本發(fā)明屬于氯氮平定量檢測方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效液相質(zhì)譜聯(lián)用測定血漿中氯氮平濃度的方法。

背景技術(shù)：

氯氮平(Clozapine)系二苯二氮類非典型抗精神病藥，有強(qiáng)效抗精神病作用且無明顯椎體外系副反應(yīng)。因其導(dǎo)致粒細(xì)胞缺乏的副反應(yīng)曾一度退出臨床，但由于其對難治性、頑固性精神分裂癥患者的特殊療效，同時(shí)密切監(jiān)測血象和血藥濃度則其嚴(yán)重不良反應(yīng)可以避免，而使其臨床應(yīng)用重新得到肯定。目前仍成為常用的抗精神病藥。

目前，氯氮平的血藥濃度檢測方法有高效液相色譜法、氣相質(zhì)譜聯(lián)用法和液相質(zhì)譜聯(lián)用法等。臨床監(jiān)測氯氮平血藥濃度時(shí)，使用液相質(zhì)譜聯(lián)用方法具有高選擇性、高靈敏度和高準(zhǔn)確度與精密度等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)際工作中，使用高效液相質(zhì)譜聯(lián)用方法，樣品處理步驟簡單、分析時(shí)間短，可以實(shí)現(xiàn)臨床樣品的批量分析。因此，有必要設(shè)計(jì)一種專門針對臨床患者的高效液相質(zhì)譜聯(lián)用監(jiān)測血漿中氯氮平濃度的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供了一種適用于臨床的高效液相質(zhì)譜聯(lián)用測定血漿中氯氮平濃度的方法，該方法實(shí)現(xiàn)了患者氯氮平血藥濃度的日常監(jiān)測，以便合理用藥，降低不良反應(yīng)率的發(fā)生。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案，高效液相質(zhì)譜聯(lián)用測定血漿中氯氮平濃度的方法，其特征在于具體步驟為：

步驟(1)、在氯氮平濃度為23.92～2296ng/mL的范圍內(nèi)分別配制不同濃度的氯氮平甲醇溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取100μL標(biāo)準(zhǔn)溶液置于離心管中，在氮?dú)夥諊麓蹈?，再分別加入100μL空白血漿得到標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，分別取100μL標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，加入500μL含內(nèi)標(biāo)利培酮的甲醇溶液沉淀蛋白，渦旋后離心，取上清液，加超純水稀釋一倍并混合均勻后在高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)樣分析，以氯氮平峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品中氯氮平的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

步驟(2)、取100μL待測血漿樣品，加入500μL含內(nèi)標(biāo)利培酮的甲醇溶液沉淀蛋白，渦旋后離心，取上清液，加超純水稀釋一倍并混合均勻后在高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)樣分析，測得氯氮平峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測血漿樣品中氯氮平的濃度；

其中，液相條件：Agilent Elipse XDB-C18色譜柱，流動(dòng)相為溶液B和溶液A梯度洗脫，梯度設(shè)置為0.01～3.00min，100V％～20V％溶液A；3.00～5.50min，20V％溶液A；5.50～6.00min，20V％～100V％溶液A；6.00～8.50min，100V％溶液A，其中溶液A為甲醇溶液，溶液B為50V％甲醇水溶液，該溶液B中含有6mmol/L的乙酸銨，流速1mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃；

質(zhì)譜條件：離子源為ESI，正離子模式下以MRM進(jìn)行掃描，CAD 6psi，CUR 10psi，GS1 50psi，GS2 80psi，IS 3500v，TEM 400℃，氯氮平選擇離子對m/z 327.3>270.0，DP 55v，EP 12v，CE 29v，CXP 13v；利培酮選擇離子對m/z 411.3>191.1，DP 55v，EP 12v，CE 29v，CXP 13v；Dwell time均為175ms。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述含內(nèi)標(biāo)利培酮的甲醇溶液中利培酮的濃度為40.56ng/mL。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述待測血漿樣品的采集過程為：采集患者肘靜脈血，采血量≥2mL，采血時(shí)間距離末次服藥11～12小時(shí)，使用K₂EDTA抗凝管采血，離心轉(zhuǎn)速為3500r/min，離心時(shí)間為10min，最終得到待測血漿樣品。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述渦旋后離心的具體過程為：渦旋60s，離心轉(zhuǎn)速為12700r/min，離心時(shí)間為10min。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述Agilent Elipse XDB-C18色譜柱的規(guī)格為150×4.6mm，孔徑為5μm。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：本發(fā)明方法經(jīng)驗(yàn)證血漿中氯氮平濃度在23.92～2296ng/mL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r>0.99)，準(zhǔn)確度高(定量下限濃度100％～121％、高中低濃度88.2％～115％)，精密度好(定量下限濃度RSD 4.31％～15.3％、高中低濃度RSD 5.14％～14.8％)，方法選擇性、殘留、稀釋可靠性及基質(zhì)效應(yīng)均符合要求，穩(wěn)定性考察得處理過樣品可室溫放置8小時(shí)穩(wěn)定、樣品可在-80℃環(huán)境下凍融處理2次穩(wěn)定。實(shí)際測量結(jié)果可知，所建方法完全可以滿足臨床檢測氯氮平的血藥濃度的需求。

附圖說明

圖1是以三次考察結(jié)果的氯氮平峰與內(nèi)標(biāo)峰面積比值均值為縱坐標(biāo)，以氯氮平濃度為橫坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

1、分析方法

1.1儀器耗材

高效液相色譜儀(LC-20A，Shimadzu)，三重四級桿質(zhì)譜儀(API 4000，AB SCIEX)，超純水儀(PAL-CAXXBIOM2，Pall corporation)，萬分之一分析天平(NewClassic MF，Mettler Toledo)，氮吹儀(UGC-24CE，北京優(yōu)晟)，高速離心機(jī)(TGL-16M，湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，OF1旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)。

氯氮平(批號：100323-201002；含量：99.8％)和利培酮(批號：100570-201403；含量99.9％)均購自于中國食品藥品檢定研究院、均密封存儲于4℃冰箱，甲醇(HPLC，F(xiàn)isher)，超純水(自制)，醋酸銨(HPLC，2013年1月10日，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，Elipse XDB-C18色譜柱(150×4.6mm，5μm，Agilent)。

1.2樣品制備方法

取100μL血漿樣品(K₂EDTA抗凝)置于1.5mL離心管中，加500μL含利培酮內(nèi)標(biāo)的工作液(40.56ng/mL，甲醇溶解，既加入內(nèi)標(biāo)又用做沉淀蛋白)，渦旋60s混勻，而后離心10min(12700r/min，室溫)，取上清液200μL并加200μL超純水，混勻后進(jìn)樣分析。

1.3分析方法

液相條件：Elipse XDB-C18色譜柱色譜柱(150×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為溶液B-甲醇和溶液A-50V％甲醇水溶液(含6mM乙酸銨)梯度洗脫，梯度設(shè)置(0.01～3.00min，100V％～20V％溶液A；3.00～5.50min，20V％溶液A；5.50～6.00min，20V％～100V％溶液A；6.00～8.50min，100V％溶液A。)，流速1mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃。

質(zhì)譜條件：ESI⁺，MRM定量模式，CAD 6psi，CUR 10psi，GS1 50psi，GS2 80psi，IS3500v，TEM 400℃。氯氮平CLZ：m/z 327.3>270.0，DP 55v，EP 12v，CE 29v，CXP 13v；利培酮RSP：m/z 411.3>191.1,DP 55v，EP 12v，CE 29v，CXP 13v。Dwell time均為175ms。2、選擇性

以6份空白血漿考察選擇性，六份空白血漿信息見表1。樣品處理方法見1.2項(xiàng)方法，但所加蛋白沉淀劑為空白甲醇，分析方法見1.3項(xiàng)方法?？疾旖Y(jié)果見表2，以峰面積或峰高響應(yīng)值衡量干擾組分，均低于分析物定量下限響應(yīng)的20％，且低于內(nèi)標(biāo)響應(yīng)的5％，結(jié)果符合要求。

表1六份空白血漿信息

表2選擇性考察結(jié)果

備注：定量下限考察的分析物峰面積均值2.05*10⁴、峰高均值5.47*10³，內(nèi)標(biāo)峰面積均值1.15*10⁶、峰高均值2.98*10⁵。

3、殘留

以校正標(biāo)樣(濃度：1722ng/mL)考察殘留，注射完該標(biāo)樣后注射空白樣品，平行三次?？瞻讟悠分苽浞椒ㄒ?.2項(xiàng)方法，所用蛋白沉淀劑不含內(nèi)標(biāo)。校正標(biāo)樣制備方法見線性考察。

以殘留峰面積衡量，結(jié)果見表3，三次實(shí)驗(yàn)殘留均值與定量下限均值比為14.8％、低于20％的要求，與內(nèi)標(biāo)均值比為0.264％，低于5％的要求。

表3殘留考察結(jié)果

備注：定量下限考察的分析物峰面積均值2.05*10⁴，內(nèi)標(biāo)峰面積均值1.15*10⁶。

4、定量下限考察

以信噪比10:1確定定量下線時(shí)，發(fā)現(xiàn)空白樣品殘留的信噪比均大于10:1，故最終未以 信噪比10:1確定定量下限。結(jié)合氯氮平的臨床血藥濃度范圍52～1567ng/mL值，本實(shí)驗(yàn)考察建立分析方法的定量下限濃度為23.93ng/mL。

分析物加入空白血漿的具體操作為：取校正標(biāo)樣(濃度23.92ng/mL)100μL置于1.5mLEP管中(管底部1/3下加入)，氮?dú)獯蹈?45℃水浴，5～10L/min流速，10min左右)，而后加入100μL空白血漿溶解分析物。最后按1.2項(xiàng)方法制備供試品，平行5份。分析方法見1.3項(xiàng)方法。

隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y＝0.000616X+0.00146(r＝0.9954)。計(jì)算結(jié)果見表4，準(zhǔn)確度98.2％～120％，RSD值8.75％，準(zhǔn)確度和精密度均符合要求。

表4定量下限考察結(jié)果

5、線性考察

5.1儲備液與工作液的配制

氯氮平分析物儲備液和工作液的配制：精密稱量57.40mg的氯氮平對照品粉末，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移于100mL容量瓶，充分洗滌稱量瓶，甲醇稀釋到刻度，得濃度為0.5740mg/mL的儲備液。儲備液中取1mL，轉(zhuǎn)移于250mL容量瓶中，甲醇稀釋到刻度，得濃度為2296ng/mL的氯氮平工作液。

利培酮內(nèi)標(biāo)儲備液和工作液的配制：精密稱量20.28mg的利培酮對照品粉末，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移于100mL容量瓶，充分洗滌稱量瓶，甲醇稀釋到刻度得濃度為0.2028mg/mL的儲備液。儲備液中取1mL轉(zhuǎn)移于100mL容量瓶中，甲醇稀釋到刻度，得濃度為2.028μg/mL的利培酮溶液，然后從中吸取2mL轉(zhuǎn)移于100mL容量瓶中，甲醇稀釋到刻度，得濃度為40.56ng/mL的利培酮工作液作為內(nèi)標(biāo)工作液使用。

5.2校正標(biāo)樣的配制

結(jié)合氯氮平的臨床血藥濃度范圍52～1567ng/mL與治療血藥濃度范圍300～600ng/mL，所建方法的線性范圍為23.92～2296ng/mL，校正標(biāo)樣的制備方法如下。

以氯氮平工作液(濃度2296ng/mL)進(jìn)行稀釋，分別得濃度為1722ng/mL(3mL氯氮 平工作液加1mL甲醇)、1148ng/mL(1mL氯氮平工作液加1mL甲醇)、574.0ng/mL(1mL濃度為1148ng/mL的標(biāo)液加1mL甲醇)、287.0ng/mL(1mL濃度為574.0ng/mL的標(biāo)液加1mL甲醇)、143.5ng/mL(1mL濃度為287.0ng/mL的標(biāo)液加1mL甲醇)、71.75ng/mL(1mL濃度為143.75ng/mL的標(biāo)液加1mL甲醇)、23.92ng/mL(1mL濃度為71.75ng/mL的標(biāo)液加2mL甲醇)的標(biāo)液，然后以濃度2296ng/mL、1148ng/mL、574.0ng/mL、287.0ng/mL和23.92ng/mL標(biāo)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別吸取100μL標(biāo)液，置于1.5mL離心管中(離心管底部1/3下加入)，然后氮?dú)鈸]干(45℃水浴，5～10L/min氮?dú)饬髁浚?0分鐘左右)。加入100μL空白血漿，然后按1.2項(xiàng)方法制備校正標(biāo)樣。校正標(biāo)樣的分析方法見1.3項(xiàng)方法。

5.3線性考察結(jié)果

所有校正標(biāo)樣均當(dāng)天配制，考察結(jié)果見表5，計(jì)算濃度的準(zhǔn)確度均在標(biāo)示值的±15％以內(nèi)。

以三次考察結(jié)果的氯氮平峰與內(nèi)標(biāo)峰面積比值均值為縱坐標(biāo)，以氯氮平濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1。

表5線性考察結(jié)果

6、準(zhǔn)確度與精密度

質(zhì)控樣品制備：高、中、低及定量下限濃度的質(zhì)控標(biāo)液濃度分別為1722ng/mL、1148ng/mL、71.75ng/mL及23.92ng/mL，配制方法同校正標(biāo)液。然后按校正標(biāo)樣的制備方法制備質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度制備5個(gè)質(zhì)控樣品。以1.3項(xiàng)方法分析。

準(zhǔn)確度與精密度考察結(jié)果見表6，除第二批定量下限濃度樣品的準(zhǔn)確度121％，不在標(biāo)示值的±20％內(nèi)，稍有偏差，其余批次內(nèi)不同濃度的準(zhǔn)確度與精密度均符合要求，所有批次間不同濃度的準(zhǔn)確度與精密度均符合要求。要求：準(zhǔn)確度均值一般在質(zhì)控樣品標(biāo)示值的±15％內(nèi)，定量下限準(zhǔn)確度在標(biāo)示值的±20％；精密度的變異系數(shù)一般不得超過15％，定量下限的變異系數(shù)不得過20％。

第一批隨行線性方程：Y＝0.00151X+0.00633(r＝0.9989)

第二批隨行線性方程：Y＝0.000897X-0.00567(r＝0.9992)

第三批隨行線性方程：Y＝0.000552X-0.000145(r＝0.9969)

表6準(zhǔn)確度與精密度考察結(jié)果

7、稀釋可靠性

參考1.2項(xiàng)下樣品制備方法，樣品先后稀釋6倍和12倍，分別考察樣品稀釋6倍和12倍的可靠性。

稀釋6倍樣品制備方法：取200μL氯氮平工作液，加入到1.5mLEP管中，氮?dú)鈸]干(45℃水浴，氮?dú)饬髁?～10L/min)，加100μL空白血漿，渦旋兩分鐘使之充分溶解，制成高于定量上限濃度的樣品，隨后加500μL空白血漿稀釋6倍，得到稀釋6倍樣品(濃度為796ng/mL)。然后，按1.2項(xiàng)下制備方法處理。平行5次。

稀釋12倍樣品制備方法：按稀釋6倍樣品制備方法制備得稀釋6倍的樣品，再稀釋一倍得稀釋12倍樣品(濃度為382.7ng/mL)。然后，按1.2項(xiàng)下制備方法處理。平行五次。

分析方法見1.3項(xiàng)下內(nèi)容。

稀釋可靠性考察結(jié)果見表7，稀釋6倍和12倍的準(zhǔn)確度和精密度均在±15％之內(nèi)，稀釋可靠性符合要求。

隨行標(biāo)曲線性方程：Y＝0.00105X-0.0028(r＝0.9969)

表7稀釋可靠性考察結(jié)果

7、基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)考察所用6份空白血漿信息見表1。

不含基質(zhì)的樣品處理方法：高低濃度氯氮平標(biāo)液分別取100μL，加500μL內(nèi)標(biāo)工作液，混勻后吸取200μL并加入200μL超純水，混勻進(jìn)樣分析，平行6份。

含基質(zhì)樣品的處理方法：高低濃度氯氮平標(biāo)液分別取100μL，加500μL內(nèi)標(biāo)工作液，混勻后吸取200μL置于1.5mLEP管中，氮?dú)獯蹈?45℃，5～10L/min的流量)，平行六份。然后加入處理過的空白血漿，再加200μL的超純水，混勻進(jìn)樣分析?？瞻籽獫{處理方法見1.2項(xiàng)下內(nèi)容，但所加蛋白沉淀劑為甲醇。

高濃度氯氮平標(biāo)樣濃度1836.8ng/mL，配制方法為吸取4mL氯氮平工作液，加1mL甲醇。低濃度氯氮平標(biāo)液濃度為35.88ng/mL，配制方法是吸取1mL濃度為71.75ng/mL的氯氮平校正標(biāo)液加1mL甲醇。

基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果見表8，內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子變異系數(shù)高低濃度分別是4.96％和1.35％，均小于15％，符合要求。

表8基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果

8、穩(wěn)定性

處理過樣品室溫放置穩(wěn)定性

樣品處理方法：高(1836.8ng/mL)、低(35.88ng/mL)濃度氯氮平標(biāo)液(配制方法見9項(xiàng)下內(nèi)容)分別吸取100μL放置于1.5mLEP管中，氮?dú)鈸]干(45℃水浴，5～10L/min流量)，而后加入100μL的空白血漿，而后按1.2項(xiàng)下方法處理樣品。所得樣品室溫下分別放置0h、2h、4h和8h，每組樣品平行三份，然后按1.3項(xiàng)下方法分析，所得結(jié)果見表9。高低濃度下，處理過的樣品室溫放置0、2、4及8h后所測濃度與標(biāo)示值的偏差均在±15％內(nèi)，說明處理過樣品放置8小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的。

隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程：Y＝00151X+0.00633(r＝0.9989)

表9處理過樣品室溫放置穩(wěn)定性考察結(jié)果

凍融穩(wěn)定性(-80℃)

樣品制備方法同9.1項(xiàng)下內(nèi)容，加入空白血漿后渦旋60s溶解分析物后放置于-80℃冰箱中凍融，室溫條件下放置融解，分別設(shè)計(jì)凍融0、1、2及3次的實(shí)驗(yàn)，每組平行3份，然后按1.2項(xiàng)下方法處理樣品，以1.3項(xiàng)下方法分析。結(jié)果見表10，低濃度下凍融0、1、2及3次的樣品測量濃度與標(biāo)示值的偏差在±15％范圍內(nèi)，高濃度下凍融0、1及2次的樣品測量濃度與標(biāo)示值的偏差在±15％范圍內(nèi)、凍融3次的樣品測量濃度與標(biāo)示值的偏差大于15％，說明樣品可在-80℃冰箱中最多凍融處理2次。

低濃度凍融穩(wěn)定性考察的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程：Y＝0.00105X-0.0028(r＝0.9969)

高濃度凍融穩(wěn)定性考察的隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程：Y＝0.000897X-0.00567(r＝0.9992)。

表10凍融穩(wěn)定性考察結(jié)果

10、臨床應(yīng)用

前期收集46批次樣品，按1.2項(xiàng)下方法處理樣品，以1.3項(xiàng)下方法分析，結(jié)果見表11。

表11 46批次樣品氯氮平血藥濃度測量結(jié)果

11、小結(jié)

方法經(jīng)驗(yàn)證氯氮平血藥濃度在23.92～2296ng/mL的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r>0.99)，準(zhǔn)確度高(定量下限濃度100％～121％、高中低濃度88.2％～115％)，精密度好(定量下限濃度RSD 4.31％～15.3％、高中低濃度RSD 5.14％～14.8％)，方法選擇性、殘留、稀釋可靠性及基質(zhì)效應(yīng)均符合要求，穩(wěn)定性考察得處理過樣品可室溫放置8小時(shí)穩(wěn)定、樣品可在-80℃環(huán)境下凍融處理2次穩(wěn)定。實(shí)際測量結(jié)果可知，所建方法完全可以滿足臨床檢測氯氮平的血藥濃度的需求。

以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。