本發(fā)明涉及檢測技術領域，具體涉及動物固體排泄物中克倫特羅的測定方法。

背景技術：

克倫特羅是一種β-腎上腺素能受體激動劑類化合物(以下簡稱：β-受體激動劑)，在人醫(yī)臨床上常被用作平喘藥物，用于調節(jié)支氣管擴張和平滑肌松弛，治療呼吸系統(tǒng)疾病。由于對動物具有一定的促進生長、提高瘦肉率的作用，而被稱之為“瘦肉精”。農(nóng)業(yè)部176號和1519號公告明確規(guī)定的禁止在養(yǎng)殖動物上使用克倫特羅，但仍有不法分子受利益驅使非法使用克倫特羅，國內(nèi)外屢屢發(fā)生以克倫特羅為代表的“瘦肉精”中毒事件。為保障人民群眾身體健康，對“瘦肉精”類藥物非法使用的監(jiān)管非常重要。

現(xiàn)有的養(yǎng)殖家畜尿樣中中克倫特羅的提取、凈化方法主要參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準(農(nóng)業(yè)部1063號-3-2008文件)執(zhí)行，現(xiàn)行農(nóng)業(yè)部標準及各地地方標準中暫時只有動物尿液中β-受體激動劑的檢測標準，沒有動物固體排泄物中相關物質的測定方法。

并且對于樣品的前處理方法主要以固相萃取、液液萃取為主，處理相對來說比較復雜，有機溶液殘留量較高。

技術實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術中缺陷，本發(fā)明提供一種動物固體排泄物中克倫特羅的測定方法，該方法操作時間短、重復性好、靈敏度高。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種動物固體排泄物中克倫特羅的測定方法，所述測定方法包括如下步驟：

(1)首先對待測樣品進行前處理，具體處理過程如下：

A.配制不同濃度的標準品溶液：首先制備標準儲備液，準確稱取適量克倫特羅標準品，用甲醇配制成濃度為100μg/L的標準儲備液，保存于18℃冰箱中；其次同位素內(nèi)標儲備溶液制備，內(nèi)標物克倫特羅-D5用甲醇配制成濃度為100μg/L的標準儲備液，保存于18℃冰箱中；然后將標準儲備液用甲醇配制成濃度分別為0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的標準品溶液備用；

B.提取

稱取3g精確至0.01g的待測樣品置于50mL離心管中，加入100ng/mL克倫特羅內(nèi)標溶液150μL，在加標回收樣品中另加入100ng/mL克倫特羅標準溶液75μL，再加入1％醋酸乙腈溶液15mL，渦旋混勻5min，超聲提取15min，再渦旋混勻5min后在轉速為4000r/min離心機中離心5min；

C.凈化

將離心后得到的上清液全部轉移到準備好的凈化管(凈化管中加入馬弗爐烘過干燥的無水硫酸鈉、C₁₈、PSA)中，渦旋混勻5min，在轉速為4000r/min離心機中離心5min，用移液槍準確吸取5mL上清液移入10mL離心管中，然后將離心管放入40℃水浴中氮氣吹干；

D.復溶

向吹干的離心管中加入0.5mL定溶液，超聲處理30s后再渦旋混勻5min，過0.22μm復合濾膜，于進樣小瓶中準備上機；所述定溶液為含0.1％甲酸的10％甲醇水溶液；其中含0.1％甲酸的10％甲醇水溶液均為體積比，具體為取1mL甲酸，100mL甲醇然后用水定容到1000mL即可。

(2)然后采用高效液相色譜串聯(lián)質譜法對待測樣品定性和定量檢測：

A、取5.0μL待測樣品溶液進樣，用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀分析檢測，得到待測樣品溶液中克倫特羅和克倫特羅內(nèi)標的定量離子色譜峰面積；

B、將步驟(1)配制的不同濃度的克倫特羅標準品溶液，用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀分析檢測，檢測條件與待測樣品溶液相同，獲得標準品溶液中克倫特羅和克倫特羅內(nèi)標的定量離子色譜峰面積；

C、以克倫特羅和克倫特羅內(nèi)標的定量離子峰面積之比為縱坐標，以標準品溶液中克倫特羅濃度為橫坐標制作樣液中克倫特羅濃度標準曲線；

D、根據(jù)待測樣品提取液中克倫特羅和克倫特羅內(nèi)標的定量離子峰面積，結合標準曲線，計算得到待測樣品提取液中克倫特羅的濃度C，以此進行定量測定，以定性離子色譜峰面積與定量離子色譜峰面積比值(相對離子豐度)在30-70％之間，進行定性確認；其中待測樣品提取液中克倫特羅的濃度C的計算公式為：

其中：

C為待測樣品提取液中克倫特羅的含量，單位為ng/mL；

c為標準溶液中克倫特羅的濃度，單位為ng/mL；

c_si為標準溶液中克倫特羅內(nèi)標的濃度，單位為ng/mL；

c_i待測樣品提取液中克倫特羅內(nèi)標的濃度，單位為ng/mL；

A為待測樣品提取液中克倫特羅定量離子的色譜峰面積；

A_s為標準中克倫特羅定量離子的色譜峰面積；

A_si為標準中克倫特羅內(nèi)標的定量離子的色譜峰面積；

A_i為待測樣品提取液中克倫特羅內(nèi)標的定量離子的色譜峰面積；

其中所述高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀分析檢測的具體條件如下：

B.進樣條件：采用C₁₈色譜柱(所述C₁₈色譜柱采用安捷倫ZORBAX快速分辨率高清色譜柱；規(guī)格為內(nèi)徑3.0mm，柱長100mm，粒度1.8μm)，以乙腈為流動相A，以含0.1％甲酸的5mM乙酸銨水溶液為流動相B，梯度洗脫，流速為0.4mL/min，柱溫為30℃，結束時間為10min，進樣量為5μL；

B.質譜/質譜條件：

離子化模式：電噴霧電離正離子模式

掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)

噴射電壓：4000V

△-電磁碰撞：200V

霧化器壓力：40psi

干燥氣流量：10L/min

干燥氣溫度：325℃。

優(yōu)選地，C₁₈色譜柱采用安捷倫ZORBAX快速分辨率高清色譜柱；規(guī)格為內(nèi)徑3.0mm，柱長100mm，粒度1.8μm。

優(yōu)選地，流動相A：乙腈，流動相B：0.1％甲酸的5mM乙酸銨水溶液。

優(yōu)選地，所述梯度洗脫的具體條件為(見表1)：

表1梯度洗脫的具體條件

優(yōu)選地，定量離子對為277.2/203.1，定性離子對為277.2/259.1。

其中，上述待測樣品為克倫特羅的判定方法為：待測樣品和克倫特羅標準品保留時間相同，在相同的定量離子對為277.2/203.1，定性離子對為277.2/259.1條件下，兩者的定量離子對和定性離子對相對豐度比值在30％-70％之間，判定為待測樣品為克倫特羅。

本發(fā)明的有益效果為：

本方法無需酶解過夜，前處理方便快捷，回收率穩(wěn)定，可準確測定動物排泄物中的克倫特羅含量。

附圖說明

圖1為標準品溶液中克倫特羅和克倫特羅內(nèi)標的總離子流圖；

圖2是標準品溶液中克倫特羅和克倫特羅內(nèi)標的定量離子色譜峰圖；

圖3是待測樣品溶液中克倫特羅和克倫特羅內(nèi)標的定量離子色譜峰圖；

圖4是標準品溶液中克倫特羅標準曲線；

圖5是標準品克倫特羅定性離子色譜圖(含相對離子豐度)。

具體實施方式

下面將參照附圖更詳細地描述本發(fā)明的具體實施例。雖然附圖中顯示了本發(fā)明的具體實施例，然而應當理解，可以以各種形式實現(xiàn)本發(fā)明而不應被這里闡述的實施例所限制。相反，提供這些實施例是為了能夠更透徹地理解本發(fā)明，并且能夠將本發(fā)明的范圍完整的傳達給本領域的技術人員。

如在通篇說明書及權利要求當中所提及的“包含”或“包括”為一開放式用語，故應解釋成“包含但不限定于”。說明書后續(xù)描述為實施本發(fā)明的較佳實施方式，然所述描述乃以說明書的一般原則為目的，并非用以限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的保護范圍當視所附權利要求所界定者為準。

一、所選用的試劑

1、克倫特羅標準溶液

2、克倫特羅內(nèi)標溶液

3、1％醋酸乙腈溶液

4、0.1％甲酸的10％甲醇水

5、乙腈

6、乙酸銨

7、0.1％甲酸

二、所使用的儀器

1、離心管，2、超聲振蕩器，3、離心機：SIGMA 3K15，4、凈化管，5、移液槍、6、水浴池，7、安捷倫ZORBAX快速分辨率高清色譜柱、8、高效液相色譜-四級桿飛行時間串聯(lián)質譜儀9、十萬分之一天平：METTER TOLEDO XS205，10、萬分之一天平：METTER TOLEDO ME204E，PSA Agela，C18Agela，11、0.22μm有機濾膜Agela。

三、試驗

1、克倫特羅標準溶液的制備：首先制備標準儲備液，準確稱取克倫特羅標準品，用甲醇配制成濃度為100μg/L的標準儲備液，保存于18℃冰箱中；用甲醇配制成100ng/mL備用；將標準儲備液用甲醇配制成濃度分別為0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的標準品溶液備用。

2、克倫特羅內(nèi)標溶液的制備：同位素內(nèi)標儲備溶液制備，內(nèi)標物克倫特羅-D5用甲醇配制成濃度為100μg/L的標準儲備液，保存于18℃冰箱中；然后用甲醇配制成100ng/mL備用。

3、對待測樣品進行前處理，具體處理過程如下：

A.提取

稱取3g精確至0.01g的待測樣品置于50mL離心管中，加入100ng/mL克倫特羅內(nèi)標溶液150μL，在加標回收樣品中另加入100ng/mL克倫特羅標準溶液75μL，再加入1％醋酸乙腈溶液15mL，渦旋混勻5min，超聲提取15min，再渦旋混勻5min后在轉速為4000r/min離心機中離心5min；

B.凈化

將離心后得到的上清液全部轉移到準備好的凈化管(馬弗爐烘過的無水硫酸鈉、C₁₈、PSA)中，渦旋混勻5min，在轉速為4000r/min離心機中離心5min，用移液槍準確吸取5mL上清液移入10mL離心管中，然后將離心管放入40℃水浴中氮氣吹干；

C.復溶

向吹干的離心管中加入0.5mL定溶液，超聲處理30s后再渦旋混勻5min，過0.22μm復合濾膜，于進樣小瓶中準備上機；所述定溶液為含0.1％甲酸的10％甲醇水；

3、采用高效液相色譜串聯(lián)質譜法對待測樣品定性和定量檢測：高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀分析檢測的具體測定條件如下：

A.進樣條件：采用C₁₈色譜柱(所述C₁₈色譜柱采用安捷倫ZORBAX快速分辨率高清色譜柱；規(guī)格為內(nèi)徑3.0mm，柱長100mm，粒度1.8μm)，以乙腈為流動相A，以0.1％甲酸的5mM乙酸銨水溶液為流動相B，梯度洗脫(條件見表1)，流速為0.4mL/min，柱溫為30℃，結束時間為10min，進樣量為5μL；

B.質譜/質譜條件：

離子化模式：電噴霧電離正離子模式

掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)

噴射電壓：4000V

△-電磁碰撞：200V

霧化器壓力：40psi

干燥氣流量：10L/min

干燥氣溫度：325℃。

C、克倫特羅檢測離子對及其相應的碰撞能量見表2。

表2克倫特羅監(jiān)測離子對及其相應的碰撞能量

待測樣品定性和定量檢測：

A、將配制的不同濃度的克倫特羅標準品溶液，用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀分析檢測，檢測條件與待測樣品溶液相同，獲得標準品溶液中克倫特羅和克倫特羅內(nèi)標的總離子流圖(見圖1)，及定量離子色譜峰(見圖2)；

B、取5.0μL待測樣品溶液進樣，用高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀分析檢測，待測樣品溶液中克倫特羅和克倫特羅內(nèi)標的定量離子色譜峰(見圖3)；

C、采用定量軟件，以克倫特羅和克倫特羅內(nèi)標的定量離子峰面積之比為縱坐標，以標準品溶液中克倫特羅濃度為橫坐標制作樣液中克倫特羅濃度標準曲線(見圖4)；

D、根據(jù)待測樣品提取液中克倫特羅和克倫特羅內(nèi)標的定量離子峰面積，結合標準曲線，計算得到待測樣品提取液中克倫特羅的濃度C，以此進行定量測定，以定性離子色譜峰面積與定量離子色譜峰面積比值(相對離子豐度)為53.8％在30-70％之間(見圖5)，進行定性確認；其中待測樣品提取液中克倫特羅的濃度C的計算公式為：

其中：

C為待測樣品提取液中克倫特羅的含量，單位為ng/mL；

c為標準溶液中克倫特羅的濃度，單位為ng/mL；

c_si為標準溶液中克倫特羅內(nèi)標的濃度，單位為ng/mL；

c_i待測樣品提取液中克倫特羅內(nèi)標的濃度，單位為ng/mL；

A為待測樣品提取液中克倫特羅定量離子的色譜峰面積；

A_s為標準中克倫特羅定量離子的色譜峰面積；

A_si為標準中克倫特羅內(nèi)標的定量離子的色譜峰面積；

A_i為待測樣品提取液中克倫特羅內(nèi)標的定量離子的色譜峰面積；

當待測樣品和克倫特羅標準品保留時間相同，在相同的定量離子對為277.2/203.1，定性離子對為277.2/259.1條件下，兩者的定量離子對和定性離子對相對豐度比值在30-70％之間，判定為待測樣品為克倫特羅。

四、試驗結論

通過對該方法進行多次測試，對于不同基質的分辨樣品該方法檢出限可達到0.5μg/kg；回收率可達到80-120％之間，重復測定回收率相對穩(wěn)定?？梢暂^為準確地快速測定動物固體排泄物中克倫特羅的含量。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明實質內(nèi)容上所作的任何修改、等同替換和簡單改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。