分離附睪，并將附睪從實(shí)驗(yàn)鼠的腹部取出，使用PBS液清洗，至液體清澈，無(wú)血液殘留，將附睪剪短，保留附睪尾，將其置于濃度為2.5%的戊二醛中浸泡2h；

b、將步驟a處理后的附睪尾置于5℃的環(huán)境下放置26h后，修成1mm×1mm×2mm大小長(zhǎng)條形電鏡標(biāo)本即可進(jìn)行電鏡觀察。

實(shí)施例2：

一種精子電鏡標(biāo)本的制片方法，包括以下步驟：

a、通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段使實(shí)驗(yàn)鼠窒息，將實(shí)驗(yàn)鼠用濃度為75%的酒精浸泡滅菌后，在實(shí)驗(yàn)鼠的腹部剪開(kāi)一道V形切口，使附睪暴露；分離附睪，并將附睪從實(shí)驗(yàn)鼠的腹部取出，使用PBS液清洗，至液體清澈，無(wú)血液殘留，將附睪剪短，保留附睪尾，將其置于濃度為2.5%的戊二醛中浸泡1.5h；

b、將步驟a處理后的附睪尾置于4℃的環(huán)境下放置24h后，修成1mm×1mm×2mm大小長(zhǎng)條形電鏡標(biāo)本即可進(jìn)行電鏡觀察。

實(shí)施例3：

一種精子電鏡標(biāo)本的制片方法，包括以下步驟：

a、通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段使實(shí)驗(yàn)鼠窒息，將實(shí)驗(yàn)鼠用濃度為75%的酒精浸泡滅菌后，在實(shí)驗(yàn)鼠的腹部剪開(kāi)一道V形切口，使附睪暴露；分離附睪，并將附睪從實(shí)驗(yàn)鼠的腹部取出，使用PBS液清洗，至液體清澈，無(wú)血液殘留，將附睪剪短，保留附睪尾，將其置于濃度為2.5%的戊二醛中浸泡1h；

b、將步驟a處理后的附睪尾置于3℃的環(huán)境下放置20h后，修成1mm×1mm×2mm大小長(zhǎng)條形電鏡標(biāo)本即可進(jìn)行電鏡觀察。

對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明結(jié)構(gòu)的前提下，還可以作出若干變形和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍，這些都不會(huì)影響本發(fā)明實(shí)施的效果和專利的實(shí)用性。