本發(fā)明涉茶葉中活性成分檢測(cè)方法領(lǐng)域，特別涉及硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料修飾電極測(cè)定蘆丁的方法。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，自由基與多種疾病的關(guān)系，已愈來(lái)愈被重視，自由基生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展使得探尋高效低毒的自由基清除劑——天然抗氧化劑成為生物化學(xué)和醫(yī)藥學(xué)的研究熱點(diǎn)。氧化作用被認(rèn)為是茶葉保健抗癌最重要的機(jī)理，大量的研究報(bào)道證實(shí)茶葉中多酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗癌、抗突變、降血脂、降血壓、殺菌、消炎等多種保健功能，是茶葉中最主要的生理活性成分。蘆丁作為一種黃酮類的抗氧化劑物質(zhì)，具有降低毛細(xì)血管通透性、抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒及抑制醛糖還原酶等多方面藥理活性。因此建立一種檢測(cè)蘆丁的高靈敏度的方法對(duì)食品分析、藥物分析和醫(yī)學(xué)研究有重要的意義。目前，蘆丁的分析方法主要有紫外分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法等。這四種方法中前兩種方法靈敏度較差，線性范圍窄；后兩種方法則需要較復(fù)雜和昂貴的儀器設(shè)備。因此建立一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)茶葉中活性成分蘆丁的分析方法具有非常重要的意義。

蘆丁分子中含有4個(gè)酚羥基，具有電化學(xué)活性，因此可用電分析化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。由于電化學(xué)分析方法具有檢測(cè)速度快，便于操作，成本低廉，檢測(cè)限低和反應(yīng)靈敏高等性能，用電化學(xué)方法檢測(cè)可以獲得較寬的線性范圍，且檢測(cè)速度較快，因此利用電化學(xué)方法檢測(cè)茶葉中活性成分具有較為廣闊的應(yīng)用空間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料修飾電極測(cè)定蘆丁的方法，旨在通過(guò)簡(jiǎn)單的電化學(xué)檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)茶葉中活性成分的快速、有效測(cè)定，為云南省豐富茶產(chǎn)品在高尖端領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供研究依據(jù)。

電化學(xué)傳感器的靈敏度和選擇性主要取決于電極上的換能器(信號(hào)轉(zhuǎn)換元件)和識(shí)別器(敏感元件)，其中換能器的界面?zhèn)鞲胁牧闲枰唠娮觽鲗?dǎo)性、高比表面積與良好的催化活性，以提高換能器對(duì)敏感材料的吸附性能及生物相容性，降低氧化還原反應(yīng)過(guò)電勢(shì)，提高生物傳感器的選擇性與靈敏度。因此，本發(fā)明以氧化硼作為石墨烯的摻雜材料，引進(jìn)電子或空穴到石墨烯材料中，調(diào)節(jié)石墨烯的電子結(jié)構(gòu)，改善其物理化學(xué)性質(zhì)，從而改變石墨烯的電子傳輸性質(zhì)。更有意義的是硼摻雜的點(diǎn)缺陷石墨烯可增強(qiáng)Ag、Au、Pt三種金屬與石墨烯之間的相互作用，獲得高電子傳導(dǎo)的電極界面修飾材料。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：

硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料修飾電極測(cè)定蘆丁的方法，步驟如下：

步驟一、硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料的制備

通過(guò)水熱熱法合成硼摻雜石墨烯；采用種子生長(zhǎng)法制備Au@AuPt核殼型納米粒子；最后，通過(guò)超聲技術(shù)將成千上百顆核殼型納米粒子嵌入到硼摻雜石墨烯片層結(jié)構(gòu)間，進(jìn)一步將硼摻雜石墨烯剝離為單層或幾層的片層結(jié)構(gòu)，同時(shí)硼摻雜的點(diǎn)缺陷石墨烯增強(qiáng)了Au@AuPt核殼型納米粒子在其表面的附著作用力，消除了納米粒子易聚集失活的缺陷，從而獲得BG/Au@AuPt高電子傳導(dǎo)的電極界面修飾材料；

步驟二、基于硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料電化學(xué)傳感器的制備

先將直徑均為3mm的玻碳電極(GCE)，依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al₂O₃溶液在麂皮上拋光成鏡面，然后分別用1.0MHNO₃溶液，無(wú)水乙醇和二次水中超聲清洗，最后用高純氮?dú)獯蹈?；用移液槍?0μL制備好的BG/Au@AuPt滴涂在玻碳電極表面，晾干保存?zhèn)溆?，電極簡(jiǎn)稱BG/Au@AuPt/GCE；

步驟三、基于硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料修飾電極檢測(cè)蘆丁

將構(gòu)建好的BG/Au@AuPt/GCE用于茶葉中蘆丁的快速檢測(cè)，其中磷酸鹽緩沖溶液的最佳pH＝4、富集時(shí)間400s、富集電位0.4V；在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，1)考察了掃描速度對(duì)蘆丁電化學(xué)行為的影響，根據(jù)掃描速度與氧化、還原峰電流值線性擬合方程說(shuō)明修飾電極對(duì)蘆丁主要是吸附控制；2)采用差分脈沖伏安法對(duì)蘆丁進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)濃度和氧化峰電流值的線性關(guān)系，得出該修飾電極對(duì)蘆丁檢測(cè)的線性范圍和檢測(cè)限；3)將基于硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料修飾電極在蘆丁存在的情況下連續(xù)掃描25圈后，氧化還原電流沒(méi)有明顯下降，說(shuō)明摻雜石墨烯負(fù)載核殼型貴金屬納米復(fù)合材料為該傳感器提供了良好的穩(wěn)定性，同時(shí)能長(zhǎng)期保持傳感器的穩(wěn)定活性及穩(wěn)定性；4)修飾電極在檢測(cè)蘆丁時(shí)顯示出的優(yōu)良的抗干擾能力，通過(guò)加標(biāo)回收法對(duì)茶葉中的活性成分的檢測(cè)，得出該修飾電極對(duì)茶葉中的活性成分蘆丁具有良好的響應(yīng)，可用于對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)。

進(jìn)一步的，所述步驟一中，硼摻雜石墨烯的具體制備方法為：取5mL氧化石墨烯和30mL去蒸餾水，按照氧化石墨烯與三氧化二硼的質(zhì)量比為1:10、1:20、1:25、1:30稱取三氧化二硼，將所稱取的三氧化二硼溶于20mL蒸餾水中。將氧化石墨烯溶液、去蒸餾水、三氧化二硼溶液混合并超聲1h，倒入高壓反應(yīng)釜升溫到160℃后，反應(yīng)3h，冷卻后取出硼摻雜石墨烯超聲2h，即可得到分散均勻的硼摻雜石墨烯。

進(jìn)一步的，所述步驟一中制備硼摻雜石墨烯時(shí)，B₂O₃與氧化石墨烯質(zhì)量比為1:20。

進(jìn)一步的，所述步驟一中，Au@AuPt核殼型納米粒子的制備方法為：采用Frens’法制備納米金溶膠，將50mL 0.01wt％HAuCl₄溶液放入三頸燒瓶中，安裝好回流裝置，在攪拌下加熱至沸騰后，迅速加入3mL 38.8mM檸檬酸鈉溶液，溶液由紫色逐漸變?yōu)樗{(lán)色，最后成酒紅色，說(shuō)明氯金酸已經(jīng)被還原成納米金，繼續(xù)保持沸騰約30min，冷卻至室溫，即可制得金種子；采用種子誘導(dǎo)法，將Au納米粒子作為種子，取一個(gè)錐形瓶，在冰浴條件下分別加入2mL的金溶膠，然后加入680μL 1mM氯金酸和680μL 1mM氯鉑酸，640μL蒸餾水，混合溶液在冰浴條件下攪拌至少2min，最后用微量注射器將660μL硼氫化鈉溶液(10mM)均勻、緩慢地滴入上述溶液中繼續(xù)反應(yīng)，溶液由Au溶膠的酒紅色逐漸變?yōu)樽霞t色，說(shuō)明Au@AuPt納米粒子已形成。

進(jìn)一步的，所述步驟三中，采用差分脈沖伏安法考察蘆丁在修飾電極上的電化學(xué)行為，得到蘆丁濃度和氧化峰電流的線性擬合方程為：I_p＝6604.1c+8.2044，蘆丁的檢測(cè)限為0.3×10^-12M。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明一種基于硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料修飾電極測(cè)定蘆丁的方法，采用本方法制備化學(xué)修飾電極是一種快速而又簡(jiǎn)單的方法，檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、快速和成本低廉，可以有效、快速地對(duì)茶葉中的活性成分蘆丁進(jìn)行檢測(cè)，具有推廣應(yīng)用的價(jià)值。同時(shí)本發(fā)明方法可以省去實(shí)際樣品前處理的繁瑣過(guò)程，消除準(zhǔn)備的樣品、檢測(cè)樣品復(fù)雜、耗時(shí)的缺陷，整個(gè)檢測(cè)分析方法簡(jiǎn)單便捷，重現(xiàn)性好，分析測(cè)定靈敏度高，通過(guò)測(cè)定茶葉中的活性成分的含量，為云南省豐富茶產(chǎn)品在高尖端領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供研究依據(jù)，對(duì)研究茶產(chǎn)品茶葉中生理活性成分具有抗氧化、抗癌、抗突變、降血脂、降血壓、殺菌、消炎等多種保健功能和藥學(xué)機(jī)理的研究具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1是氧化石墨烯和硼摻雜石墨烯的XRD圖；

圖2為不同質(zhì)量比的硼摻雜石墨烯的XRD圖。

圖3是硼摻雜石墨烯的XPS圖。

圖4是硼摻雜石墨烯掃描電鏡圖。

圖5是Au和Au@AuPt納米粒子的XRD圖。

圖6為Au@AuPt納米粒子的掃描電鏡圖。

圖7硼摻雜石墨烯負(fù)載Au@AuPt納米復(fù)合材料的XRD圖。

圖8硼摻雜石墨烯負(fù)載Au@AuPt納米復(fù)合材料的掃描電鏡圖。

圖9是空白PBS溶液與含0.5μM/L蘆丁PBS溶液的循環(huán)伏安曲線。

圖10左圖為不同pH(1-7)的PBS中含0.5μM/L蘆丁的循環(huán)伏安曲線、右圖為蘆丁峰電流與pH的線性擬合圖。

圖11左圖為富集電位0.4V，富集不同時(shí)間(10s、50s、100s、200s、300s、350s、400s、450s、600s)后，蘆丁的循環(huán)伏安曲線，右圖不同時(shí)間富集后蘆丁氧化峰(b)、還原峰(a)電流與時(shí)間的曲線。

圖12左圖為不同電位(0.1-0.6V)富集蘆丁400s后，蘆丁的循環(huán)伏安曲線，右圖不同電位下富集蘆丁后的氧化峰(b)、還原峰(a)電流與富集電位的曲線。

圖13左圖蘆丁在不同掃描速度(10-600mV/s)下的循環(huán)伏安曲線，右圖為不同掃描速度的氧化峰(b)、還原峰(a)電流與掃描速度的線性擬合圖。

圖14左圖不同濃度蘆丁的差分脈沖伏安曲線，右圖不同濃度蘆丁的氧化峰電流與濃度的線性擬合圖。

圖15含0.5μM/L蘆丁PBS溶液連續(xù)掃描25圈的循環(huán)伏安曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)描述：

試驗(yàn)例：

1、硼摻雜石墨烯的制備

實(shí)驗(yàn)儀器與實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：圓底三頸燒瓶、攪拌器、離心機(jī)、真空抽濾泵，抽濾瓶、電子分析天平、移液槍、干燥箱、真空干燥箱、透射電子顯微鏡。高壓反應(yīng)釜，燒杯，超聲清洗儀。

實(shí)驗(yàn)試劑：石墨粉、冰、濃H₂SO₄、KMnO₄、30％H₂O₂、蒸餾水、三氧化二硼，氧化石墨烯。

氧化石墨烯的制備

根據(jù)Hummer經(jīng)典方法制備氧化石墨烯：冰浴條件下取92mL濃H₂SO₄于三頸燒瓶中，不斷攪拌下向燒瓶中加入2g石墨粉和2gNaNO₃固體混合物，再分次12g KMnO₄，充分?jǐn)嚢枋狗磻?yīng)物混合均勻。接著把混合液轉(zhuǎn)移到30℃～40℃的水浴中攪拌一個(gè)小時(shí)，形成灰褐色糊狀物。取出混合液在室溫下加入160mL蒸餾水，可觀察到溶液劇烈冒泡，接著升溫到85℃～95℃繼續(xù)攪拌30分鐘，再加水稀釋到560mL。最后緩慢分多次加入12mL 30％H₂O₂，溶液由深棕色變成亮黃色，將得到的產(chǎn)物趁熱過(guò)濾，用溫水清洗離心直到中性。

清洗具體步驟：

1.趁熱抽濾完成后加熱水將其充分溶解；

2.用離心機(jī)在3000r/d的轉(zhuǎn)速離心1min后棄去下層雜質(zhì)；

3.用離心機(jī)在8000r/d的轉(zhuǎn)速離心3min棄去上層物質(zhì)；

4.用離心機(jī)在10000r/d的轉(zhuǎn)速離心5min棄去上層物質(zhì)；

5.用離心機(jī)在13000r/d的轉(zhuǎn)速離心5min；清洗至接近中性，即制備得到氧化石墨烯。

硼摻雜石墨烯的制備

取5mL氧化石墨烯和30mL去蒸餾水，按照氧化石墨烯與三氧化二硼的質(zhì)量比為1:10、1:20、1:25、1:30稱取三氧化二硼，將所稱取的三氧化二硼溶于20mL蒸餾水中。將氧化石墨烯溶液、去蒸餾水、三氧化二硼溶液混合并超聲1h，倒入高壓反應(yīng)釜升溫到160℃后，反應(yīng)3h，冷卻后取出硼摻雜石墨烯超聲2h，即可得到分散均勻的硼摻雜石墨烯。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

圖1是氧化石墨烯和硼摻雜石墨烯的XRD圖，從圖中可以看出來(lái)氧化石墨烯在衍射角(2θ)為10.68°出現(xiàn)了一個(gè)衍射峰，而硼的摻入使得該衍射峰消失，同時(shí)在衍射角(2θ)為24.44°出現(xiàn)了一個(gè)衍射峰，說(shuō)明氧化石墨烯已經(jīng)被還原。

圖2為不同質(zhì)量比的硼摻雜石墨烯的XRD圖。將B₂O₃與氧化石墨烯以不同的質(zhì)量比混合反應(yīng)，可以得到含硼量不同的硼摻雜石墨烯。從圖2中可以看出來(lái)，當(dāng)B₂O₃與氧化石墨烯質(zhì)量比為1:25、1:30時(shí)，出現(xiàn)硼摻雜石墨烯的衍射峰的同時(shí)，B₂O₃的兩個(gè)衍射峰也隨之出現(xiàn)，說(shuō)明B₂O₃沒(méi)有完全反應(yīng)，有剩余，這是由于三氧化二硼加入量過(guò)多所致。而B₂O₃與氧化石墨烯質(zhì)量比為1:10、1:20只出現(xiàn)硼摻雜石墨烯的衍射峰，并沒(méi)有出現(xiàn)B₂O₃的衍射峰，所以B₂O₃與氧化石墨烯質(zhì)量比1:20是制備硼摻雜石墨烯的最佳質(zhì)量比。

圖3是硼摻雜石墨烯的XPS圖。用X射線光電子能譜(XPS)探測(cè)硼摻雜石墨烯的化學(xué)成分，從圖中可以看出，在298.48～279.68eV、545.48～528.68eV、196.48～180.68eV范圍內(nèi)出現(xiàn)了3個(gè)強(qiáng)峰，分別歸屬于C1s、O1s、B1s的特征峰，說(shuō)明硼摻雜石墨烯已成功制備。

圖4是硼摻雜石墨烯的掃描電鏡圖，硼摻雜石墨烯呈無(wú)序、半透明、褶皺狀，其中部分薄片層疊在一起，形成了多層結(jié)構(gòu)，這種邊緣卷曲褶皺形貌，是由于硼原子摻雜進(jìn)石墨烯晶格所造成的缺陷，使得石墨烯表面具有很多活性位點(diǎn)，因此硼摻雜石墨烯發(fā)生了部分團(tuán)聚。2、Au@AuPt納米粒子的制備

實(shí)驗(yàn)儀器與實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：圓底三頸燒瓶、冷凝回流管、磁力攪拌器、磁力攪拌子、容量瓶、電子天平、磁力攪拌子、移液槍、錐形瓶、燒杯、容量瓶、培養(yǎng)皿、移液槍、透射電子顯微鏡、紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)。

實(shí)驗(yàn)試劑：檸檬酸三鈉、氯金酸、蒸餾水、氯鉑酸，硼氫化鈉、蒸餾水。

金種子的制備

采用Frens’法制備納米金溶膠，將50mL 0.01wt％HAuCl₄溶液放入三頸燒瓶中，安裝好回流裝置，在攪拌下加熱至沸騰后，迅速加入3mL 38.8mM檸檬酸鈉溶液，溶液由紫色逐漸變?yōu)樗{(lán)色，最后成酒紅色，說(shuō)明氯金酸已經(jīng)被還原成納米金，繼續(xù)保持沸騰約30min，冷卻至室溫，即可制得金種子。

Au@AuPt納米粒子的制備

采用種子誘導(dǎo)法，將Au納米粒子作為種子，取一個(gè)錐形瓶，在冰浴條件下分別加入2mL的金溶膠，然后加入680μL 1mM氯金酸和680μL 1mM氯鉑酸，640μL蒸餾水，混合溶液在冰浴條件下攪拌至少2min，最后用微量注射器將660μL硼氫化鈉溶液(10mM)均勻、緩慢地滴入上述溶液中繼續(xù)反應(yīng)，溶液由Au溶膠的酒紅色逐漸變?yōu)樽霞t色，說(shuō)明Au@AuPt納米粒子已形成。

結(jié)果與討論

圖5是Au和Au@AuPt納米粒子的XRD圖，Au的納米粒子的衍射角(2θ)在38.20°、44.38°、64.62°和77.7°，分別屬于Au的納米粒子(111)、(200)、(220)和(311)晶面的衍射峰，說(shuō)明所制備的金納米粒子為面心立方結(jié)構(gòu)。將金鉑合金包裹金核表面，Au@AuPt納米粒子的衍射角(2θ)在38.36°、44.58°、64.74°和77.86°，相對(duì)于Au的納米粒子的衍射角(2θ)出現(xiàn)了右移，初步說(shuō)明Au@AuPt納米粒子已成功制備。

圖6為Au@AuPt納米粒子的掃描電鏡圖，在圖中的顆粒狀結(jié)構(gòu)的納米粒子即為Au@AuPt納米粒子，納米粒子基本呈球形，平均粒徑約為20nm。

3、基于硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料電化學(xué)傳感器檢測(cè)蘆丁

實(shí)驗(yàn)儀器與實(shí)驗(yàn)試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：燒杯、容量瓶、玻璃棒、移液槍、超聲清洗儀、玻璃板、電化學(xué)工作站、鉑電極、Ag/AgCl電極、洗瓶、玻碳電極、麂皮。

實(shí)驗(yàn)試劑：蒸餾水、三氧化二鋁納米拋光粉、鐵氰化鉀溶液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、茶葉。

硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料的制備

以硼摻雜石墨烯溶液：Au@AuPt納米粒子溶液體積比1:2將二者混合溶液置于燒杯中超聲3h，要求溫度不超過(guò)35℃，即可得到硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料。

圖7硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料的XRD圖，衍射角(2θ)為22.4°是硼摻雜石墨烯的衍射峰，在38.36°、44.58°、64.74°和77.86°出現(xiàn)了Au@AuPt納米粒子的衍射峰，說(shuō)明已經(jīng)成功制備硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料。

圖8硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料的掃描電鏡圖。硼摻雜石墨烯與Au@AuPt納米復(fù)合材料通過(guò)超聲分散后，Au@AuPt納米粒子較為均勻地嵌入到硼摻雜石墨烯片層中，由于Au@AuPt納米粒子的嵌入，硼摻雜石墨烯被剝離成了單層片狀結(jié)構(gòu)，一定程度上消除了硼摻雜石墨烯的團(tuán)聚。

3、硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料修飾玻碳電極(BG/Au@AuPt/GCE)的制備

先將玻碳電極依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的Al₂O₃溶液在麂皮上拋光成鏡面，然后分別用1.0M HNO₃溶液，無(wú)水乙醇和二次水中超聲清洗，最后用高純氮?dú)獯蹈桑?0mL 1M鐵氰化鉀溶液中用循環(huán)伏安法檢測(cè)，氧化還原峰電勢(shì)差不超過(guò)80mV。若超過(guò)重復(fù)上述步驟，直至不超過(guò)80mV為止。最后用移液槍取10μL制備好的硼摻雜石墨烯負(fù)載Au@AuPt納米復(fù)合材料滴涂在玻碳電極表面，晾干保存?zhèn)溆谩?/p>

修飾電極對(duì)蘆丁的電化學(xué)行為

配置0.01mM蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣，pH范圍在3～5的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，取10mL PBS于檢測(cè)瓶?jī)?nèi)，加入500μL 0.01mM蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣，掃描范圍為0-0.8V，掃描速度為50mV/s。

圖9是空白的PBS溶液與含0.5μM/L蘆丁PBS溶液的循環(huán)伏安曲線。對(duì)于空白的PBS溶液沒(méi)有氧化還原峰出現(xiàn)，而加入0.5μM/L蘆丁后，出現(xiàn)了明顯的氧化還原峰，說(shuō)明BG/Au@AuPt/GCE對(duì)蘆丁有良好的響應(yīng)。蘆丁在修飾電極上電氧化機(jī)理可表述為：蘆丁先失去一個(gè)質(zhì)子形成一價(jià)陰離子，然后一價(jià)陰離子被氧化為陰離子自由基，陰離子自由基進(jìn)一步經(jīng)歷一個(gè)可逆的氧化過(guò)程被氧化為去氫蘆丁。

圖10蘆丁在不同修飾電極GCE(a)、BG/GCE(b)、BG/Au@AuPt/GCE(c)上的循環(huán)伏安曲線。從圖中看出，裸電極測(cè)蘆丁時(shí)，沒(méi)有出現(xiàn)氧化還原峰，說(shuō)明裸電極對(duì)蘆丁沒(méi)有響應(yīng)；而BG/GCE檢測(cè)蘆丁時(shí)，則有了明顯的氧化還原峰，當(dāng)把Au@AuPt納米粒子嵌入到硼摻雜石墨烯后，蘆丁在BG/Au@AuPt/GCE上的氧化還原峰進(jìn)一步增大，說(shuō)明Au@AuPt納米粒子嵌入到硼摻雜石墨烯片層結(jié)構(gòu)間，進(jìn)一步將硼摻雜石墨烯剝離為單層或幾層的片層結(jié)構(gòu)，同時(shí)硼摻雜的點(diǎn)缺陷石墨烯增強(qiáng)了Au@AuPt核殼型納米粒子在其表面的附著作用力，消除了納米粒子易聚集失活的缺陷，獲得的BG/Au@AuPt電極界面修飾材料是檢測(cè)蘆丁的極佳材料。

不同pH對(duì)檢測(cè)蘆丁的影響

圖11左圖為pH＝1-7的PBS中含0.5μM/L蘆丁的循環(huán)伏安曲線。隨著pH的逐漸增大，氧化還原峰電流也逐漸增大，峰電位左移。當(dāng)pH為4時(shí)，峰電流最大，隨之峰電流卻逐漸減小。由此可得出檢測(cè)蘆丁的最佳pH值為4。

不同富集時(shí)間對(duì)檢測(cè)蘆丁的影響

蘆丁對(duì)電極主要是受吸附控制，一是時(shí)間對(duì)吸附的影響；二是電勢(shì)對(duì)吸附的影響。因此在用循環(huán)伏安法測(cè)定蘆丁之前要進(jìn)行富集，將PBS緩沖溶液里的蘆丁盡量富集到電極表面，減少測(cè)定過(guò)程中的的誤差。圖12(左圖)為富集電位為0.4V時(shí)，富集不同時(shí)間(10-600s)后蘆丁的循環(huán)伏安曲線，(右圖)為不同富集時(shí)間后蘆丁的氧化峰(b)、還原峰(a)電流與時(shí)間的曲線。隨著富集時(shí)間不斷變長(zhǎng)，氧化還原峰電流逐漸增大，當(dāng)富集時(shí)間到達(dá)400s時(shí)，峰電流最大，之后便呈下降趨勢(shì)，因此，蘆丁的最佳富集時(shí)間為400s。

不同富集電勢(shì)對(duì)檢測(cè)蘆丁的影響

圖13左圖為不同富集電位(0.1-0.6V)下富集400s后蘆丁的循環(huán)伏安曲線，右圖為不同電位富集400s后蘆丁的氧化峰(b)、還原峰(a)電流與富集電位的曲線。隨著富集電位的不斷增大，氧化還原峰電流逐漸變大，直到富集電位為0.4V時(shí)，氧化還原峰電流最大，之后便呈下降趨勢(shì)，因此，蘆丁的最佳富集電勢(shì)為0.4V。

掃描速度對(duì)蘆丁電化學(xué)行為的影響

圖14左圖蘆丁在不同掃描速度(10-600mV/s)下的循環(huán)伏安曲線，右圖蘆丁的不同掃描速度下蘆丁的氧化峰(b)、還原峰(a)電流與掃速的線性擬合圖。左圖中，掃描速度從10mV/s增加到600mV/s，氧化峰電流隨掃描速度的增大而增大；在10～600mV/s掃描范圍內(nèi)，氧化峰、還原峰電I_p與掃描速度υ成線性關(guān)系，氧化峰電流線性回歸方程為I_p＝0.0542υ-5.4432，R²＝0.9904，還原峰電流電流線性回歸方程為I_p＝0.0382υ+3.8547，R²＝0.9905，說(shuō)明蘆丁在該掃描速度范圍內(nèi)為吸附控制。

差分脈沖伏安法檢測(cè)蘆丁

圖15左圖為不同濃度蘆丁的差分脈沖伏安曲線，右圖為不同濃度蘆丁的氧化峰電流與濃度的線性擬合圖。即保持PBS底液不變，加入不同量的蘆丁，可以得到不同濃度蘆丁的的峰電流，根據(jù)峰電流與蘆丁濃度的關(guān)系得出其線性回歸方程為I_p＝6604.1c+8.2044，R²＝0.9955，檢測(cè)限為：4×10^-12M。

修飾電極的穩(wěn)定性

用循環(huán)伏安法對(duì)蘆丁掃描的過(guò)程中，所有的參數(shù)不變，對(duì)含0.5μM/L蘆丁的PBS溶液連續(xù)掃描25圈，隨著掃描圈數(shù)的增加，蘆丁的氧化還原峰出峰位置、峰電流大小基本都不變，循環(huán)伏安曲線基本重疊，說(shuō)明硼摻雜石墨烯負(fù)載金核金鉑合金殼納米復(fù)合材料能很好地固定在電極上并保持良好的催化活性，具有較高的穩(wěn)定性。

修飾電極對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)

稱取0.05g紅茶放入燒杯中備用。量取50mL蒸餾水加熱到80℃倒入裝有紅茶的燒杯加熱煮沸10min，放置至室溫，過(guò)濾。量取一定的茶水，稀釋100倍后保存用作測(cè)定實(shí)際樣品用。首先測(cè)定茶水原液，然后進(jìn)行加標(biāo)回收。用同樣的方法平行測(cè)定3次，得出蘆丁的回收率89.26-99.17％，滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)。

總結(jié)

通過(guò)超聲技術(shù)Au@AuPt納米粒子嵌入到硼摻雜石墨烯片層間，得到硼摻雜石墨烯負(fù)載Au@AuPt納米復(fù)合材料。由于Au@AuPt納米粒子的嵌入，將硼摻雜石墨烯剝離成層數(shù)較少的結(jié)構(gòu)，從一定程度消除硼摻雜石墨烯發(fā)生團(tuán)聚的影響。同時(shí)也提高Au@AuPt納米粒子穩(wěn)定性和催化性，且Au@AuPt納米粒子牢固地附著在石墨烯片層間。

構(gòu)建基于硼摻雜石墨烯負(fù)載Au@AuPt核殼納米復(fù)合材料的電化學(xué)傳感器，通過(guò)對(duì)PBS緩沖溶液的pH的優(yōu)化得出pH＝4時(shí)，蘆丁的氧化還原峰電流最大，故該pH為測(cè)定蘆丁的最佳pH。不同的富集時(shí)間與不同的富集電位對(duì)檢測(cè)蘆丁有較大的影響，考察不同的富集時(shí)間和富集電位，可以得出最佳富集時(shí)間為400s，最佳富集電勢(shì)為0.4V。通過(guò)考察掃描速度對(duì)蘆丁電化學(xué)行為的影響，得出修飾電極對(duì)蘆丁主要是吸附控制。在最佳pH、富集時(shí)間、富集電位條件下對(duì)蘆丁進(jìn)行差分脈沖伏安法檢測(cè)，得到蘆丁濃度和氧化峰電流線性擬合方程：I_p＝6604.1c+8.2044，蘆丁的檢測(cè)限為0.3×10^-12M。在最優(yōu)的檢測(cè)條件下，對(duì)蘆丁進(jìn)行連續(xù)25圈的循環(huán)伏安掃描，可得出該電極具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性。最后將修飾電極用于蘆丁實(shí)際樣品的檢測(cè)，得出BG/Au@AuPt/GCE對(duì)茶葉中蘆丁有良好響應(yīng)，可用于對(duì)實(shí)際樣品蘆丁的檢測(cè)。

本發(fā)明的工作原理為：

本發(fā)明以Hummers法制備氧化石墨烯；再通過(guò)水熱法制備硼摻雜石墨烯；利用種子生長(zhǎng)法制備金種子；采用種子誘導(dǎo)法，以硼氫化鈉為還原劑將HAuCl₄和H₂PtCl₆還原在金種子表面，制備得到Au@AuPt納米粒子；引入比表面積大的硼摻雜石墨稀作為載體，負(fù)載Au@AuPt核殼納米粒子，獲得硼摻雜石墨烯負(fù)載Au@AuPt納米復(fù)合材料；最后用所制備的新型納米復(fù)合材料修飾玻碳電極來(lái)檢測(cè)蘆丁。

1、以Hummers法制備氧化石墨烯；再通過(guò)水熱法制備硼摻雜石墨烯；從氧化石墨烯與硼摻雜石墨烯的XRD圖可知，硼摻雜石墨烯相對(duì)于氧化石墨烯在衍射角(2θ)24.44°出現(xiàn)硼摻雜石墨烯衍射峰，說(shuō)明選擇三氧化二硼作為制備硼摻雜石墨烯的還原劑和硼源是可行的。另外，實(shí)驗(yàn)得出B₂O₃與氧化石墨烯的質(zhì)量比為1:20是制備硼摻雜石墨烯的最佳質(zhì)量比。由硼摻雜石墨烯的XPS圖可以看出，在284.3eV、533.11eV、193.45eV處出現(xiàn)了C1s、O1s、B1s的特征峰，說(shuō)明已成功制備出硼摻雜石墨烯。

2、采用Frens’法制備納米金種子，在金種子溶液里加入HAuCl₄和H₂PtCl₆，以硼氫化鈉為還原劑使其還原在金種子表面，制備得到Au@AuPt納米粒子。通過(guò)Au@AuPt粒子的XRD圖，可看出Au的納米粒子的衍射角(2θ)在38.20°、44.38°、64.62°和77.7°，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Pt納米粒子的衍射角(2θ)在39.76°、46.24°、67.46°和81.29°，將金鉑合金包裹金核表面后，Au@AuPt納米粒子的衍射角(2θ)在38.36°、44.58°、64.74°和77.86°，相對(duì)于Au的納米粒子的衍射角(2θ)出現(xiàn)右移，說(shuō)明金核金鉑合金殼納米粒子已合成成功。由掃描電鏡圖可知Au@AuPt粒子的平均粒徑約為20nm。

3、通過(guò)將硼摻雜石墨烯和Au@AuPt納米材料以1:2比例混合超聲得到硼摻雜石墨烯負(fù)載Au@AuPt納米復(fù)合材料。由XRD圖得出該納米復(fù)合材料的衍射角(2θ)為39.76°、46.24°、67.46°和81.29°，24.44°，同時(shí)出現(xiàn)了Au@AuPt核殼納米粒子、硼摻雜石墨烯的衍射征峰；由掃描電鏡圖可看出，納米材料的嵌入將石墨烯剝離成了單層或多層的片狀結(jié)構(gòu)，一定程度上消除了硼摻雜石墨烯的團(tuán)聚，同時(shí)核殼納米材料也牢固地附著在石墨烯片層間。

4、硼摻雜石墨烯負(fù)載Au@AuPt納米復(fù)合材料電化學(xué)傳感器對(duì)蘆丁的檢測(cè)，通過(guò)優(yōu)化PBS溶液的pH值，得出測(cè)定蘆丁的最佳pH為4。不同的富集時(shí)間與不同的富集電位對(duì)檢測(cè)蘆丁有較大的影響，根據(jù)富集時(shí)間和富集電位的不同，可以得出最佳富集時(shí)間為400s，最佳富集電位為0.4V。通過(guò)考察不同掃描速度對(duì)蘆丁電化學(xué)行為的影響，得到掃描速度與氧化、還原峰電流的線性擬合方程，說(shuō)明蘆丁在修飾電極表面主要是吸附控制。在最佳pH、富集時(shí)間、富集電位條件下采用差分脈沖伏安法對(duì)蘆丁進(jìn)行檢測(cè)，得到蘆丁濃度和氧化峰電流的線性擬合方程：I_p＝6604.1c+8.2044，蘆丁的檢測(cè)限為0.3×10^-12M。在最佳檢測(cè)條件下，對(duì)蘆丁進(jìn)行連續(xù)25圈的循環(huán)伏安掃描，得出修飾電極具有良好的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性。最后通過(guò)加標(biāo)回收法對(duì)茶葉中的蘆丁進(jìn)行檢測(cè)，可得出BG/Au@AuPt/GCE對(duì)茶葉中的蘆丁有良好的響應(yīng)，可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何不經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性勞動(dòng)想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所限定的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。