本發(fā)明屬于檢測(cè)分析領(lǐng)域，具體涉及一種提取芳香胺的方法，還涉及檢測(cè)芳香胺的方法、試劑盒及其用途。

背景技術(shù)：

芳香胺化合物大多具有毒性，常作為中間體存在于合成染料、殺蟲劑、橡膠、塑料、粘合劑和藥物等產(chǎn)品中。其中，有些芳香胺的毒性很強(qiáng)，有些則是潛在的致癌物，比如4-氨基聯(lián)苯和2-萘胺就是熟知的致癌物。抽吸煙草制品產(chǎn)生的煙氣中以及煙草和煙草制品中都存在芳香胺，但煙草和煙草制品中的芳香胺含量較煙氣中更低。因此，準(zhǔn)確測(cè)定煙草和煙草制品中的芳香胺含量對(duì)產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)有一定意義。

迄今為止，研究人員已對(duì)抽吸煙草制品產(chǎn)生的煙氣中的芳香胺化合物進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)方法包括氣相色譜法(GC)、液相色譜法(LC)、毛細(xì)管電泳法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC/MS)等。其中，氣相色譜法、高效液相色譜法易受雜質(zhì)干擾影響，產(chǎn)生假陽(yáng)性問(wèn)題；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法雖可避免出現(xiàn)假陽(yáng)性問(wèn)題，但對(duì)于含復(fù)雜成分的樣品，需在樣品前處理中進(jìn)行多次萃取、衍生化和過(guò)柱凈化，操作過(guò)程復(fù)雜、周期較長(zhǎng)。

與抽吸煙草制品產(chǎn)生的煙氣相比，煙草和煙草制品中含有更多的成分，背景更為復(fù)雜，檢測(cè)分析時(shí)的雜質(zhì)干擾更為嚴(yán)重，并且由于煙草和煙草制品中的芳香胺含量更低，因此，更加不容易準(zhǔn)確測(cè)定芳香胺的含量。迄今還未發(fā)現(xiàn)能對(duì)煙草或煙草制品中的芳香胺進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定的方法。

目前，尚需一種檢測(cè)芳香胺的方法，以準(zhǔn)確定量煙草或煙草制品中的芳香胺。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人創(chuàng)造性地獲得了一種提取芳香胺的方法，相比于現(xiàn)有的提取方法，該方法能更大程度地提取出煙草和/或煙草制品中的芳香胺化合物，提取率更高。同時(shí)，本發(fā)明人還得到了一種檢測(cè)芳香胺的方法，能夠?qū)煵莺?或煙草制品中的芳香胺化合物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的定量分析，并且檢出限低，靈敏度更高，重現(xiàn)性好，操作更為簡(jiǎn)便。

本發(fā)明第一方面涉及一種提取芳香胺的方法，包括如下步驟，

(1)用強(qiáng)酸溶液浸提樣品，分離得到初提液；所述樣品為煙草和/或煙草制品；

(2)將初提液的pH值調(diào)整至大于7，用脂肪醚進(jìn)行萃取，分離得到萃取液。

本發(fā)明第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，還包括如下步驟，

(3)去除萃取液中的脂肪醚，得到萃取物，將所述萃取物溶解于甲醇，得到提取液。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(3)中，通過(guò)將萃取液進(jìn)行干燥來(lái)去除脂肪醚；優(yōu)選地，干燥方式為氮?dú)獯蹈伞?/p>

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(3)中，甲醇的體積用量為萃取液體積的50％-200％，優(yōu)選為80％-120％，更優(yōu)選為100％。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(3)中，去除脂肪醚前，還包括向萃取液中加入弱酸或弱酸溶液進(jìn)行混合的步驟。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述弱酸為醋酸；優(yōu)選地，所述醋酸的純度為99％-100％(W/W)，更優(yōu)選為99.5％(W/W)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述弱酸溶液為醋酸水溶液；優(yōu)選地，所述醋酸水溶液的濃度不超過(guò)99％(W/W)，更優(yōu)選為40％-70％(W/W)、50％(W/W)、60％(W/W)或80％(W/W)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述弱酸溶液(以弱酸計(jì))或弱酸的添加量為0.1-0.8mL/(mL萃取液)，更優(yōu)選為0.3-0.7mL/(mL萃取液)，進(jìn)一步優(yōu)選為0.5mL/(mL萃取液)。

本發(fā)明第一方面的一個(gè)實(shí)施方式中，包括如下A至M中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng)：

A.步驟(1)中，所述強(qiáng)酸溶液為強(qiáng)酸水溶液；優(yōu)選地，所述強(qiáng)酸水溶液選自鹽酸水溶液和硝酸水溶液中的一種或多種；

B.步驟(1)中，所述強(qiáng)酸溶液為稀溶液；

C.步驟(1)中，所述強(qiáng)酸溶液的濃度為1％-10％(W/W)，優(yōu)選為2％-8％(W/W)，更優(yōu)選為5％(W/W)；

D.步驟(1)中，所述浸提的料液比為1:(20-100)(g/mL)，優(yōu)選為1:(40-70)(g/mL)，更優(yōu)選為1:50(g/mL)；

E.步驟(1)中，浸提時(shí)間為10-150分鐘，優(yōu)選為20-100分鐘，更優(yōu)選為30分鐘；

F.步驟(1)中，所述浸提在超聲條件下進(jìn)行；

G.步驟(2)中，將所述初提液的pH值調(diào)整至大于8，優(yōu)選為大于10，更優(yōu)選為13以上；

H.步驟(2)中，通過(guò)向初提液中加入固體堿或堿溶液來(lái)調(diào)整pH值，優(yōu)選加入固體堿；更優(yōu)選地，固體堿選自氫氧化鈉和氫氧化鉀中的一種或多種；

I.步驟(2)中，萃取前，還包括將調(diào)整完pH值的初提液靜置冷卻的步驟；優(yōu)選地，靜置冷卻的時(shí)間為5分鐘；

J.步驟(2)中，所述脂肪醚為極性脂肪醚，優(yōu)選為低沸點(diǎn)的極性脂肪醚，更優(yōu)選沸點(diǎn)為40-70℃，進(jìn)一步優(yōu)選沸點(diǎn)為50-60℃；優(yōu)選地，所述脂肪醚選自乙醚和叔丁基甲醚中的一種或多種，更優(yōu)選為叔丁基甲醚；

K.步驟(2)中，所述脂肪醚的用量為5-40mL/(g樣品)，優(yōu)選為10-30mL/(g樣品)，更優(yōu)選為20mL/(g樣品)；

L.步驟(2)中，萃取時(shí)間為5-20分鐘，優(yōu)選為10分鐘；

M.步驟(1)中，所述芳香胺選自鄰氨基偶氮甲苯、4-氨基聯(lián)苯、2-氨基-4-硝基甲苯、聯(lián)苯胺、對(duì)氯苯胺、4-氯-鄰甲基苯胺、2-甲氧基-5-甲基苯胺、2-奈胺、4,4'-二氨基二苯基甲烷、2,4-二氨基甲苯、3,3'-二氯聯(lián)苯胺、3,3'-二甲氧基聯(lián)苯胺、3,3'-甲基-4,4'-二氨基二苯甲烷、4,4'-亞甲基-二-(2-氯苯胺)、4,4'-二氨基二苯醚、鄰甲苯胺、4-氨基偶氮苯、2-氨基苯甲醚、2,4-二甲基苯胺和2,6-二甲基苯胺中的一種或多種。

本發(fā)明第二方面涉及一種檢測(cè)芳香胺的方法，包括按照本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)所述的提取方法獲得萃取液和/或提取液的步驟；還包括用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定萃取液和/或提取液的步驟。

本發(fā)明第二方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述測(cè)定為定量檢測(cè)，優(yōu)選為內(nèi)標(biāo)法定量檢測(cè)；更優(yōu)選地，內(nèi)標(biāo)物為d7-1-氨基萘。

本發(fā)明第二方面的一個(gè)實(shí)施方式中，液相色譜的操作條件包括如下a至d中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng):

a.色譜柱為菲羅門Agilent ZORBAX SB-C3液相色譜柱；優(yōu)選地，色譜柱的規(guī)格為150mm×2.1mm i.d.,5μm粒徑；

b.色譜柱的溫度為25-50℃，優(yōu)選為30-50℃，更優(yōu)選為40℃；

c.進(jìn)樣量為1-10μL，優(yōu)選為2-8μL，更優(yōu)選為3μL；

d.流動(dòng)相由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1％(V/V)乙酸水溶液；優(yōu)選地，流動(dòng)相的洗脫程序如下表所示，

本發(fā)明第二方面的一個(gè)實(shí)施方式中，質(zhì)譜的操作條件或參數(shù)包括如下1)至66)中的任意一項(xiàng)或者多項(xiàng):

1)離子源為電噴霧電離源；

2)掃描方式為正離子掃描；

3)檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；

4)電噴霧電壓為4000-7000V，優(yōu)選為5000-6000V，更優(yōu)選為5500V；

5)離子源溫度為500-750℃，優(yōu)選為550-700℃，更優(yōu)選為650℃；

6)輔助氣Gas1和/或Gas2的壓力為40-70psi，優(yōu)選為50-60psi，更優(yōu)選為50psi或60psi；

7)鄰氨基偶氮甲苯的定量離子對(duì)為226.1/91.1；

8)鄰氨基偶氮甲苯的定性離子對(duì)為226.1/121.1；

9)鄰氨基偶氮甲苯的碰撞能為20V；

10)4-氨基聯(lián)苯的定量離子對(duì)為170.1/153.2；

11)4-氨基聯(lián)苯的定性離子對(duì)為170.1/152.1；

12)4-氨基聯(lián)苯的碰撞能為20V；

13)2-氨基-4-硝基甲苯的定量離子對(duì)為153.1/107.1；

14)2-氨基-4-硝基甲苯的定性離子對(duì)為153.1/89.9；

15)2-氨基-4-硝基甲苯的碰撞能為25V；

16)聯(lián)苯胺的定量離子對(duì)為184.1/156；

17)聯(lián)苯胺的定性離子對(duì)為184.1/166；

18)聯(lián)苯胺的碰撞能為40V；

19)對(duì)氯苯胺的定量離子對(duì)為128/93.1；

20)對(duì)氯苯胺的定性離子對(duì)為128/111.2；

21)對(duì)氯苯胺的碰撞能為20V；

22)4-氯-鄰甲基苯胺的定量離子對(duì)為142/107.2；

23)4-氯-鄰甲基苯胺的定性離子對(duì)為142/125.2；

24)4-氯-鄰甲基苯胺的碰撞能為23V；

25)2-甲氧基-5-甲基苯胺的定量離子對(duì)為138.1/123.2；

26)2-甲氧基-5-甲基苯胺的定性離子對(duì)為138.1/105.2；

27)2-甲氧基-5-甲基苯胺的碰撞能為20V；

28)2-奈胺的定量離子對(duì)為144.1/127.1；

29)2-奈胺的定性離子對(duì)為144.1/77.2；

30)2-奈胺的碰撞能為25V；

31)4,4’-二氨基二苯基甲烷的定量離子對(duì)為199.1/106.2；

32)4,4’-二氨基二苯基甲烷的定性離子對(duì)為199.1/77.2；

33)4,4’-二氨基二苯基甲烷的碰撞能為30V；

34)2,4-二氨基甲苯的定量離子對(duì)為123.1/108；

35)2,4-二氨基甲苯的定性離子對(duì)為123.1/106.1；

36)2,4-二氨基甲苯的碰撞能為23V；

37)3,3’-二氯聯(lián)苯胺的定量離子對(duì)為253.1/217.1；

38)3,3’-二氯聯(lián)苯胺的定性離子對(duì)為253.1/182.1；

39)3,3’-二氯聯(lián)苯胺的碰撞能為30V；

40)3,3’-二甲氧基聯(lián)苯胺的定量離子對(duì)為245.2/230.2；

41)3,3’-二甲氧基聯(lián)苯胺的定性離子對(duì)為245.2/213.2；

42)3,3’-二甲氧基聯(lián)苯胺的碰撞能為25V；

43)3,3’-甲基-4,4’-二氨基二苯甲烷的定量離子對(duì)為227.2/120.2；

44)3,3’-甲基-4,4’-二氨基二苯甲烷的定性離子對(duì)為227.2/178.2；

45)3,3’-甲基-4,4’-二氨基二苯甲烷的碰撞能為25V；

46)4,4’-亞甲基-二-(2-氯苯胺)的定量離子對(duì)為267.2/231.2；

47)4,4’-亞甲基-二-(2-氯苯胺)的定性離子對(duì)為267.2/140.2；

48)4,4’-亞甲基-二-(2-氯苯胺)的碰撞能為30V；

49)4,4’-二氨基二苯醚的定量離子對(duì)為201.1/108.3；

50)4,4’-二氨基二苯醚的定性離子對(duì)為201.1/184；

51)4,4’-二氨基二苯醚的碰撞能為23V；

52)鄰甲苯胺的定量離子對(duì)為108.1/91.4；

53)鄰甲苯胺的定性離子對(duì)為108.1/93.2；

54)鄰甲苯胺的碰撞能為23V；

55)4-氨基偶氮苯的定量離子對(duì)為198.2/77.2；

56)4-氨基偶氮苯的定性離子對(duì)為198.2/51.2；

57)4-氨基偶氮苯的碰撞能為23V；

58)2-氨基苯甲醚的定量離子對(duì)為124.4/109.2；

59)2-氨基苯甲醚的定性離子對(duì)為124.1/92.3；

60)2-氨基苯甲醚的碰撞能為23V；

61)2,4-二甲基苯胺的定量離子對(duì)為122.1/107.2；

62)2,4-二甲基苯胺的定性離子對(duì)為122.1/105.2；

63)2,4-二甲基苯胺的碰撞能為23V；

64)2,6-二甲基苯胺的定量離子對(duì)為122.1/105.3；

65)2,6-二甲基苯胺的定性離子對(duì)為122.1/107.2；

66)2,6-二甲基苯胺的碰撞能為23V。

本發(fā)明第三方面涉及一種試劑盒，包含，

Ⅰ.鹽酸水溶液；

II.氫氧化鈉固體和/或氫氧化鈉水溶液；和

III.乙醚和/或叔丁基甲醚。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含醋酸和甲醇；優(yōu)選地，所述醋酸的純度為99％-100％(W/W)，更優(yōu)選為99.5％(W/W)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含液相色譜柱；優(yōu)選地，所述液相色譜柱為菲羅門Agilent ZORBAX SB-C3液相色譜柱。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含0.1％(V/V)乙酸水溶液。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述鹽酸水溶液的濃度為1-10％(W/W)，優(yōu)選為5％(W/W)。

本發(fā)明第四方面涉及本發(fā)明第三方面任一項(xiàng)所述試劑盒在提取和/或檢測(cè)樣品中的芳香胺中的用途；所述樣品為煙草和/或煙草制品。

本發(fā)明第四方面的一個(gè)實(shí)施方式中，所述芳香胺選自鄰氨基偶氮甲苯、4-氨基聯(lián)苯、2-氨基-4-硝基甲苯、聯(lián)苯胺、對(duì)氯苯胺、4-氯-鄰甲基苯胺、2-甲氧基-5-甲基苯胺、2-奈胺、4,4'-二氨基二苯基甲烷、2,4-二氨基甲苯、3,3'-二氯聯(lián)苯胺、3,3'-二甲氧基聯(lián)苯胺、3,3'-甲基-4,4'-二氨基二苯甲烷、4,4'-亞甲基-二-(2-氯苯胺)、4,4'-二氨基二苯醚、鄰甲苯胺、4-氨基偶氮苯、2-氨基苯甲醚、2,4-二甲基苯胺和2,6-二甲基苯胺中的一種或多種。

本發(fā)明中，

如無(wú)特別說(shuō)明，“強(qiáng)酸”是指在水溶液中幾乎能全部電離的酸類，具有強(qiáng)的酸性反應(yīng)，例如鹽酸HCl、硫酸H₂SO₄、硝酸HNO₃、高氯酸HCl₄等。

如無(wú)特別說(shuō)明，“浸提”是指利用適當(dāng)?shù)娜苊胶头椒?，從原料中將可溶性有效成分浸出的過(guò)程。

如無(wú)特比說(shuō)明，“芳香胺”是指氨分子中部分或全部氫原子被苯基或其它芳香基取代的衍生物。例如苯胺、二苯胺、三苯胺等。芳香胺為高沸點(diǎn)的液體或低熔點(diǎn)的固體，具有特殊的氣味，毒性大，一般難溶于水。

如無(wú)特別說(shuō)明，“脂肪醚”是指兩個(gè)一價(jià)脂肪烴基與一個(gè)氧原子連接的化合物，通式是R-O-R′，例如二甲醚CH₃-O-CH₃、二乙醚C₂H₅OC₂H₅等。

如無(wú)特別說(shuō)明，“氮?dú)獯蹈伞笔侵笇⒌獨(dú)獯等爰訜針悠返谋砻孢M(jìn)行樣品濃縮或干燥，具有省時(shí)、操作方便、容易控制等特點(diǎn)。

如無(wú)特別說(shuō)明，“弱酸”是指在水溶液中只能小部分電離的酸類,具有弱的酸性反應(yīng)。例如碳酸H₂CO₃、氫硫酸H₂S、硼酸H₃BO₃等。

如無(wú)特別說(shuō)明，“煙草”是指茄科，煙草屬(Nicotiana L.)，一年生或多年生草本，嗜好類作物。本屬約有60多個(gè)種，大多是野生種。主要栽培種有紅花煙草和黃花煙草。二者均原產(chǎn)南美洲,都是自然產(chǎn)生的雙二倍體。紅花煙草又稱普通煙草,是世界性商品生產(chǎn)用煙種。又因調(diào)制方法及種源、地區(qū)、栽培措施不同而形成多種類型：烤煙、白肋煙、馬里蘭煙、雪茄煙、熏煙、香料煙、曬紅煙、曬黃煙等。每一類型中又有很多栽培品種。黃花煙草以前蘇聯(lián)和印度栽培較多，中國(guó)新疆、甘肅等地有少量栽培。本屬中的花煙草(N.alata Link and Otta)和粉藍(lán)煙草(N.glauca Graham)栽種供觀賞。

如無(wú)特別說(shuō)明，“煙草制品”是指全部或部分由煙葉為原材料生產(chǎn)的、供抽吸、吸吮、咀嚼或鼻吸的制品。所述煙草制品包括但不限于卷煙和嚼煙。

如無(wú)特別說(shuō)明，“內(nèi)標(biāo)法”是指儀器分析中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的一種方法。其原理是：將一定量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)加入不同濃度級(jí)次的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，然后求出待測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)物的信號(hào)強(qiáng)度之比，作為縱軸；再求出待測(cè)成分的量或待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)物量的比值，作為橫軸，繪制關(guān)系曲線。一般情況下，所用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)與待測(cè)成分相似，且能與待測(cè)成分分離。內(nèi)標(biāo)法可消除測(cè)量?jī)x器，測(cè)量條件的變化，進(jìn)樣量變化等的影響，從而提高了分析精密度，廣泛用于色譜分析和光譜分析。

本發(fā)明取得的有益效果：

1、本發(fā)明的提取方法能更大程度地提取出煙草和/或煙草制品中的芳香胺化合物，提取率更高。

2、本發(fā)明的檢測(cè)方法能更為快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出煙草和/或煙草制品中的芳香胺化合物含量。

3、本發(fā)明的檢測(cè)方法檢出限低、靈敏度更高、重現(xiàn)性好、操作更為簡(jiǎn)便。

4、本發(fā)明檢測(cè)方法中，采用菲羅門Agilent ZORBAX SB-C3液相色譜柱，能將20種芳香胺很好地分離，幾乎不存在峰形拖尾問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中

圖1為本發(fā)明提取方法的流程圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中S3級(jí)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜圖。

圖3為對(duì)比例3中樣品溶液的色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、材料和試劑

(1)20種芳香胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(購(gòu)買自百靈威科技有限公司)：20種芳香胺分別為：鄰氨基偶氮甲苯，4-氨基聯(lián)苯，2-氨基-4-硝基甲苯，聯(lián)苯胺，對(duì)氯苯胺，4-氯-鄰甲基苯胺，2-甲氧基-5-甲基苯胺，2-奈胺，4,4'-二氨基二苯基甲烷，2,4-二氨基甲苯，3,3'-二氯聯(lián)苯胺，3,3'-二甲氧基聯(lián)苯胺，3,3'-甲基-4,4'-二氨基二苯甲烷，4,4'-亞甲基-二-(2-氯苯胺)，4,4'-二氨基二苯醚，鄰甲苯胺，4-氨基偶氮苯，2-氨基苯甲醚，2,4-二甲基苯胺，2,6-二甲基苯胺；濃度均為300μg/mL。

(2)內(nèi)標(biāo)物d7-1-氨基萘(購(gòu)買自百靈威科技有限公司)。

(3)內(nèi)標(biāo)溶液：稱取d7-1-氨基萘10mg，置于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為100μg/mL的一級(jí)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液。取一級(jí)內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液1mL，置于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為1μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

(4)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：將20種芳香胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，置于100mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解和定容，得一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(20種芳香胺的濃度均為3μg/mL)。取一級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5mL，置于100mL棕色容量瓶中，以甲醇溶解和定容，得二級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(20種芳香胺的濃度均為150ng/mL)。分別準(zhǔn)確吸取二級(jí)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.2mL、0.4mL、1mL、2mL、4mL和10mL于100mL棕色容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，得到S1-S6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中，20種芳香胺的濃度各自為0.3ng/mL、0.6ng/mL、1.5ng/mL、3ng/mL、6ng/mL和15ng/mL。

2、提取

按照?qǐng)D1的流程對(duì)煙草中的芳香胺進(jìn)行提取。

準(zhǔn)確稱取0.5g煙末樣品(粉碎后的云南煙葉)，置于50mL磨口三角瓶中，準(zhǔn)確加入50μL的1μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液和25mL5％(W/W)的鹽酸水溶液，超聲條件下浸提30分鐘，得到初提液。之后用固體氫氧化鈉將初提液的pH值調(diào)節(jié)至13，靜置冷卻5分鐘后，加入10mL叔丁基甲醚振蕩萃取10分鐘，靜置5分鐘。向1mL上層液體中加入2至3滴醋酸并混合，氮?dú)獯蹈珊?，向剩余物中加?mL甲醇溶解，得到樣品溶液。其中，醋酸的純度為99.5％(W/W)。

3、檢測(cè)

用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB SCIEX公司的Qtrap 5500)分別對(duì)S1-S6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)分析。其中，S3級(jí)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的色譜圖如圖2所示。

色譜操作條件：色譜柱采用菲羅門Agilent ZORBAX SB-C3液相色譜柱，規(guī)格為150mm×2.1mm i.d.,5μm粒徑；色譜柱溫度為40℃；進(jìn)樣量為3μL；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.1％(V/V)的乙酸水溶液；流動(dòng)相的梯度洗脫程序見表1。

表1流動(dòng)相的梯度洗脫程序

質(zhì)譜操作條件：離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧電壓：5500V；離子源溫度：650℃；輔助氣Gas1壓力：60psi；輔助氣Gas2壓力：50psi。

各芳香胺化合物的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)及碰撞能量(CE)見表2。

表2質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

4、計(jì)算

(1)根據(jù)上述3中S1-S6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的檢測(cè)結(jié)果，以芳香胺化合物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比對(duì)濃度比進(jìn)行線性回歸，得到20種芳香胺化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見表3。其中，橫坐標(biāo)表示芳香胺化合物的濃度與內(nèi)標(biāo)物濃度的比值，縱坐標(biāo)表示芳香胺化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值。取最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行10次平行測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為檢測(cè)限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為定量限，列于表3。

表3芳香胺化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、檢出限和定量限

由表3可知，本發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)20種芳香胺化合物的檢出限低，靈敏度高。

(2)根據(jù)樣品溶液的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)合表3中芳香胺化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣品溶液中的芳香胺含量，進(jìn)一步計(jì)算得到煙末樣品中的芳香胺含量。在高、中、低三個(gè)水平上分別對(duì)20種芳香胺進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，每個(gè)加標(biāo)樣品平行測(cè)定三次取平均值，并考察檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性，結(jié)果如表4所示。

表4回收率和重復(fù)性

由表4可知，本發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)20種芳香胺的加標(biāo)回收率都在90％以上，準(zhǔn)確性高，而且檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性良好。

對(duì)比例1

準(zhǔn)確稱取0.5g與實(shí)施例1同樣的煙末樣品，置于50mL磨口三角瓶中，準(zhǔn)確加入50μL的1μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液和25mL5％(W/W)的鹽酸水溶液，超聲條件下浸提30分鐘，得到初提液。將初提液經(jīng)第一步SPE柱(Waters Oasis MCX)吸附，用1％HCL和甲醇洗脫除去中性和其它極性雜質(zhì)，再用含5％NH₄OH的甲醇洗脫。第二步SPE用非極性/疏水性反相柱(Waters Oasis HLB)吸附，洗脫液經(jīng)濃縮后，進(jìn)行LC-MS/MS分析，LC-MS/MS操作條件與實(shí)施例1相同。

結(jié)果顯示：

1)對(duì)比例1測(cè)得的20種芳香胺化合物的色譜峰峰面積小于實(shí)施例1的測(cè)定結(jié)果，例如，對(duì)比例1測(cè)定的2-萘胺的峰面積為3746，而實(shí)施例1測(cè)定的2-萘胺的峰面積為6658，說(shuō)明本發(fā)明提取方法的提取率更高，本發(fā)明檢測(cè)方法的靈敏度更高。

2)對(duì)比例1中20種芳香胺的加標(biāo)回收率均未超過(guò)90％，說(shuō)明本發(fā)明檢測(cè)方法相比于對(duì)比例1檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性更高。

對(duì)比例2

用乙醚代替實(shí)施例1中的叔丁基甲醚，其余參照實(shí)施例1進(jìn)行。

結(jié)果顯示，與本發(fā)明叔丁基甲醚萃取得到的萃取液相比，使用乙醚萃取，得到的萃取液更混濁，雜質(zhì)含量更多，污染性更大。

對(duì)比例3

用C₁₈液相色譜柱代替實(shí)施例1的液相色譜柱，其余參照實(shí)施例1進(jìn)行，得到樣品溶液的色譜圖如圖3所示。

由圖3可知，與本發(fā)明的液相色譜柱相比，使用C₁₈液相色譜柱時(shí)，20種芳香胺不能很好地分離，并且峰形拖尾嚴(yán)重。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。