本發(fā)明涉及涼茶植物飲料質(zhì)量控制
技術領域：
，特別是涉及一種HPLC-MS-MS測定王老吉涼茶成分含量的方法。
背景技術：
：嶺南涼茶文化擁有悠久的歷史積蘊和民俗內(nèi)涵。古時嶺南為百越之地，多瘴氣，染者無有不死。嶺南人民在與惡劣自然環(huán)境的不斷抗爭中，積累了調(diào)理保健、防病治病的寶貴經(jīng)驗。他們根據(jù)本地的氣候、水土特性，以一些具有清熱解毒、生津止渴、祛火除濕等功效的嶺南特色中草藥為基礎，在中醫(yī)養(yǎng)生理論指導下經(jīng)過長期實踐，創(chuàng)造出各種各樣的″涼茶″，用于防病治病，形成了一條嶺南文化的獨特風景線。王老吉涼茶是歷史最早的廣東涼茶，始創(chuàng)于1828年(清道光八年)，至今已有180多年歷史，被公認為涼茶始祖，有″藥茶王″之稱。最近幾十年，隨著現(xiàn)代化生產(chǎn)設備和先進管理理念的引入，涼茶業(yè)發(fā)生了大變革，過去守著涼茶鋪喝涼茶的局面被打破，涼茶被加工成飲用更方便的顆粒劑、袋泡茶、利樂包、罐裝等多種規(guī)格。王老吉涼茶以水、白砂糖、仙草、蛋花、菊花、夏枯草、甘草、金銀花、布渣葉為原料，經(jīng)提取、濃縮、配制、滅菌、包裝等主要加工工藝制成，其口感清涼爽口，冷熱飲用皆宜，受到消費者的喜愛。為全面的反映及監(jiān)測該品種的內(nèi)在質(zhì)量，促進該品種的發(fā)展，應開展該品種中各成分檢測方法的研究。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種HPLC-MS-MS測定王老吉涼茶成分含量的方法，用以對王老吉涼茶的質(zhì)量進行監(jiān)測，能夠?qū)ζ渲械亩喾N成分進行定量檢測，實現(xiàn)全面保證王老吉涼茶質(zhì)量的目的。一種HPLC-MS-MS測定王老吉涼茶成分含量的方法，包括以下步驟：供試品溶液的制備：取供試品，溶解定容后過微孔濾膜，制得供試品溶液；對照品溶液的制備：精密稱取水仙苷、原兒茶醛、川續(xù)斷皂苷乙、咖啡酸、綠原酸、甘草苷、異綠原酸A、原兒茶酸、三葉豆苷、迷迭香酸、山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、蘆丁、和咖啡酰雞蛋花苷對照品中的至少一種，以有機溶劑溶解定容，制得對照品溶液；檢測：將上述供試品溶液和對照品溶液分別注入液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中，對王老吉涼茶中成分進行定量檢測。上述HPLC-MS-MS測定王老吉涼茶成分含量的方法，通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術，可同時測定王老吉涼茶中多種成分的含量，從而以對王老吉涼茶的質(zhì)量進行監(jiān)測，實現(xiàn)全面保證王老吉涼茶質(zhì)量的目的。在其中一個實施例中，所述檢測步驟中，所述質(zhì)譜為三重四極桿型質(zhì)譜。采用三重四極桿型質(zhì)譜，具有串級功能，不但具有較強的定性能力，在測試中可用做確認檢測的手段，還具有非常好的定量能力，信噪比較佳。在其中一個實施例中，所述檢測步驟中，按照下述質(zhì)譜條件進行檢測：離子化方式：電噴霧離子化；檢出模式：多反應監(jiān)測方式，負離子模式；毛細管電壓：3200-3800V；噴嘴電壓：450-550V；霧化氣體、干燥氣體、和鞘氣氣體：氮氣；干燥氣體溫度：250-350℃；干燥氣流：4-6L/min；霧化氣壓：40-50psi；鞘氣溫度：300-400℃；鞘氣流速：9-13L/min。采用上述質(zhì)譜條件，能夠提高樣品離子化效率，進一步提高信噪比，進而提高檢測靈敏度和穩(wěn)定性。在其中一個實施例中，所述檢測步驟中，按照下述質(zhì)譜條件進行檢測：離子化方式：電噴霧離子化；檢出模式：多反應監(jiān)測方式，負離子模式；毛細管電壓：3500V；噴嘴電壓：500V；霧化氣體、干燥氣體、和鞘氣氣體：氮氣；干燥氣體溫度：300℃；干燥氣流：5L/min；霧化氣壓：45psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11L/min。采用上述質(zhì)譜條件，能夠使樣品具有最佳的離子化效率，在其中一個實施例中，所述檢測步驟中，水仙苷的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為623.0±0.5m/z，子離子為315.1±0.5m/z，碎裂電壓為268V，碰撞能量為29V；原兒茶醛的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為137.0±0.5m/z，子離子為108.0±0.5m/z，碎裂電壓為112V，碰撞能量為25V；川續(xù)斷皂苷乙的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為1074.0±0.5m/z，子離子為749.4±0.5m/z，碎裂電壓為354V，碰撞能量為29V；咖啡酸的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為179.0±0.5m/z，子離子為135.1±0.5m/z，碎裂電壓為81V，碰撞能量為13V；綠原酸的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為353.0±0.5m/z，子離子為191.0±0.5m/z，碎裂電壓為77V，碰撞能量為9V；甘草苷的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為417.0±0.5m/z，子離子為255.1±0.5m/z，碎裂電壓為147V，碰撞能量為17V；異綠原酸A的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為515.0±0.5m/z，子離子為353.0±0.5m/z，碎裂電壓為143V，碰撞能量為9V；原兒茶酸的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為153.0±0.5m/z，子離子為109.1±0.5m/z，碎裂電壓為76V，碰撞能量為13V；三葉豆苷的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為447.0±0.5m/z，子離子為284.1±0.5m/z，碎裂電壓為226V，碰撞能量為25V；迷迭香酸的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為359.0±0.5m/z，子離子為161.0±0.5m/z，碎裂電壓為148V，碰撞能量為9V；山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為593.0m/z±0.5，子離子為285.1±0.5m/z，碎裂電壓為266V，碰撞能量為29V；蘆丁的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為609.0±0.5m/z，子離子為300.1±0.5m/z，碎裂電壓為261V，碰撞能量為37V；咖啡酰雞蛋花苷的質(zhì)譜多反應監(jiān)測的分析條件為：母離子為763.0±0.5m/z，子離子為213.0±0.5m/z，碎裂電壓為285V，碰撞能量為29V。以上述條件對各成分進行多反應監(jiān)測，所獲得的離子對具有信噪比高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點，能夠準確反映王老吉涼茶中各成分的含量。在其中一個實施例中，所述檢測步驟中，按照下述液相色譜條件進行檢測：固定相：碳十八烷基硅烷基鍵合硅膠為填料的色譜柱；流動相：體積百分比濃度為0.1％的甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，采用梯度洗脫方式；流速：0.2-0.3mL/min。以上述色譜條件進行分離、檢測，能夠?qū)⑼趵霞獩霾柚卸喾N成分很好的分離，使各成分具有較好的分離度，利于后序的檢測和鑒定。在其中一個實施例中，所述檢測步驟中，按照下述液相色譜條件進行檢測：進樣量：5μL；固定相：填料粒徑為2.7μm，直徑、長度分別為3.0mm和50mm的AglientPoroshell120EC-C18色譜柱；流動相：體積百分比濃度為0.1％的甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，洗脫梯度為：0-3min，流動相B的體積百分數(shù)為由13％變化至25％；3-7min，流動相B的體積百分數(shù)為25％；7-8min，流動相B的體積百分數(shù)為由25％變化至40％；8-12min，流動相B的體積百分數(shù)為由40％變化至54％；12-16min，流動相B的體積百分數(shù)為13％；柱溫：20-30℃；流速：0.25mL/min。以上述色譜條件進行分離、檢測，具有最佳的分離效果。在其中一個實施例中，所述對照品溶液的制備步驟中，將各對照品以甲醇溶解定容，制得混合對照品溶液，其中，水仙苷的濃度為0.15-0.25μg/ml、原兒茶醛的濃度為0.6-0.8μg/ml、川續(xù)斷皂苷乙的濃度為0.15-0.25μg/ml、咖啡酸的濃度為0.3-0.5μg/ml、綠原酸的濃度為2.0-3.0μg/ml、甘草苷的濃度為8-12μg/ml、異綠原酸A的濃度為5-7μg/ml、原兒茶酸的濃度為1.5-2.5μg/ml、三葉豆苷的濃度為1.5-2.5μg/ml、迷迭香酸的濃度為1.5-2.5μg/ml、山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷的濃度為12-20μg/ml、蘆丁的濃度為8-12μg/ml、咖啡酰雞蛋花苷的濃度為1.2-1.5μg/ml。將對照品溶液的濃度限定在該范圍內(nèi)，與供試品溶液中各成分的濃度相適應，具有較好的參照性。在其中一個實施例中，所述供試品溶液的制備步驟中，取王老吉涼茶，以體積百分含量為10-60％的甲醇稀釋4-6倍，過0.22μm微孔濾膜，即得。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的一種HPLC-MS-MS測定王老吉涼茶成分含量的方法，通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術，可同時測定王老吉涼茶中水仙苷、原兒茶醛、川續(xù)斷皂苷乙、咖啡酸、綠原酸、甘草苷、異綠原酸A、原兒茶酸、三葉豆苷、迷迭香酸、山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、蘆丁、和咖啡酰雞蛋花苷等多種成分的含量，從而對王老吉涼茶的質(zhì)量進行監(jiān)測，實現(xiàn)全面保證王老吉涼茶質(zhì)量的目的。并且，為王老吉涼茶譜效學的研究奠定了基礎。并且，該檢測方法還對其中的液相條件和質(zhì)譜條件進行了優(yōu)化，能夠?qū)⑼趵霞獩霾柚卸喾N成分很好的分離，使各成分具有較好的分離度和靈敏度，并且選取了能夠準確反映王老吉涼茶中各成分的含量的離子對和子離子碎裂碰撞條件，進一步提高了定量檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。附圖說明圖1為實施例1中混合對照品的總離子流圖；圖2為實施例1中王老吉涼茶的總離子流圖；圖3A-圖3B為實施例1中各對照品的提取離子流圖；圖4A-圖4B為實施例1中王老吉涼茶中各目標化合物的提取離子流圖。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。以下給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發(fā)明的
技術領域：
的技術人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。以下實施例中的儀器與試藥如下：儀器：Agilent1260HPLC高效液相色譜儀，配備二元梯度泵(1260BinPump，G1312B)；自動進樣器(1260HipALS，G1367E)；柱溫箱(1260TCC，G1316A)；Agilent6460三重四極桿HPLC-MS-MS儀，Chemstation在線工作站；AgilentPoroshell120EC-C18快速分離型高效液相色譜柱(3.0×50mm，2.7μm)；SI-114型電子天平(丹佛儀器有限公司，北京)。試藥：王老吉涼茶，配方所用藥材、王老吉涼茶陰性樣品均由王老吉藥業(yè)股份有限公司提供；川續(xù)斷皂苷乙、咖啡酰雞蛋花苷、水仙苷、蘆丁、山奈酚-3-O-β-D葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(以下簡稱山奈酚糖苷)、異綠原酸A、三葉豆苷、甘草苷、迷迭香酸、綠原酸、咖啡酸、原兒茶酸和原兒茶醛等對照品均為實驗室自制，所有對照品經(jīng)HPLC面積歸一化法檢測，純度均高于98％；甲醇和乙腈為色譜純(默克)；甲酸為分析純(廣州化學試劑廠)；實驗用水為超純水。實施例1一種HPLC-MS-MS測定王老吉涼茶成分含量的方法，包括以下步驟：一、供試品溶液的制備。精密吸取王老吉涼茶0.2ml，30％甲醇稀釋至1ml，過0.22μm微孔濾膜，作為王老吉成品供試品溶液。二、對照品溶液的制備。單一對照品溶液的制備：分別取各個對照品適量，精密稱定，加甲醇定容至2ml，作為對照品儲備液，于-4℃儲存?zhèn)溆??；旌蠈φ掌啡芤旱闹苽洌悍謩e精密吸取上述單一對照品儲備液，配置成混標儲備液(各對照品濃度見下表)。表1.混合對照品溶液濃度三、檢測。(一)、檢測條件篩選。1、色譜條件的優(yōu)化。對甲醇-水和乙腈-水流動相進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈的洗脫效果優(yōu)于甲醇，各色譜峰分離效果好且分析時間較短。另外，加入0.1％甲酸可以有效的改善有機酸成分色譜峰的拖尾現(xiàn)象，并且能提高負離子模式的質(zhì)譜響應，因此采用乙腈-0.1％甲酸水溶液作為流動相。2、質(zhì)譜條件的優(yōu)化。分別對比了正離子和負離子檢測模式，發(fā)現(xiàn)在實驗條件下有機酸類成分在負離子模式下檢測靈敏度高，故選擇負離子模式掃描。在MRM模式下，對選定的各待測物的母離子和定量子離子進行各種參數(shù)的優(yōu)化。(二)、檢測條件確定。分別將上述供試品溶液和對照品溶液分別注入液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀中檢測，具體條件確定如下：液相色譜條件如下：進樣量：5μL；固定相：AglientPoroshell120EC-C18(3.0×50mm，2.7μm)色譜柱；流動相：體積百分比濃度為0.1％的甲酸水溶液為流動相A，乙腈為流動相B，洗脫梯度為：0-3min，流動相B的體積百分數(shù)為由13％變化至25％；3-7min，流動相B的體積百分數(shù)為25％；7-8min，流動相B的體積百分數(shù)為由25％變化至40％；8-12min，流動相B的體積百分數(shù)為由40％變化至54％；12-16min，流動相B的體積百分數(shù)為13％；柱溫：25℃；流速：0.25mL/min。三重四極桿型質(zhì)譜的質(zhì)譜條件如下：離子化方式：電噴霧離子化(ESI)；檢出模式：多反應監(jiān)測(MRM)方式，負離子模式；毛細管電壓：3500V；噴嘴電壓：500V；霧化氣體、干燥氣體、和鞘氣氣體：氮氣；干燥氣體溫度：300℃；干燥氣流：5L/min；霧化氣壓：45psi；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流速：11L/min。上述各對照品質(zhì)譜分析的條件參數(shù)見下表。表2.各對照品質(zhì)譜分析的條件按上述色譜和質(zhì)譜條件對對照品溶液和供試品溶液中各成分進行測定，記錄色譜圖。四、結(jié)果。按上述色譜和質(zhì)譜條件對對照品溶液和供試品溶液中各成分進行測定，記錄色譜圖。得到混合對照品的總離子流圖(TIC)和王老吉涼茶的總離子流圖(TIC)，分別如圖1、圖2所示；各對照品的MRM提取離子流圖和王老吉涼茶的MRM提取離子流圖，分別如圖3A-B、圖4A-B所示。按上述色譜和質(zhì)譜條件對供試品溶液(不同批次王老吉涼茶)中各成分進行測定分析，用外標法計算各樣品中14個目標化合物的含量，結(jié)果如下表所示。表3.王老吉涼茶中各目標化合物的含量(μg/ml，n＝2)表4王老吉涼茶中各目標化合物占總量的比例(％)五、方法學考察。1、線性關系及檢出限、定量限。分別精密吸取混標儲備液6，12，36，100，300，600，900，1200μL，甲醇定容至2ml，進樣5μL，記錄峰面積。以濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，計算回歸方程。以信噪比(S/N)等于3及10為標準，分別測得各組分的檢出限與定量限，并計算線性方程(見下表)。表5線性方程及檢出限、定量限成分線性方程相關系數(shù)線性范圍(ng/ml)檢測限(ng/ml)定量限(ng/ml)川續(xù)斷皂苷乙Y＝2184.1x+3.84350.99923.6～12012咖啡酰雞蛋花苷Y＝24665x+78.3100.99984.08～40814水仙苷Y＝16622x+33.4440.99963.6～1500.51蘆丁Y＝13077x+369.100.999630～30000.51山奈酚糖苷Y＝13603x+559.910.999248～24000.51異綠原酸AY＝7453.0x-121.380.999436～27001020三葉豆苷Y＝27716x+277.580.99976～9000.21甘草苷Y＝52008x+417.680.99912.4～4800.20.5迷迭香酸Y＝12867x-23.7680.999612～1200510綠原酸Y＝15805x+137.7760.999214.4～1440510咖啡酸Y＝20031x+1383.50.999530～30002030原兒茶酸Y＝8599.2x+128.190.999536～900630原兒茶醛Y＝37255x+254.110.99902.1～31515從上述結(jié)果中可以看出，各化合物的響應值與濃度間均呈現(xiàn)良好的線性關系。2、精密度試驗。精密吸取同一混合對照品溶液5μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰的峰面積，測得各目標化合物的相對標準偏差(RSD)為0.95％-3.78％，結(jié)果表明該方法有較好的精密度。3、重復性試驗。取同一王老吉成品供試液6份，按上述檢測方法，稀釋5倍后進樣5μL進行測定，測得各成分含量的RSD值為0.56％-4.93％，結(jié)果表明供試樣品重復性良好。4、穩(wěn)定性試驗取同一王老吉成品供試液分別于0，4，8，12，18，24h進樣分析，記錄峰面積，計算得RSD值為2.26％-4.82％，結(jié)果表明供試樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。5、加樣回收試驗分別取已知各目標化合物含量的王老吉成品供試液0.1ml，6份，分別加入各化合物，按上述檢測方法，進樣分析，計算回收率，結(jié)果見下表。表6加樣回收試驗從上述結(jié)果中可以看出，該方法的回收率較好，能夠準確測定王老吉涼茶中各目標化合物的含量。實驗例1指標成分的代表性與專屬性試驗王老吉涼茶是由涼粉草、雞蛋花、菊花、金銀花、夏枯草、布渣葉和甘草等七味藥材提取加工制成的，其成分復雜多樣，本實驗在前期化學成分的基礎上，按照上述檢測方法，對王老吉涼茶與各陰性樣品進行逐一分析，具體如下：一、供試品溶液的制備。王老吉涼茶陰性樣品的供試品溶液：分別精密吸取各陰性藥材王老吉涼茶0.2ml，30％甲醇稀釋至1ml，過0.22μm微孔濾膜，作為王老吉涼茶陰性樣品的供試品溶液。上述王老吉涼茶陰性樣品指的是，在制備涼茶過程中，分別不投料布渣葉、甘草、雞蛋花、金銀花、菊花、夏枯草、或仙草，制得分別不合布渣葉、甘草、雞蛋花、金銀花、菊花、夏枯草、仙草的七種涼茶成品。二、對照品溶液的制備。參照實施例1。三、檢測。參照實施例1。四、結(jié)果。按上述色譜和質(zhì)譜條件對供試品溶液(王老吉涼茶陰性樣品的供試品)中各成分進行測定分析，用外標法計算各樣品中6個目標化合物，結(jié)果如下表所示。表7.王老吉涼茶陰性樣品中各目標化合物的檢測結(jié)果注：″+″表示檢出，″-″表示未檢出。通過上述結(jié)果，我們可以分析出，這6個指標成分是單藥味來源化合物：川續(xù)斷皂苷乙、水仙苷、咖啡酰雞蛋花苷、甘草苷、迷迭香酸和三葉豆苷，如下表所示。表8.13個指標成分的化學信息化合物名稱分子式分子量主要來源甘草苷C21H12O9418甘草川續(xù)斷皂苷乙C53H86O221074金銀花水仙苷C29H34O16638布渣葉迷迭香酸C18H16O8360涼粉草三葉豆苷C21H20O11448涼粉草咖啡酰雞蛋花苷C35H40O19764雞蛋花由于單藥味來源的化合物具有較強的專屬性，提示在制定王老吉涼茶成品及原料藥質(zhì)量標準時，應優(yōu)先考慮將該類化合物作為質(zhì)量控制指標。實驗例2王老吉涼茶指標成分的分析根據(jù)上述實施例1的測定結(jié)果，分析得到樣品中13個目標化合物的相對含量歸屬，如下表所示。表9.樣品中13個目標化合物的相對含量歸屬(mean±SD)成分相對含量％(n＝9)迷迭香酸29.84±0.40％綠原酸19.16±0.32％異綠原酸A9.29±0.25％咖啡酸8.69±0.36％三葉豆苷8.37±0.19％甘草苷7.20±0.60％水仙苷4.77±0.42％山奈酚糖苷3.62±0.14％原兒茶酸3.47±0.11％蘆丁3.24±0.21％原兒茶醛2.06±0.16％咖啡酰雞蛋花苷0.24±0.04％川續(xù)斷皂苷乙0.03±0.02％研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對13個目標化合物的相對含量進行分析，發(fā)現(xiàn)迷迭香酸含量最高，在20％以上；相對含量小于20％的成分有綠原酸、異綠原酸A、咖啡酸、三葉豆苷、甘草苷、水仙苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、原兒茶酸、蘆丁、原兒茶醛；相對含量在1％以下的成分為：咖啡酰雞蛋花苷、川續(xù)斷皂苷乙。以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。當前第1頁1 2 3